基于中空聚多巴胺纳米颗粒的一体式仿生纳米平台及其制备和应用

1.本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种基于中空聚多巴胺纳米颗粒的一体式仿生纳米平台及其制备和应用。


背景技术：

2.癌症是导致死亡的主要原因。癌症治疗需要个体化的方式，如手术、放疗和化疗。最近，免疫疗法和光动力疗法的作用效果已在临床试验中得到验证。放疗广泛应用于临床，70％的癌症患者需要放疗。然而，肿瘤组织的放疗抵抗和正常组织的剂量限制严重限制了放疗的疗效。此外，单独接受放疗会产生严重的副作用，包括纤维化或诱发晚期癌症。因此，在癌症治疗方面，提高放射敏感性是一个持续的挑战。
3.通过放疗引发的癌细胞损伤程度主要取决于肿瘤组织的含氧量。可用活性氧稳定辐射诱导的dna损伤，防止细胞修复dna，从而提高放疗的效率。然而，缺氧是恶性肿瘤的一个标志，因为其供氧系统不足。异常的血管系统不能为快速增殖的癌细胞输送足够的氧气，导致放疗抵抗。因此，缓解肿瘤缺氧对于增强rt的疗效至关重要。最近，研究者提供了许多策略来克服肿瘤组织缺氧，包括直接输送氧气、增加肿瘤组织中的血流量和原位产氧。其中，原位制氧已应用于纳米医学的许多领域。但是原位产氧效率是目前面临的挑战。
4.来自鸡贫血病毒(cav)的vp3基因编码蛋白apoptin(ap)可以选择性地引起细胞凋亡。ap呈丝状聚集，然后通过蛋白酶体降解，而不损害正常细胞。然而，ap可以在恶性细胞中被激活，阻止分裂癌细胞的dna修复，然后诱导恶性细胞凋亡。我们的早期研究发现，apoptin100-109(ap)有作为放射增敏剂的潜力。那么，如何使其具有靶向性，发挥更好的放疗增敏作用是一项技术挑战。
5.传统的光动力疗法(pdt)在肿瘤治疗中显示出了巨大的疗效，并在临床上得到应用。但pdt的主要缺点是光穿透深度有限。由于x射线的高组织穿透性，研究人员提出x射线诱导光动力学疗法(x-pdt)可以克服pdt的缺点，改善深部癌症的治疗效果。在经典的x-pdt模型中，用于临床放疗的x射线能量在数百kev到mev之间，伴随着原位产生的切伦科夫辐射和一系列高能二次电子。传统的光敏剂可以吸收x射线辐射能量并将其转移，产生细胞毒性单线态氧(1o2)，这是肿瘤破坏所必需的。研究人员发现，与单纯的放疗相比，x-pdt具有更高的疗效，表明x-pdt是一种独特的放射增敏方法。pdt和x-pdt均产生细胞毒性活性氧(ros)，尤其是单线态氧(1o2)，这些ros可直接或间接导致癌细胞死亡。那么，如何呈递光敏剂到达合适的部位，从而产生更精准光动力作用，是目前面临的挑战。
6.纳米技术的进步为药物递送提供新思路。具有优异性能的中空纳米材料(例如中空介孔二氧化硅纳米颗粒、中空二氧化锰和中空金纳米球)在药物递送领域显示出巨大潜力。其中，由多巴胺(dpa)聚合的中空聚多巴胺纳米颗粒(hp)具有优异的生物相容性，受到了越来越多的关注。然而，对于靶向给药，对于靶向给药，无表面修饰的纳米载体可以很容易地被网状内皮系统(res)识别；因此，大多数纳米载体聚集在肝脏和脾脏等器官中，无法
8的摩尔比为1:1-1:3。
22.具体地，所述步骤4，将放疗增敏融合多肽apoptin的100-109功能片段、维替泊芬与pt@hp加入甲醇中，避光搅拌，离心弃上清，将沉淀用pbs缓冲液重悬，用冷冻干燥机冻干，即得avpt@hp；其中放疗增敏融合多肽apoptin的100-109功能片段、维替泊芬与pt@hp的摩尔比为1:1:3-1:1:5。
23.本发明基于中空聚多巴胺纳米颗粒的一体式仿生纳米平台可用于制备靶向改善肿瘤部位乏氧或促进肿瘤细胞凋亡或产生光动力治疗效果或提高肿瘤放疗敏感性的药物。
24.与现有技术相比，本发明所获得的纳米平台联合放射治疗能通过改善肿瘤部位乏氧、直接促进肿瘤细胞凋亡、产生光动力治疗效果共同杀伤肿瘤细胞，起到放疗增敏的作用。本发明的制备方法所制备的纳米平台具有优秀的靶向性、ph响应性及药物负载能力强的优势。
