拟杆菌Bacteroidescaecimuris在制备治疗肝损伤药物中的应用

拟杆菌bacteroides caecimuris在制备治疗肝损伤药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物制药技术领域，具体涉及一种拟杆菌bacteroides caecimuris，它能够改善四氯化碳(ccl4)造成的肝损伤。


背景技术：

2.肝损伤的研究现状
3.肝脏是体内重要的实质性器官，负担人体的重要生理功能。目前，各种原因导致的肝损伤已成为威胁人类健康的常见疾病之一。常见的肝损伤原因包括：化学性肝损伤、免疫性肝损伤、酒精性肝损伤、药物性肝损伤等等。各种肝损伤的发病原因和机制各有不同，但都是对肝脏组织和肝细胞造成了难以逆转的损害，严重的时候肝功能极度受损，会危及生命。
4.化学性肝损伤常见的有一些化学毒物，例如ccl4、d-氨基半乳糖、亚硝胺等引起。这些化学毒物可以蓄积在肝组织中，促进肝脏部位产生大量炎症因子，导致炎症反应持续进行，增加肝脏星形胶质细胞的激活，产生肝纤维化与肝细胞坏死。
5.免疫性肝损伤常见于自身免疫性肝炎以及病毒性肝炎免疫性肝损害的病人体内。免疫性肝损伤的主要参与细胞是cd4 t细胞与自然杀伤t细胞。这些免疫细胞在病人体内大量活化，释放大量致炎细胞因子，进一步激活体内的其它炎症细胞，如单核细胞、kupffer细胞等等，最终在肝脏部位造成过度激活的炎症反应，损伤肝实质细胞。
6.酒精性肝损伤是由于过量长期过量饮酒导致。乙醇进入体内，主要的代谢途径是在肝脏内将乙醇转变为乙醛，再使乙醛转化为乙酸，进行代谢。乙醛可诱导肝脏发生氧化应激，损害线粒体和微管，可以诱导肝细胞发生凋亡或坏死。
7.药物性肝损伤常见于对乙酰氨基酚、利福平、异烟肼等临床常用药，在病人体内引发的肝脏转氨酶升高，肝组织炎症坏死等。主要是由于这些药物在肝细胞中激活了线粒体氧化应激，导致钙稳态失衡，增加了促炎信号而抑制了抗炎信号，最终导致肝细胞坏死。
8.肝损伤的治疗
9.虽然上述肝损伤的产生原因各不相同，但它们都有一些一致的病理现象，包括ast、alt转氨酶升高，肝组织产生大量炎症因子，肝细胞变性、凋亡或坏死等等。这些病理现象在各种肝损伤中都很常见，因此，临床上治疗肝损伤也大都使用的是降低转氨酶、降低炎症的相关药物。但由于这些抗肝损伤的药物也绝大部分是经由肝脏代谢的，这对于已经发生肝损伤的病人来说，无疑加重了他们的肝脏负担，让本就损伤的肝脏不堪重负，并且目前临床上使用的抗肝损伤药物的使用时间都比较长，有可能保护性作用还未发挥就会带来新的副作用，加剧肝脏损伤，因此需要寻找新的治疗方式和手段，来改善肝损伤。
10.肠道菌群在肝损伤治疗中的应用前景
11.肝脏具有肝动脉和肝静脉的两重血供。其中，肝门静脉系统主要接收肠道血液并汇聚至肝脏，从而使得肠道与肝脏之间存在密切联系，形成肝肠循环，例如胆盐就是通过肝
肠循环，从小肠回到肝脏再利用的。近年来，随着肝肠轴的不断深入研究，发现肠道菌群在慢性肝功能损伤的过程中发挥了重要的作用。菌群是机体的重要组成部分，菌群的过度生长、菌群异位、肠粘膜通透性增加以及免疫功能受损都能对肝功能产生影响。
12.益生菌的概念是1965年提出的，其作用是促进有益菌繁殖、抑制致病菌生长，维持肠道菌群平衡，有益于人体健康。目前，不少益生菌已广泛应用于胃肠疾病的临床治疗，效果显著。常见益生菌有乳杆菌(lactobacillus)、双歧杆菌(bifidobacterium)、嗜酸杆菌(acidophilus)等。除此之外，益生菌还可发挥免疫调节的作用。乳杆菌和双歧杆菌是益生菌中重要的抗炎菌，已证明lactobacillus casei可通过增加机体抑炎细胞因子(如il-10、tgf-β)，抑制促炎细胞因子(如il-1β、il-2、il-6、il-12、il-17)缓解大鼠类风湿关节炎；lactobacillus plantarum lc27和bifidobacterium longum lc67均可通过抑制核因子-κb(nuclear factor κb，nf-κb)炎性通路抑制炎症反应；lactobacillus casei可促使cd4

