三苯胺-苯并吡喃鎓盐衍生物NIR-BT-P及其合成方法和应用

三苯胺-苯并吡喃鎓盐衍生物nir-bt-p及其合成方法和应用
技术领域
1.本发明涉及三苯胺-苯并吡喃鎓盐衍生物，具体属于一种三苯胺-苯并吡喃鎓盐衍生物nir-bt-p在近红外检测极性中的应用。


背景技术：

2.极性作为一项重要的指标，在化学和生物学中起着举足轻重的作用。在生物系统中，特别是在细胞水平上，极性决定了大量蛋白质和酶的相互作用活性及反映了膜室的通透性。此外，极性与多种生理过程密切相关，如膜融合、蛋白质变性、酶的构象变化和肽聚集。特别是极性的异常变化与阿尔茨海默病、糖尿病、肝硬化和癌症等多种疾病密切相关。另外，不同亚细胞室的极性与发挥的作用也是不同的。线粒体是大多数细胞中主要的能量产生室，在许多重要的细胞过程中发挥作用，如atp的产生、钙调节和氧化还原信号转导以及细胞死亡的凋亡过程。线粒体极性强烈影响蛋白质在细胞内的转运和生物大分子之间的相互作用。并且最近的研究表明，线粒体微环境的波动与细胞癌变密切相关。癌细胞的线粒体极性水平低于正常细胞。因此，准确监测线粒体中的极性，尤其是在生物系统中具有十分重要的意义。然而，极性是一个复杂的因素，它包含了一系列非共价相互作用，包括偶极性/极化率和氢键，因此，在活细胞中测量它是困难的，研究人员迫切需要开发有效且方便的工具来准确检测线粒体中的极性。
3.与许多传统工具相比，荧光探针具有操作简单、高选择性和灵敏度、实时监测、无侵入性和高时空分辨率等优点，是体外和生物系统中极性检测的最常用手段。因此设计选择性好、灵敏度高、线粒体靶向、具有低细胞毒性的荧光探针用于检测活细胞和组织中的极性，已成为当前生物医学发展中具有挑战性的前沿课题之一。
4.在本发明中，合成了一种基于三苯胺-苯并吡喃鎓盐的化合物nir-bt-p，通过nir-bt-p与不同极性下在反应前后荧光信号强度变化，实现对细胞中线粒体中极性的准确检测。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种三苯胺-苯并吡喃鎓盐衍生物nir-bt-p及其合成方法和近红外检测极性中的应用，且检测方法简单，操作方便，选择性好，灵敏度高。
6.本发明提供的一种三苯胺-苯并吡喃鎓盐衍生物nir-bt-p，所述衍生物中文名称为：(e)-6-(二乙氨基)-4-(4(二苯基氨基)亚苄基)-1,2,3,4四氢氧嘧啶。英文名称为：(e)-6-(diethylamino)-4-(4(diphenylamino)benzylidene)-1,2,3,4tetrahydroxanthylium，命名为nir-bt-p，结构式为：
[0007][0008]
本发明提供的一种基于三苯胺-苯并吡喃鎓盐衍生物nir-bt-p的合成方法，步骤如下：
[0009]
(1)在0℃下，将环己酮滴加到浓h2so4中，并保持溶液搅拌，然后加入4-(二乙氨基)-2-羟基苯甲醛。将混合物进一步在90℃加热2～3小时，冷却至室温后，将混合物缓慢倒入冰水中，然后加入hclo4，将混合物过滤，水洗，真空干燥，得到的棕色固体即为6-(二乙氨基)-1,2,3,4-四氢氧嘧啶，无需进一步纯化即可用于下一步，其中4-(二乙氨基)-2-羟基苯甲醛与环己酮的摩尔比为1：1.5-2.5；
[0010]
(2)将6-(二乙氨基)-1,2,3,4-四氢氧嘧啶和4-(二苯氨基)苯甲醛溶解在ch3cooh中。将混合物在110℃加热2～3小时。反应完成后，将反应产物冷却至室温，减压除去溶剂，真空干燥，得到粗产物。然后，以体积比20:1的二氯甲烷和甲醇作洗脱剂经硅胶柱色谱分离，纯化即得(e)-6-(二乙氨基)-4-(4(二苯基氨基)亚苄基)-1,2,3,4四氢氧嘧啶(nir-bt-p)，其中6-(二乙氨基)-1,2,3,4-四氢氧嘧啶和4-(二苯氨基)苯甲醛的摩尔比为1：1.5-2.5。
[0011]
作为优选：
[0012]
所述的步骤(1)中4-(二乙氨基)-2-羟基苯甲醛与环己酮的摩尔比为1：2。
[0013]
所述的步骤(2)中6-(二乙氨基)-1,2,3,4-四氢氧嘧啶和4-(二苯氨基)苯甲醛的摩尔比为1：2。
[0014]
本发明合成的nir-bt-p可用于近红外检测极性，也可在制备检测细胞线粒体中极性的试剂中应用。
[0015]
本发明提供的nir-bt-p近红外检测极性的方法，步骤为：
[0016]
(1)将nir-bt-p溶于dmso配制成2mm的溶液；
[0017]
(2)取2ml的1，4二氧六环、10μlnir-bt-p的dmso溶液加入到一个荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，随着体系中蒸馏水体积比的增大，830nm处的荧光强度逐渐降低；
[0018]
(3)分别将体积为1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1、0.9ml的1，4二氧六环加到荧光比色皿中，分别加入蒸馏水的体积为0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1ml，同时在荧光光谱仪上测定最大的荧光强度f
max
为556.1、464.4、394.4、314.2、260.2、191.9、142.1、94.4、41.1，以极性(δf)为横坐标，以荧光强度f
max
为纵坐标绘制图，得到极性的工作曲线；线性回归方程为：f