附图说明
25.图1是avpt@hp@m的合成示意图。
26.图2、图3是avpt@hp@m的制备和表征。
27.图2a为avpt@hp@m的透射电子显微图像(tem)
28.图2b为avpt@hp@m的元素分析结果。
29.图2c为avpt@hp@m表面细胞膜的透射电子显微图像(tem)。
30.图2d为avpt@hp@m合成过程中的zeta电位的变化。
31.图2e为avpt@hp@m表面细胞膜的wb检测
32.图3a-b为zif-8、pt@zif-8、pt@hp的x射线衍射(xrd)。
33.图3c为ap、vp、pt@hp、avpt@hp的uv-vis吸收光谱。
34.图3d为ap、vp、pt@hp、avpt@hp的ft-ir吸收光谱。
35.图3e为avpt@hp@m的载药能力检测。
36.图3f为avpt@hp@m的流体动力学直径分布。
37.图4为avpt@hp@m靶向性检测。
38.图5为pt@hp@m改善肿瘤细胞乏氧能力检测。
39.图6为avpt@hp@m促进肿瘤细胞凋亡能力检测。
40.图7为avpt@hp@m产生光动力治疗效果检测。
41.图8a为体内治疗实验示意图。
42.图8b为不同治疗组处理后，小鼠体重统计。
43.图8c为不同治疗组处理后，小鼠肿瘤体积统计。
44.图8d为不同治疗组处理后，小鼠肿瘤重量统计。
45.图8e为不同治疗组处理后，肿瘤组织he染色和tunel染色。
46.图9a为不同治疗组处理后，wb检测dna损伤修复标志性蛋白结果。
47.图9b-d为不同治疗组处理后，γ-h2ax foci形成观察和统计
48.图9e为不同治疗组处理后，免疫荧光和免疫组化验证γ-h2ax和hif-1a表达量变化情况。
具体实施方式
49.下面结合附图和实施例详细说明本发明的实施方式。
50.中空纳米材料由于其在药物输送方面的优异性能，显示出巨大的癌症治疗潜力。例如中空介孔二氧化硅纳，中空二氧化锰和中空纳米金颗粒。多巴胺(da)作为一种生物活性分子广泛存在于体内，具有良好的生物相容性，易于聚合和药物化，引起了研究者的广泛关注。此外，仿生细胞膜智能纳米颗粒也越来越受到人们的关注。这种智能纳米颗粒具有较高的稳定性、生物相容性和靶向性。
51.凋亡素是一种由鸡贫血病毒(cav)衍生的小细胞凋亡诱导蛋白，含有121种氨基酸，在多种人恶性转化细胞中具有独立于p53的特异性细胞毒作用，但凋亡素在许多正常人细胞系中几乎没有或没有细胞毒性作用。另一个实验室先前已经证明，凋亡素可以增强肿瘤细胞系的体外放疗反应，这表明它有可能成为放射增敏剂。研究表明，apoptin的100-109功能片段在放射增敏中起着关键作用。
52.维替泊芬是一种临床批准的用于治疗黄斑变性的光敏，具有近紫外(uv)-蓝色区域的强吸收带和700nm左右的第二弱吸收带，能被6mev x射线通过生物介质中的诱导切伦科夫光、电子或者两者均有的作用激发，从而产生光动力作用。
53.本发明试图在合成稳定尺径的铂内嵌的中空聚多巴胺纳米颗粒基础上，利用其强大的载药能力，包载apoptin100-109(ap)功能片段及维替泊芬(vp)，修饰上具有肿瘤靶向作用的肿瘤细胞膜，最终构建出铂内嵌的靶向中空聚多巴胺纳米颗粒，为下一步放疗增敏联合光动力治疗研究提供实验材料。
54.具体而言，本发明提供了一种基于中空聚多巴胺纳米颗粒的一体式仿生纳米平台，其通式为[avpt@hp@m]，a的序列为lkeslitttp，相应功能片段以及其合成在专利cn105330749b中已有公开记载，本发明不再详述。
[0055]
本发明同时公开了其制备方法，步骤为：通过硝酸锌和二甲基咪唑合成了沸石型咪唑盐骨架8(zif-8)纳米颗粒，反应过程中添加聚乙烯吡咯烷酮(pvp)修饰的pt纳米颗粒来合成pt@zif-8。再利用聚多巴胺与zn2 的结合能力高于二甲基咪唑，当在pt@zif-8体系中加入多巴胺时，多巴胺通过螯合竞争诱导聚合取代二甲基咪唑，从而形成铂内嵌的中空聚多巴胺纳米颗粒(pt@hp)。在合成过程中加入apoptin的100-109功能片段(ap)和维替泊芬(vp)，形成avpt@hp。最后，将avpt@hp与癌细胞膜碎片混合并在冰浴中搅拌后，用纳米挤出器挤压使得avpt@hp被癌细胞膜伪装，最终形成了一种基于中空聚多巴胺纳米颗粒的一体式仿生纳米平台(avpt@hp@m)，如图1所示。