t分化为调节性t细胞(regulatory t cell，treg)而抑制其分化为th17细胞，并增强treg细胞功能、抑制th17功能，通过免疫调节缓解自身免疫性疾病。
13.最近有研究结果显示，拟杆菌bacteroides acidifaciens能够减少肝细胞内的脂滴蓄积，改善胰岛素抵抗，具有减肥的作用。因此拟杆菌bacteroides acidifaciens可能是体内的益生菌。而拟杆菌的其它菌株对上述各类型的肝损伤是否具有保护作用目前还不得而知。鉴于不少菌群已经在临床上成功应用的先例，后续开发治疗肝损伤的有益菌群，前景可观。并且，菌群不直接进入体内而是通过代谢产物发挥效应，因此可以避免加重受损肝脏的负担。
14.我们前期的工作结果显示，肝损伤的小鼠粪便中各类菌群的成分发生了明显改变，通过测序证实，bacteroides caecimuris在肝损伤的粪便中表达较高。bacteroides caecimuris在各类型肝损伤中的作用尚未见报道。因此，本发明旨在进一步明确bacteroides caecimuris在制备治疗肝损伤药物中的应用。


技术实现要素：

15.针对上述情况，本发明提供了一种拟杆菌bacteroides caecimuris，能够显著改善ccl4介导的肝脏急性损伤，保护肝细胞膜完整性，降低血清转氨酶，改善肝脏组织内部的炎症反应以及细胞损伤等等。
16.本发明的技术方案是拟杆菌bacteroides caecimuris在制备治疗肝损伤中的应用。
17.进一步的，所述bacteroides caecimuris用于治疗肝损伤导致的转氨酶升高。
18.进一步的，所述bacteroides caecimuris用于改善肝损伤导致的肝脏炎症。
19.进一步的，所述bacteroides caecimuris用于治疗肝损伤导致的肝细胞变性坏死等。
20.本发明的目的在于探索bacteroides caecimuris作为保护肝细胞损伤，减轻肝脏炎症的有效药物在化学性肝损伤、药物性肝损伤、免疫性肝损伤等肝脏疾病中的功能与应用。
21.前期工作中，我们首次证实在肝损伤的小鼠模型中，粪便中的菌群组分发生了显著改变，进一步分析发现其中的bacteroides caecimuris菌表达显著增高。进而我们购买
了bacteroides caecimuris菌株，进行扩增，并在ccl4肝损伤模型小鼠中灌胃给予bacteroides caecimuris菌。观察到bacteroides caecimuris灌胃的小鼠，血清中alt和ast明显下降，肝脏组织中的炎症因子水平(il-1β和tnf-α)也显著降低，组织学评分显示，给予bacteroides caecimuris能够明显改善ccl4造成的肝脏细胞变性坏死等损伤。并且，我们也检测了灌胃之后，粪便中的bacteroides caecimuris菌确实有显著升高，同时也佐证了bacteroides caecimuris确实在体内发挥保肝效应。这些研究说明，本发明的有益效果是bacteroides caecimuris能够作为潜在的治疗肝损伤的有益菌药物继续开发应用。
附图说明
22.图1.是本发明bacteroides caecimuris在制备治疗肝损伤药物中应用的流程图
23.图2.是本发明中bacteroides caecimuris降低ccl4致小鼠血清转氨酶升高的对比图。(a)alt；(b)ast。
24.图3.是本发明中bacteroides caecimuris抑制ccl4致小鼠肝脏炎症因子表达的对比图。(a)il-1β；(b)tnf-α。
25.图4.是本发明中bacteroides caecimuris改善ccl4致小鼠肝脏组织损伤的统计图。
26.图5.是本发明中bacteroides caecimuris灌胃给予小鼠之后，粪便中检测到的bacteroides caecimuris量。
具体实施方式
27.为了更清楚地说明本发明的技术方案，下面结合附图对本发明的技术方案做进一步的详细说明：
28.本发明的技术方案是拟杆菌bacteroides caecimuris在制备治疗肝损伤中的应用。
29.进一步的，所述bacteroides caecimuris用于治疗肝损伤导致的转氨酶升高。
30.进一步的，所述bacteroides caecimuris用于改善肝损伤导致的肝脏炎症。
31.进一步的，所述bacteroides caecimuris用于治疗肝损伤导致的肝细胞变性坏死等。
32.具体实施例：
33.如图1-5所述，其中，图1是拟杆菌bacteroides caecimuris治疗肝损伤的操作流程示意图。图2是本发明中使用bacteroides caecimuris缓解ccl4所致的肝脏转氨酶升高(alt、ast)的示意图。选取6-8周龄的c57bl/6雄鼠，灌胃给予bacteroides caecimuris，(每天一次，连续灌胃1周)，之后腹腔注射0.2％ccl4溶液建立ccl4肝损伤模型，24小时后收取小鼠血样和肝组织。(a)、空白组、模型组和给药组小鼠血清的alt；(b)、空白组、模型组和给药组小鼠血清的ast。图3是本发明中bacteroides caecimuris改善ccl4所致的肝脏炎症反应。小鼠的处理方式与图2相同，收取各组的肝脏组织，进行是是荧光定量pcr检测。(a)il-1β；(b)tnf-α。图2和图3的数据以平均值
