一种

一种
‘
秋月梨’愈伤组织的诱导方法及应用方法
技术领域
1.本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种
‘
秋月梨’花药愈伤的诱导方法及应用。


背景技术：

2.‘
秋月梨’为蔷薇科梨属栽培品种，是用162-29（新高
×
丰水）
×
幸水杂交育成的中晚熟褐色砂梨新品种。
‘
秋月梨’抗寒力强，耐干旱；果实略呈扁形，果形端正，果皮黄褐色，果肉乳白色，果核小，可食率95%以上。其肉质细脆，汁多味甜，清香爽口，石细胞极少，品质极优，具有研究价值。同时，在植物分子遗传研究中，构建愈伤组织再生系统相较于其他再生方式，试材更易于接受外源基因、转化率高、扩繁量大。但是在获取
‘
秋月梨’愈伤组织的过程中，发现利用茎、叶等外植体诱导时，会出现褐变现象而难以成功诱导出愈伤组织，因此，针对
‘
秋月梨’这种新品种，如何获取其愈伤组织以便进行更有效的研究和应用，是本领域急需解决的技术问题。


技术实现要素：

3.本发明的目的之一是提供一种
‘
秋月梨’愈伤组织的诱导方法，该方法采用
‘
秋月梨’的花药为外植体在特定培养基中进行诱导和增殖，顺利得到了
‘
秋月梨’的花药愈伤组织。
4.为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：一种
‘
秋月梨’愈伤组织的诱导方法，包括如下步骤：步骤s10：采集
‘
秋月梨’的花蕾，在3~5℃下放置3~5天；步骤s20：将放置后的所述花蕾清洗和消毒，然后将花蕾中的花药取出，接种到诱导培养基上暗培养30~50天，获得花药愈伤组织，所述诱导培养基为：1/2ms 19~21 g/l蔗糖 1.3~1.7 mg/l 2,4-d 0.8~1.2 mg/l 6-ba 6~8 g/l琼脂，ph 5.8~6.2；步骤s30：将诱导出的花药愈伤组织接种增殖培养基中进行增殖培养，从而获得愈伤组织，所述增殖培养基为：1/2ms 19~21 g/l蔗糖 0.8~1.2 mg/l 2,4-d 0.8~1.2 mg/l 6-ba 6~8 g/l琼脂，ph 5.8~6.2。
5.优选的，所述诱导培养基为1/2ms 20 g/l蔗糖 1.5 mg/l 2,4-d 1.0 mg/l 6-ba 7 g/l琼脂，ph 5.8~6.2；所述增殖培养基为1/2ms 20 g/l蔗糖 1.0 mg/l 2,4-d 1.0 mg/l 6-ba 7 g/l琼脂，ph 5.8~6.2。
6.优选的，在步骤s20中，所述清洗为用无菌水洗3~5遍，去掉花蕾表面的灰尘；所述消毒为使用质量分数75％的酒精浸泡清洗后的花蕾30 s，然后再用质量分数0.1％hgcl2处理8~10 min，无菌水清洗3~5次后用无菌滤纸吸干花蕾表面水分。
7.优选的，在步骤s20中，所述暗培养的温度为25
±
2℃。
8.优选的，在步骤s30中，所述增殖培养在暗环境中进行，培养温度为25
±
2℃，每30~40天进行一次继代。
5.8~6.2。培养40天后进行一次继代，继续培养40天获得新的愈伤组织（图4）。
24.使用携带外源基因（商业化载体pegfp）的根癌农杆菌的重悬液浸泡愈伤组织并微微摇晃；浸泡侵染时间10 min，重悬液中乙酰丁香酮（as）工作浓度200 μmol/l。侵染处理后的愈伤组织接种到共培养培养基中25
±
2℃暗培养3天（图5）。共培养培养基为：1/2ms 20 g/l蔗糖 1.0 mg/l 2 ,4-d 1.0 mg/l 6-ba 7 g/l琼脂，ph 5.8~6.2。
25.共培养结束后使用脱菌液洗涤2次，无菌水洗涤3次，在无菌滤纸上吸干水分后转移到筛选培养基中筛选（图6），得到抗性愈伤组织。脱菌液为：1/2ms 20 g/l蔗糖 300 mg/l头孢霉素。筛选培养基为：1/2ms 20 g/l蔗糖 1.0 mg/l 2 ,4-d 1.0 mg/l 6-ba 300 mg/l头孢霉素 6 mg/l潮霉素 7 g/l琼脂。
26.本实施例只是对本发明构思和实现的说明，并非对其进行限制，在本发明构思下，未经实质变换的技术方案仍然在保护范围内。