[0056]
该基于中空聚多巴胺纳米颗粒的一体式仿生纳米平台的应用，通过改善肿瘤部位乏氧、直接促进肿瘤细胞凋亡、产生光动力治疗效果共同杀伤肿瘤细胞，起到放疗增敏的作用。下面对avpt@hp@m进行验证试验：
[0057]
1.avpt@hp@m的合成
[0058]
1)合成铂纳米颗粒(pt)
[0059]
(1)量筒量取51.4ml双蒸水于100ml烧杯中，称取86mgpvp在烧杯中溶解；
[0060]
(2)准备15mlep管，用量筒量取8.6ml双蒸水倒入ep管中，称取6mm(27.13mg)氯铂酸溶于ep管(铂氯酸有很强的金属腐蚀性，称取时使用塑料勺，且需注意不要散落在天平)；
[0061]
(3)准备1.5mlep管，注入1ml双蒸水，称取10mg nabh4，溶解于ep管；
[0062]
(4)将溶解好pvp的烧杯放置在磁力搅拌器上低速搅拌，用塑料滴管将溶解好的氯铂酸逐滴滴入烧杯中混匀；
[0063]
(5)将溶解好的nabh4用塑料滴管逐滴滴入烧杯中，将烧杯用保鲜膜封口，继续搅拌，搅拌过程中会产生大量气泡，溶液由淡黄色变成深褐色；
[0064]
(6)观察至停止产生气泡，关闭磁力搅拌器，将烧杯于常温中静置24h；
[0065]
(7)准备1l烧杯，加9000ml双蒸水，放至磁力搅拌器；
[0066]
(8)准备透析袋，浸泡于双蒸水1min，将静置好的液体装进透析袋中，用封口夹封口；
[0067]
(9)将透析袋移动至烧杯中，开启磁力搅拌器，开始透析，换水间隔分别为2h，4h，6h，8h，共透析20h；
[0068]
(10)将旋转蒸发仪连接好冷凝器后，打开加热开关，升温至60℃备用；
[0069]
(11)将透析完成的液体移至100ml圆底烧瓶中，连接于旋转蒸发仪，打开冷凝器，开始旋转蒸发，直至干燥沉淀；
[0070]
(12)注入5ml无水乙醇于圆底烧瓶中，将沉淀重悬后，再注入5ml丙酮，超声混匀，直至烧瓶管壁上的沉淀全部溶解后再次旋转蒸发，此过程重复三遍；
[0071]
(13)将沉淀用3ml乙醇重悬后，室温保存。
[0072]
2)合成zif-8
[0073]
(1)准备两个500ml烧杯，用量筒量取100ml甲醇，分别倒入两个烧杯中，将烧杯用保鲜膜封口，放置在磁力搅拌器备用；
[0074]
(2)称取5mg二甲基咪唑及1mg硝酸锌，分别加入烧杯，快速搅拌，直至颗粒全部溶解；
[0075]
(3)将溶解好的二甲基咪唑倒入硝酸锌溶液中，快速搅拌，过程中混合溶液由透明到乳白色，最后变成白色；
[0076]
(4)观察到混合溶液变成纯白色后，转移至4个50mlep管，10000rpm/min，离心1min；
[0077]
(5)弃上清，每管注入3ml甲醇，边超声边摇匀，至沉淀全部溶解，将悬液移动至15mlep管，10000rpm/min，离心1min，重复3遍；
[0078]
(6)将沉淀用12ml甲醇重悬，室温保存。
[0079]
3)合成pt@zif-8
[0080]
(1)准备50ml烧杯，注入20ml甲醇，将烧杯用保鲜膜封口，放置在磁力搅拌器备用；
[0081]
(2)取1ml已合成的铂纳米颗粒，和4ml已合成的zif-8，混入烧杯中，开启磁力搅拌器，搅拌2h；
[0082]
(3)将烧杯中的混合物移动至2个15mlep管中，10000rpm/min，离心1min；
[0083]
(4)弃上清，每管注入5ml甲醇，边超声边摇匀，至沉淀全部溶解，将悬液移动至1个15mlep管中，10000rpm/min，离心1min；
[0084]