±
sd表示，每组10只小鼠。#p＜0.05对比正常组，
＊
p＜0.05，
＊＊
p＜0.01，
＊＊＊
p＜0.001对比ccl4组。图4是本发明中bacteroides caecimuris改善ccl4致小鼠肝脏组织损伤的统计图。小鼠的处理方式同前，收取各组肝脏组织，用福尔马
林固定，制备石蜡切片，进行苏木素-伊红染色。然后根据文献报道，观察各组小鼠肝脏的不同视野下，肝细胞变性坏死和炎细胞浸润的程度，按照下述标准进行打分统计：0，表示没有肝细胞变性坏死，没有炎细胞浸润；1，表示仅有少量肝细胞发生坏死，有较少的炎细胞浸润；2，表示肝细胞坏死的数量较多，同时伴随明显的炎细胞浸润；3，表示肝细胞严重变性坏死，同时伴随大量炎细胞浸润。#p＜0.05对比正常组，
＊
p＜0.05，
＊＊
p＜0.01，
＊＊＊
p＜0.001对比ccl4组。
34.以下通过具体实施方式对发明内容做进一步详细说明：
35.实施例1、bacteroides caecimuris的扩增
36.拟杆菌bacteroides caecimuris购买于德国dsmz公司。培养基配制：称取44g哥伦比亚血琼脂(iso)，加1000ml去离子水重悬。边加热边搅动，煮沸1min，使其完全溶解。121℃高温蒸汽灭菌15min。待冷却至50℃左右时，加入50ml脱纤维羊血，混匀后倒平板。配制好的培养基应4℃冰箱避光保存。
37.冻干粉复苏实验步骤：
38.(1).新买来的菌粉，记录其菌株编号，提前将安剖瓶在75％酒精中浸泡10min；
39.(2)在细菌超净台里面然后将脱脂棉将安剖瓶外酒精擦拭干净，待其自然风干后，砂轮在安剖瓶口划一条线，至酒精灯外焰处加热，用移液枪吸取蒸馏水滴至划线处，掰开安剖瓶(或者用砂轮在安剖瓶口来回划动几次，然后用镊子将其敲碎)。
40.(3)镊子经由酒精灯外焰灼烧灭菌，用镊子将脱脂棉取出，再将里面的玻璃管用镊子夹出，吸取0.5ml无菌水注入被启开的菌种瓶中并吹打，使瓶中的冻干菌种溶解成菌悬液。将上述菌悬液吸出，接种到三个哥伦比亚血琼脂上，然后将培养基放进厌氧袋中，加入厌氧包和厌氧指示剂。放置在37℃细菌培养箱培养18～24h。次日取出培养物，仔细观察菌种形态、有无杂菌生长。菌种未生长，继续培养至72h。若无异常，传代后使用。
41.实施例2、ccl4模型的建立以及bacteroides caecimuris灌胃给药：
42.(1)、动物准备：一般选取6-8周龄的c57bl/6雄鼠。随机分为：对照组、ccl4模型组、ccl4 bacteroides caecimuris给药组。每组10只小鼠。
43.(2)、给药组小鼠于造模一周前开始每天灌胃给予bacteroides caecimuris，每只小鼠的灌胃浓度为1
×
108cfu/100ul；对照组和ccl4模型组分别进行等体积生理盐水灌胃。
44.(3)、灌胃一周后，ccl4模型组和ccl4 bacteroides caecimuris给药组小鼠按照10ml/kg进行腹腔注射0.2％的ccl4溶液，造肝损伤模型；对照组腹腔注射等体积生理盐水。24小时后，收取各组小鼠的血清、肝脏和粪便进行后续检测
45.实施例3、alt、ast检测：
46.将实验各组小鼠进行摘眼球取血，注意采血过程中要预防溶血现象。每只小鼠约取500μl的血液，采集的血液静置于ep管中，待上层血清析出后，用移液枪将上层血清采集到新的ep管中，用于后续实验的检测。
47.购买alt、ast检测试剂盒，按照说明书步骤检测：首先将各个试剂放于室温稳定，然后设置测试孔和对照孔，每孔加入20μl 37℃预温好的基质液，5μl血清样品加入测试孔，混匀后37℃空气浴30min；每孔加入20μl显色液，混匀后37℃空气浴20min；每孔加入终止液200μl，轻轻水平摇动96孔板，室温静置15min，波长510nm，酶标仪测定各孔od值，根据计算公式计算它们的活力单位。
48.实施例4、实时荧光定量pcr检测肝脏组织中的炎症因子表达；
49.(1)总rna提取
50.各组小鼠取肝脏组织大约100mg的组织至玻璃匀浆器，加入1ml trizol在冰上研磨裂解，待充分匀浆后，将匀浆液转移至无核酶的1.5ml eppendorf管。室温放置5-10min后加入200μl三氯甲烷，用涡旋仪震荡1min然后室温静置10min，4℃，12000g离心15min，小心吸取离心管上层水相300μl至新的1.5ml无核酶离心管中，再加入等体积异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温静置5min，4℃，12000g离心10min，弃上清。在纸上轻轻将多余的异丙醇吸走。再向rna中加入1ml 75％的乙醇洗涤，轻轻颠倒，室温静置5min，4℃，6000g离心5min，弃上清后再加入1ml 100％的无水乙醇，通风橱中室温干燥30min左右，然后每管中加入30ul核酶水，55℃水浴10min使rna充分溶解。用再核酸检测仪测定其rna的浓度及a260/a280的比值，样品立即进行反转录，剩余样品-80℃冰箱保存。
51.(2)rna反转录
52.按照逆转录试剂盒合成cdna，反应体系为20μl，在无核酶的pcr管中加入1μg rna，4μl rt-buffer，2μl dntp，1μl oligo，各0.5μl rnase inhibitor和rever tra ace，无核酶水补足20μl，混匀后短暂离心，放入pcr仪进行反转，反转程序为：42℃ 20min，99℃反应5min，反转好的样品放于-20℃备用。