技术特征：
1.一种
‘
秋月梨’愈伤组织的诱导方法，其特征在于包括如下步骤：步骤s10：采集
‘
秋月梨’的花蕾，在3~5℃下放置3~5天；步骤s20：将放置后的所述花蕾清洗和消毒，然后将花蕾中的花药取出，接种到诱导培养基上暗培养30~50天，获得花药愈伤组织，所述诱导培养基为：1/2ms 19~21 g/l蔗糖 1.3~1.7 mg/l 2,4-d 0.8~1.2 mg/l 6-ba 6~8 g/l琼脂，ph 5.8~6.2；步骤s30：将诱导出的花药愈伤组织接种增殖培养基中进行增殖培养，从而获得愈伤组织，所述增殖培养基为：1/2ms 19~21 g/l蔗糖 0.8~1.2 mg/l 2,4-d 0.8~1.2 mg/l 6-ba 6~8 g/l琼脂，ph 5.8~6.2。2.如权利要求1所述的
‘
秋月梨’愈伤组织的诱导方法，其特征在于，所述诱导培养基为1/2ms 20 g/l蔗糖 1.5 mg/l 2,4-d 1.0 mg/l 6-ba 7 g/l琼脂，ph 5.8~6.2；所述增殖培养基为1/2ms 20 g/l蔗糖 1.0 mg/l 2,4-d 1.0 mg/l 6-ba 7 g/l琼脂，ph 5.8~6.2。3.如权利要求1所述的
‘
秋月梨’愈伤组织的诱导方法，其特征在于，在所述步骤s20中，所述清洗为用无菌水洗3~5遍，去掉花蕾表面的灰尘；所述消毒为使用质量分数75％的酒精浸泡清洗后的花蕾30 s，然后再用质量分数0.1％hgcl2处理8~10 min，无菌水清洗3~5次后用无菌滤纸吸干花蕾表面水分。4.如权利要求1所述的
‘
秋月梨’愈伤组织的诱导方法，其特征在于，在步骤s20中，所述暗培养的温度为25
±
2℃。5.如权利要求1所述的
‘
秋月梨’愈伤组织的诱导方法，其特征在于，在所述步骤s30中，所述增殖培养在暗环境中进行，培养温度为25
±
2℃，每30~40天进行一次继代。6.一种
‘
秋月梨’愈伤组织的应用方法，其特征在于包括如下步骤：步骤s40：使用携带外源基因的根癌农杆菌转化愈伤组织，然后接种到共培养基中暗培养3天；所述愈伤组织通过如权利要求1至5任一项所述的
‘
秋月梨’愈伤组织的诱导方法获得，所述共培养培养基为：1/2ms 20 g/l蔗糖 1.0 mg/l 2 ,4-d 1.0 mg/l 6-ba 7 g/l琼脂，ph 5.8~6.2；步骤s50：步骤s40的暗培养结束后使用脱菌液洗涤2~3次，无菌水洗涤3~5次，在无菌滤纸上吸干水分后转移到筛选培养基中筛选，得到抗性愈伤组织，所述脱菌液为：1/2ms 20 g/l蔗糖 300 mg/l头孢霉素。7.如权利要求6所述的
‘
秋月梨’愈伤组织的应用方法，其特征在于，所述步骤s40中所述转化的条件为：使用携带外源基因的根癌农杆菌的重悬液浸泡所述愈伤组织并摇晃侵染8~10 min，重悬液中乙酰丁香酮as工作浓度为200 μmol/l。8.如权利要求6所述的
‘
秋月梨’愈伤组织的应用方法，其特征在于，所述步骤s40中所述暗培养的温度为25
±
2℃。9.如权利要求6所述的
‘
秋月梨’愈伤组织的应用方法，其特征在于，所述步骤s50中，所述筛选培养基为：1/2ms 20 g/l蔗糖 7 g/l琼脂 1.0 mg/l2 ,4-d 1.0 mg/l 6-ba 300 mg/l头孢霉素 6 mg/l潮霉素。

技术总结
本发明公开了一种


技术研发人员：石海燕 徐悦 霍利月 李晓娜 杨雄
受保护的技术使用者：河北农业大学
技术研发日：2022.04.14
技术公布日：2022/5/25