(5)弃上清，注入5ml甲醇，边超声边摇匀，至沉淀全部溶解，重复2遍；
[0085]
(6)将沉淀用5ml甲醇重悬，室温保存。
[0086]
4)合成pt@hp
[0087]
(1)打开油浴锅，加热至60℃备用；
[0088]
(2)准备10mlep管，注入5ml甲醇，称取0.02g盐酸多巴胺，倒入ep管中，超声溶解备用；
[0089]
(3)准备250ml三口烧瓶，链接好冷凝管，打开一个瓶盖，注入30ml甲醇，5ml pt@zif-8及5ml盐酸多巴胺溶液后，管好瓶盖；
[0090]
(4)将三口烧瓶固定于油浴锅后，匀速搅拌4-6h；
[0091]
(5)搅拌结束收集液体于50mlep管中，10000rpm/min，离心1min；
[0092]
(6)弃上清，注入10ml甲醇，边超声边摇匀，至沉淀全部溶解，将悬液移动至15mlep管中，10000rpm/min，离心1min，重复3遍；
[0093]
(7)将沉淀用1mlpbs重悬，用冷冻干燥机冻干后-20℃保存。
[0094]
5)合成avpt@hp
[0095]
(1)准备2个1.5mlep管，注入1ml甲醇；
[0096]
(2)称取1mgap；1mgvp及1mgpt@hp，分别加入ep管中，超声溶解；
[0097]
(3)准备1个20ml避光样品瓶，注入10ml甲醇，放置在磁力搅拌器备用；
[0098]
(4)将ap、vp及pt@hp溶液加入样品瓶中，搅拌24h；
[0099]
(5)用15mlep管收集液体，10000rpm/min，离心1min；
[0100]
(6)弃上清，注入10mlpbs，边超声边摇匀，至沉淀全部溶解，10000rpm/min，离心1min，重复2遍；
[0101]
(7)将沉淀用1mlpbs重悬，用冷冻干燥机冻干后-20℃保存。
[0102]
6)细胞膜及膜蛋白提取
[0103]
(1)准备试剂
[0104]
a)室温融解并混匀膜蛋白抽提试剂a和b，融解后立刻放置于冰浴上；
[0105]
b)取适量的膜蛋白抽提试剂a和b备用，在使用前数分钟内加入pmsf，使pmsf的最终浓度为1mm。
[0106]
(2)收集细胞
[0107]
a)将贴壁细胞用pbs洗一遍，用细胞刮子刮下细胞或用含有edta但不含胰酶的细胞消化液处理细胞，用移液器吹打细胞，获得细胞悬液；
[0108]
b)用无菌无酶的15mlep管收集细胞悬液，1000rpm/min，离心3min，吸除上清，留下细胞沉淀，重悬于2ml预冷的pbs中备用。
[0109]
(3)破碎细胞及破碎效果鉴定
[0110]
a)把pmsf的膜蛋白抽提试剂a加入至细胞中，(2-5)
×
107个细胞/1mlpmsf，充分悬浮细胞，动作轻柔，冰浴放置10-15分钟；
[0111]
b)将细胞悬液转移到10ml预冷的玻璃匀浆器中，冰浴中匀浆约30-50下；
[0112]
c)匀浆30次后取约2-3微升细胞匀浆液滴在盖玻片上并在显微镜下观察，如见细胞核周晕环或完整的细胞形态，说明细胞仍完整，需继续匀浆；
[0113]
d)边匀浆边继续观察至70-80％的细胞均无核周晕环和完整细胞形态，说明细胞已经充分破碎；
[0114]
e)记录匀浆次数，以供后续实验参考。
[0115]
(4)获取细胞膜碎片
[0116]
a)将破碎好的细胞4℃，1000rpm/min离心10min，以去除细胞核和未破碎的细胞；
[0117]
b)小心收集上清液至一新的离心管中，为了保证吸取的上清液有较高的纯度，吸取上清时切勿接触沉淀，可以有约30-50微升上清液残留不予吸取；
[0118]
c)将收集的上清液4℃，14000g离心30分钟，沉淀即细胞膜碎片。
[0119]
(5)提取细胞膜蛋白
[0120]
a)将细胞膜碎片沉淀中加入膜蛋白抽提试剂b 200微升，重悬沉淀，4℃放置12h；
[0121]
b)将悬液4℃，14000g离心5min，弃沉淀，收集上清，-80℃保存。
[0122]
7)合成avpt@hp@m
[0123]