53.(3)实时荧光定量pcr
54.将逆转录得到的cdna模板pcr扩增目的基因，q-pcr 10μl反应体系：cdna 1ul，ddh2o 3.5ul，green supermix 5ul，pcr引物0.5ul，bio-rad cfx96实时荧光定量pcr仪进行扩增。扩增程序：95℃，10min；95℃，30s；60℃，10s，40个循环。根据扩增曲线计算mrna的相对量。结果以β-actin作为参照基因进行标准化。引物序列如下表所示：
[0055][0056]
实施例5、苏木素-伊红染色：
[0057]
分别取各组小鼠的肝脏组织，用10％的福尔马林溶液进行固定，常规石蜡包埋，4μm切片；苏木精-伊红染料进行染色，观察肝脏组织结构以及炎性细胞的浸润；
[0058]
实施例6、粪便中bacteroides caecimuris菌的检测：
[0059]
(1)粪便全基因组的提取
[0060]
按试剂盒说明书，其操作步骤如下：
[0061]
a.样品处理：每组称取0.1-0.3g(根据干湿)粪便，加500ul溶液a，振荡至彻底悬浮。
[0062]
b.向悬浮液中加入20ul的rnasea(10mg/ml)，55℃放置10min。加入20ul的蛋白酶k(10mg/ml)，充分混匀，55℃水浴消化，30min。消化期间可颠倒离心管混匀数次，12000转离
心10min。将上清转移到一个新的离心管中。如有沉淀，可再次离心。
[0063]
c.加入500ul溶液b，充分混匀。如出现白色沉淀，于55℃放置5min，沉淀即会消失，不影响后续实验。如溶液未变清亮，说明样品消化不彻底，可能导致提取的dna量少及不纯，还有可能导致上柱后堵柱子，增加消化时间。
[0064]
d.加入500ul无水乙醇，充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀，不影响dna的提取，可将溶液和絮状沉淀都加入吸附柱中，放置2min(分两次加入，每次700ul)。
[0065]
e.12000rpm离心2min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。
[0066]
f.向吸附柱中加入600ul漂洗液(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。
[0067]
g.向吸附柱中加入600ul漂洗液，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。
[0068]
h.12000rpm离心2min，将吸附柱置于室温或50℃温箱放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，否则漂洗液中的乙醇会影响后续的实验如酶切、pcr等。
[0069]
i.将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加50-200ul经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置5min，12000rpm离心2min。11、离心所得洗脱液再加入吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心2min，即可得到高质量的基因组dna。
[0070]
(2)实时荧光定量pcr检测；
[0071]
将提取的dnapcr扩增目的基因，q-pcr10μl反应体系：dna1ul，ddh2o3.5ul，greensupermix5ul，pcr引物0.5ul，bio-radcfx96实时荧光定量pcr仪进行扩增。扩增程序：95℃，10min；95℃，30s；60℃，10s，40个循环。根据扩增曲线计算mrna的相对量。结果以β-actin作为参照基因进行标准化。引物序列如下表所示：
[0072][0073]
结果显示：
[0074]
ccl4模型组小鼠血清中alt、ast含量显著增高，提示小鼠体内肝损伤严重，模型成功；并且荧光定量pcr结果显示，ccl4模型组小鼠肝脏中的炎症因子表达增多；苏木素-伊红染色显示，ccl4模型组小鼠肝组织变性坏死增多，炎细胞浸润增多。这些结果都提示，ccl4造肝损伤模型是成功的。灌胃给予bacteroides caecimuris则能够明显降低血清alt、ast，抑制肝脏的炎症因子表达，改善肝组织变性坏死以及炎症细胞的浸润，整体缓解ccl4造成的肝损伤。并且，荧光定量pcr也证实了灌胃给予bacteroides caecimuris确实能够增加粪便中的bacteroides caecimuris含量，进一步佐证上述改善肝损伤的现象是由肠道菌群bacteroides caecimuris实现的。
[0075]
综上结果都证明了bacteroides caecimuris具有有效改善肝损伤的能力，降低血清转氨酶，抑制肝脏炎症反应，缓解肝组织变性坏死。
[0076]
最后，应当理解的是，本发明中所述实施例仅用以说明本发明实施例的原则；其他的变形也可能属于本发明的范围；因此，作为示例而非限制，本发明实施例的替代配置可视
为与本发明的教导一致；相应地，本发明的实施例不限于本发明明确介绍和描述的实施例。