(1)准备2个5mlep管，分别注入2ml预冷的pbs；
[0124]
(2)称取5mgpt@hp，加入1个ep管中，超声溶解后，置于冰上备用；
[0125]
(3)将冻存的细胞膜碎片，加入另1个ep管中，用1ml移液枪轻轻吹打，至碎片均匀分布；
[0126]
(4)将两个ep管的液体混匀，整个过程在冰浴上进行；
[0127]
(5)将孔径为200nm的聚碳酸酯膜安放在纳米挤出器中，将匀液注入至纳米挤出器的针管中，每次1ml，抽吸20次左右后，用新的5mlep管收集液体；
[0128]
(6)集齐所有液体后，1000rpm/min离心1min，弃上清，收集沉淀，-80℃保存。
[0129]
上述制备过程中所涉及的参数，可根据实际需要进行适应性调整，上述参数并非对本发明的限制。
[0130]
2.avpt@hp@m的表征
[0131]
1)电子显微镜样品制备
[0132]
(1)取1个1.5mlep管，取1ml制备的纳米颗粒溶液放置在离心管中，用涡旋仪或超声使纳米颗粒分散均匀；
[0133]
(2)取另1个1.5mlep管，加入100μl乙醇溶液，再注入1μl原溶液，超声分散3分钟，使纳米颗粒分散均匀；
[0134]
(3)样品镊取出碳膜铜网，放在实验台，正面朝上；
[0135]
(4)使用10μl移液器取分散好的纳米颗粒溶液滴在碳膜铜网上，在空气中干燥，重复4-5次，使用透射电子显微镜观察，加速电压为200kv，测试温度为23 2℃；
[0136]
(5)观察之后可对样品进行eds分析，检测纳米颗粒所含化学元素。
[0137]
2)粒径、分散性和zeta电位的测定
[0138]
(1)粒径和分散性测定：
[0139]
a)取1个1.5mlep管，加入1ml乙醇溶液，再注入1μl制备的纳米颗粒溶液放置在离心管中，超声使纳米颗粒分散均匀；
[0140]
b)准备比色皿，打开仪器预热，用1ml移液器将准备好的样品移至比色皿中，上机测试，注意比色皿三角部位朝前放置；
[0141]
(2)电位测定：
[0142]
a)取1个1.5mlep管，加入1ml乙醇溶液，再注入5μl制备的纳米颗粒溶液放置在离心管中，超声使纳米颗粒分散均匀；
[0143]
b)准备可抛弃折叠毛细管样品池，用2ml注射器将样品加入池中，注意过程中不能产生气泡，同时使液体高度超过样品池导电处；
[0144]
c)打开仪器预热，将样品池有马尔文logo部位超前放置，开始测试。
[0145]
3)紫外吸收光谱检测
[0146]
(1)打开紫外可见光谱仪预热半小时；
[0147]
(2)准备好pbs，用于基线扫描和及时清理比色皿；
[0148]
(3)取1个5mlep管，加入3mlpbs溶液，再注入10μl制备的纳米颗粒溶液放置在离心管中；
[0149]
(4)用1ml移液器将准备好的样品移至比色皿中，置于紫外一可见分光光度计中，以缓冲溶液作为空白溶液，对250-800nm波长范围内的吸收光谱进行扫描。
[0150]
4)红外光谱分析
[0151]
(1)打开紫外可见光谱仪预热半小时；
[0152]
(2)将制备好的纳米颗粒溶液真空冷冻干燥，待样品成为干燥的粉末后，用称量纸包裹，用载玻片轻轻按压，使样品更加均匀；
[0153]
(3)上样后扫描。
[0154]
5)x-射线衍射试验
[0155]
(1)将制备好的纳米颗粒溶液真空冷冻干燥，待样品成为干燥的粉末后，用称量纸包裹，用载玻片轻轻按压，使样品更加均匀；
[0156]
(2)用小勺将样品放进卡槽，再用大玻璃板将样品压平；
[0157]
(3)将样品室的弹簧片压下，将卡槽放至样品室并推到最里面位置；
[0158]
(4)打开循环水系统，水温不能超过20℃，如果超过，则设备故障，需停止使用；水压不能超过0.4；
[0159]
(5)打开x-射线衍射仪，待power指示灯亮起，半分钟自检之后才能打开计算机；
[0160]
(6)打开测试软件，检查样品室的门，若对话框中的小方框显示绿色，提示门关闭；红色提示门未关闭；
[0161]