技术特征：
1.bacteroides caecimuris在治疗肝损伤中的应用。2.根据权利要求1所述的bacteroides caecimuris在治疗肝损伤中的应用，其特征在于，所述的bacteroides caecimuris用于改善四氯化碳(ccl4)导致的alt和ast转氨酶升高。3.根据权利要求1所述的bacteroides caecimuris在治疗肝损伤中的应用，其特征在于，所述的bacteroides caecimuris用于改善ccl4导致的肝组织炎症因子浸润。4.根据权利要求1所述的bacteroides caecimuris在治疗肝损伤中的应用，其特征在于，所述的bacteroides caecimuris用于改善ccl4导致的肝细胞坏死。

技术总结
本发明公开了一种拟杆菌Bacteroides caecimuris菌在制备治疗肝损伤药物中的应用。属于生物制药技术领域，本发明叙述了一种拟杆菌Bacteroides caecimuris菌具有显著的肝脏保护作用。本发明研究了Bacteroides caecimuris菌在四氯化碳(CCl4)诱导的肝损伤中的功能。结果显示Bacteroides caecimuris菌能够明显改善CCl4导致的肝细胞坏死和炎性细胞的浸润，改善肝组织损伤，显著降低血清中的谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)，并且抑制肝组织中的炎症因子表达(IL-1β、TNF-α)。因此，Bacteroides caecimuris菌对于肝损伤的相关疾病，特别是对免疫性和化学性因素诱导的肝脏转氨酶升高、炎症因子表达增多、肝组织细胞坏死等损伤有着显著的疗效。坏死等损伤有着显著的疗效。坏死等损伤有着显著的疗效。


技术研发人员：吴旭东 徐强 罗康康
受保护的技术使用者：南京大学
技术研发日：2022.04.12
技术公布日：2022/5/25