(7)测试结束后，设置参数，扫描样品。
[0162]
6)高效液相色谱分析
[0163]
(1)仪器准备：
[0164]
a)根据分析对象选择色谱柱和流动相，使用c18柱(nova-pak 3.9
×
250mm，waters，milford，ma)；流动相包括水和乙腈，体积比例为1:9。
[0165]
b)过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜，过滤后的流动相进行超声脱气30min；
[0166]
c)连接好流动相管道，打开hplc工作站(包括计算机软件和色谱仪)，连接检测系统；
[0167]
d)冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不超过10ml/min；
[0168]
e)设计走样方法，点击file，选取select users and methods，点击new method，选取需要的配件(进样阀，泵，检测器等)。一个完整的走样方法需要包括：
[0169]
(a)进样前的稳流，一般2-5分钟；
[0170]
(b)基线归零；
[0171]
(c)进样阀的loading-inject转换；
[0172]
(d)走样时间，随不同的样品而不同。
[0173]
(2)样品准备：
[0174]
a)准备2ml注射器，0.45um滤器，样品瓶；
[0175]
b)将注射器针头去掉，吸入样品，注入滤器过滤至样品瓶中，样品量在200μl左右；
[0176]
c)观察样品瓶，一定不能有气泡，若有气泡，则甩动样品瓶至气泡排出
[0177]
(3)进样
[0178]
a)选定走样方法，点击start，开始进样；
[0179]
b)先进单纯的溶剂，作为基线，再开始进检测样品，全部样品检测完，再用同样的方法走一段基线，清洗系统。
[0180]
(4)关机
[0181]
先关闭计算机，再关闭液相色谱。
[0182]
3.avpt@hp@m的体内应用
[0183]
选取5周龄体重约18g的健康裸鼠，在层流室内培养1周后，无菌条件下于裸鼠右后肢根部皮下注射pbs(磷酸盐缓冲液)稀释的hct-116细胞(2
×
106/只)，建立人结直肠癌细胞裸鼠移植瘤模型。饲养裸鼠至肿瘤体积至约100mm3时，作为造模裸鼠进行后续实验。
[0184]
1)分组：control、ir、avpt@hp@m、apt@hp@m ir、vpt@hp@m ir、avpt@hp@m ir；
[0185]
2)尾静脉注射各组纳米药物
[0186]
(1)用小鼠固定器固定小鼠，露出小鼠尾巴；准备好1毫升的注射器；
[0187]
(2)用pbs溶解各组纳米药物，将其用0.22滤膜过滤；
[0188]
(3)寻找小鼠尾部的三条静脉，左右两边各一根而且比较浅，容易穿刺；中间一根位置较深，不易穿到；找到左右两边的静脉采用75％酒精反复擦拭，使其充盈，并且使皮肤的角质层软化，利于穿刺；
[0189]
(4)左手食指和中指上下夹注所选择血管的靠近身体的一边，无名指和小指垫起一块纱布或者纸巾，拇指压住所选血管的尾尖端，上下夹住血管的距离应以不影响右手持针上下移动；
[0190]
(5)右手持注射器，吸取适量的纳米药物溶液，于尾部中下2/3～1/2处，针斜面向上进针，针与皮肤稍成一角度(10
°
左右)，将针头稍向上挑进针，若无阻力，则进针成功，将溶液推进血管；
[0191]
(6)拔出注射器，用纱布压住穿刺部位反折尾部进行止血；
[0192]
3)小鼠放疗
[0193]
(1)于物理室做好放疗计划，照射源为直线加速器4mv-x射线，源皮距(ssd)为100cm，射野大小为2cm
×
2cm，剂量设置为2gy；
[0194]
(2)将连续注射2天纳米药物(apt@hp@m、vpt@hp@m及avpt@hp@m)的荷瘤小鼠进行气体麻醉；
[0195]
(3)将已经麻醉好的小鼠，带至放疗室，置于照射野中心，开始照射。
[0196]
结果与讨论：
[0197]
如图2a所示，合成的zif-8呈立体六边形，尺寸均一，分散性良好，当在zif-8表面修饰pt纳米颗粒，形成的pt@zif-8依然呈立体六边形，尺寸均一，分散性良好；用多巴胺进一步修饰pt@zif-8，形成的pt@hp呈中空的环状，而这样一种结构，不仅具有更好的生物安全性还使得纳米颗粒的载药空间变得更大；配合能量色散光谱仪对纳米颗粒进行eds分析结果显示pt@hp@m中主要含有n、o、zn、pt元素，而且呈环形分布，恰好与pt@hp@m的形状相吻
合，表明了pt颗粒成功负载于中空的聚多巴胺环上(图2b)。通过纳米挤压器将pt@hp表面修饰上细胞膜形成pt@hp@m后，观察到pt@hp@m依然呈中空的环状，但是表面包裹了一层约8nm的薄膜(图2c)。对纳米复合物制备过程中表面电位的变化情况进行检测，结果发现：在avpt@hp表面修饰细胞膜，得到的avpt@hp@带负电荷，约在-24.5mv。进一步证实了avpt@hp表面的薄膜为细胞膜。进一步的wb结果显示avpt@hp@m表面成功表达膜蛋白且与纯化的细胞膜一致。表明细胞膜确实成功包被于avpt@hp表面。
[0198]
图3a-b所示的xrd分析结果显示了zif-8所具备的晶体结构，修饰pt后形成pt@zif-8与单独的zif-8高度一致，并且在30
°–
90
°
的大角度处观察到四个额外的特定峰，对应于pt的(111)、(200)、(220)和(310)。至于pt@hp，pt的四个峰保留，而zif-8的峰消失，并被非晶态聚合物壳的散射衍射所取代。这说明，pt的修饰并不影响zif-8的晶体结构，而当进一步用多巴胺修饰pt@zif-8，形成pt@hp后，zif-8的晶体结构消失。综上所述，空心聚多巴胺(hp)纳米颗粒成功合成。
[0199]
紫外可见吸收光谱显示ap的紫外可见吸收峰λmax位于220nm附近；vp的紫外可见吸收峰λmax位于420nm附近；而pt@hp不具备紫外可见吸收峰；当pt@hp包载ap和vp后，紫外可见吸收峰λmax出现红移，最大吸收峰分别位于240nm和440nm附近(图3c)。说明了pt@hp具有良好的载药性能，能成功负载ap和vp。红外光谱分析结果显示：相对单独的ap、vp以及单纯的纳米载体pt@hp，包载完ap和vp后的avpt@hp有吸收峰的改变，提示有新官能团的产生。进一步证明了pt@hp具能成功负载ap和vp(图3d)。
[0200]
图3e通过比较载药前后的浓度，确定ap单独的包封率为65.3％
±
1.32％，vp单独的包封率为84.6％
±
1.22％。当ap和vp的浓度比为1:1时，ap和vp的共载包封率最佳，分别约为44.6和83.2。因此以ap和vp的浓度比为1:1作为后续实验中，纳米复合体的合成条件。图3f展示了最终合成的avpt@hp粒径集中在250nm。
[0201]
为了验证肿瘤细胞膜包裹的pt@hp的靶向性，我们将avpt@hp用hct-116细胞膜包被(avpt@hp@m)然后与不同类型的癌细胞(mcf-7、hela和hct-116细胞)共同孵育孵育。结果显示，与mcf-7和hela细胞相比，avpt@hp@m对hct-116细胞的特异性自我识别能力更强(图4)。
[0202]
[ru(dpp)3]cl2是一种细胞内o2水平指示器，用于检测治疗前后正常氧和缺氧条件下的o2水平。[ru(dpp)3]cl2的红色荧光与细胞内o2浓度呈负相关。在正常氧条件下，细胞内的红色荧光明显弱于缺氧组。用不含铂的hp@m处理时，在4小时内，与对照组相比，正常氧组和低氧组的红色荧光无明显变化。相比之下，当使用pt@hp@m处理4h后，正常氧组和缺氧组细胞内的红色荧光均显著降低，表明pt在正常氧组和缺氧组中均显著催化氧气的产生并缓解缺氧(图5)。
[0203]
流式细胞凋亡结果显示对照组的细胞凋亡率为5.7％，而单独的ir或avpt@hp@m处理组的细胞凋亡率分别为20.0％和6.9％。对于联合治疗组：apt@hp@m ir、vpt@hp@m ir以及avpt@hp@m ir，细胞死亡率分别增加到34.1％、32.6％和62.1％(图6)。这些结果证实avpt@hp@m联合ir能有效促进细胞凋亡，提高放射治疗的敏感性。
[0204]
dcfh-da是一种活性氧探针，常用于检测细胞内h2o2和氧化应激。该探针具有细胞通透性，在细胞内水解为dcfh羧酸阴离子，该阴离子保留在细胞内。dcfh的双电子氧化导致形成一种称为二氯荧光素(dcf)的荧光产物，并且可以通过基于荧光的技术轻松监测。当用
ir或avpt@hp@m、细胞中出现微弱绿色荧光，与对照组相似，这可能是由于活细胞中存在内源性ros所致。当用纳米颗粒(apt@hp@m,，vpt@hp@m、及avpt@hp@m)联合ir处理细胞时，细胞中的绿色荧光显著增加，且在avpt@hp@m ir处理组显示出最强烈的绿色荧光，表明大量ros生成(图7)。先前的研究表明，深穿透x射线辐射伴随着切伦科夫辐射的原位产生和高能二次电子的级联。ap是一种放射增敏剂，可促进ir后ros的产生。同时，vp是一种光敏剂，可被切伦科夫辐射激活，产生x射线诱导的光动力作用(x-pdt)，以产生细胞毒性ros。因此，在avpt@hp@m联合ir组显示出比其他组更大的活性氧生成能力(p《0.05)。这些数据显示avpt@hp@m纳米颗粒有效地增加了细胞内ros的水平，并有可能提高体内放射敏感性。
[0205]
为了确定avpt@hp@m在体内的作用效果，我们将hct-116荷瘤小鼠随机分为六组：对照组、ir组、avpt@hp@m、apt@hp@m ir、vpt@hp@m ir以及avpt@hp@m ir。如图8a所示，对小鼠进行治疗和ir。每2天记录各组的体重和肿瘤生长，以评估治疗效果。体重测量表明，各组的小鼠都有相似的生长曲线(图8b)；肿瘤生长测量结果显示，avpt@hp@m ir治疗组与其他治疗组相比，肿瘤生长明显较慢(图8c)；肿瘤重量结果显示avpt@hp@m ir治疗组肿瘤重量最低(图8d)。如图图8e，肿瘤切片的he组织染色结果显示avpt@hp@m ir治疗组与其他组相比，肿瘤组织中的坏死更多。tunel荧光染色结果显示在对照组、ir组和avpt@hp@m的肿瘤切片中检测到少量tunel阳性凋亡细胞(绿点)，相比之下，avpt@hp@m ir处理组的肿瘤切片细胞绿点更多，提示其凋亡率明显高于对照组apt@hp@m ir和vpt@hp@m ir组，表明apt@hp@m能杀伤实体瘤，结合放疗后，其肿瘤杀伤作用更明显。
[0206]
图9a中wb实验结果显示，与对照组和ir组相比，apt@hp@m ir，apt@hp@m ir，以及avpt@hp@m ir治疗组中p-brca1、p-atm和γ-h2ax的表达水平增加，而brca1和atm没有变化。这些结果表明apt@hp@m和avpt@hp@m抑制dsb后的hr修复。这些结果表明，ap通过抑制dsbs后的hr信号通路，对ir起到放射增敏作用。采用免疫荧光(if)和免疫组织化(ihc)染色来评估γ-h2ax和hif-1α的表达水平来进一步研究avpt@hp@m在体内在缓解缺氧和对提高放疗敏感性上的作用。免疫荧光显示，肿瘤在avpt@hp@m ir组有最亮的绿色荧光，表明γ-h2ax的表达水平最高。相反，所有治疗组的hif-1α表达(红色荧光)均显著降低，尤其是avpt@hp@m ir组。与免疫荧光结果一致，免疫组织化染色结果显示avpt@hp@m ir组中γ-h2ax的表达水平最高，hif-1α表达水平最低。
[0207]
综上所述，本发明提出的一种基于中空聚多巴胺纳米颗粒的一体式仿生纳米平台[avpt@hp@m]能通过改善肿瘤部位乏氧、直接促进肿瘤细胞凋亡、产生光动力治疗效果共同杀伤肿瘤细胞，起到放疗增敏的作用，本发明纳米平台也可以承载其他药物，实现多种治疗效果。本发明的制备方法所制备的纳米平台具有优秀的靶向性及药物负载能力强的优势。
[0208]