max
＝3297.0-10830.5δf。
[0019]
与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果：
[0020]
1、本发明三苯胺-苯并吡喃鎓盐衍生物合成简单，成本低廉；
[0021]
2、本发明三苯胺-苯并吡喃鎓盐衍生物不仅能实现线粒体高效靶向，而且可实现近红外检测极性，检测结果灵敏度高，选择性好；
[0022]
3、本发明检测手段简单，只需要借助荧光光谱仪即可实现；
[0023]
4、本发明采用近红外检测，检测信号明显且具有较好的穿透能力。
附图说明
[0024]
图1实施例1制备的三苯胺-苯并吡喃鎓盐衍生物nir-bt-p的核磁氢谱图
[0025]
图2实施例1制备的三苯胺-苯并吡喃鎓盐衍生物nir-bt-p的核磁碳谱图
[0026]
图3实施例1制备的三苯胺-苯并吡喃鎓盐衍生物nir-bt-p的质谱图
[0027]
图4三苯胺-苯并吡喃鎓盐衍生物nir-bt-p与不同体积比例的1，4二氧六环-水作用后的荧光光谱图
[0028]
图5三苯胺-苯并吡喃鎓盐衍生物nir-bt-p测定极性的工作曲线
[0029]
图6三苯胺-苯并吡喃鎓盐衍生物nir-bt-p与各种分析物的荧光柱状图
[0030]
图7共定位细胞成像图
[0031]
图8三苯胺-苯并吡喃鎓盐衍生物nir-bt-p测定不同种类细胞的细胞成像图
[0032]
图9三苯胺-苯并吡喃鎓盐衍生物nir-bt-p检测区分荷瘤小鼠中肿瘤组织的成像图
具体实施方式
[0033]
下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。
[0034]
实施例1
[0035]
nir-bt-p的制备和表征
[0036]
nir-bt-p的合成路线：
[0037][0038]
nir-bt-p的合成方法，步骤为：
[0039]
(1)在0℃下，将环己酮(3.1ml,30mmol)滴加到浓h2so4(40ml)中，并保持溶液搅拌，然后加入4-(二乙氨基)-2-羟基苯甲醛(2.9g,15mmol)。将混合物进一步在90℃加热2小时，冷却至室温后，将混合物缓慢倒入冰水(300ml)中，然后加入4ml hclo4，将混合物过滤，水洗，真空干燥，得到的棕色固体即为6-(二乙氨基)-1,2,3,4-四氢氧嘧啶(5.2g，收率97％)，无需进一步纯化即可用于下一步。
[0040]
(2)将6-(二乙氨基)-1,2,3,4-四氢氧嘧啶(1.8g,5mmol)和4-(二苯氨基)苯甲醛(2.7g,10mmol)溶解在ch3cooh中。将混合物在110℃加热2.5小时。反应完成后，将反应产物冷却至室温，减压除去溶剂，真空干燥，得到粗产物。然后，以体积比20:1的二氯甲烷和甲醇作洗脱剂经硅胶柱色谱分离，纯化即得(e)-6-(二乙氨基)-4-(4(二苯基氨基)亚苄基)-1,2,3,4四氢氧嘧啶(nir-bt-p，1.6g，62％产率)。1h nmr(600mhz,dmso)δ8.49(s,1h),8.03(s,1h),7.89(d,j＝9.4hz,1h),7.60(d,j＝8.8hz,2h),7.44(d,j＝2.2hz,1h),7.43
–
7.40
(m,4h),7.27(d,j＝1.9hz,1h),7.21(d,j＝7.4hz,2h),7.18(t,j＝7.9hz,4h),6.96(d,j＝8.8hz,2h),3.70(dd,j＝13.9,6.8hz,4h),2.95
–
2.92(m,2h),2.88
–
2.85(m,2h),1.86(dd,j＝11.2,5.4hz,2h),1.25(t,j＝7.0hz,6h).(图1)
13
c nmr(151mhz,dmso)δ163.41(s),158.89(s),156.06(s),149.57(s),148.47(s),146.37(s),137.01(s),133.40(s),132.28(s),130.41(s),128.26(s),126.29(s),126.09(s),125.43(s),123.72(s),120.09(s),118.85(s),118.44(s),95.94(s),45.95(s),27.34(d,j＝9.8hz),21.52(s),13.03(s).(图2)esi-ms m/z:[nir-bt-p h]

calcd.for 511.2744,found 511.2747.(图3)
[0041]
实施例2
[0042]
配制2mmnir-bt-p的dmso溶液，取体积分别为2、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1、0.9ml的1，4二氧六环加到12个荧光比色皿中，分别加入蒸馏水的体积为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1ml蒸馏水于比色皿中，向其中分别加入10μl nir-bt-p的dmso溶液，同时在荧光分光光度仪上检测，随着体系中蒸馏水体积比的增大，830nm处的荧光强度逐渐降低。荧光发射图见图4。
[0043]
实施例3
[0044]
配制2mmnir-bt-p的dmso溶液，配制2mm二氧化硫水溶液；在9个比色皿中分别加入体积为1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1、0.9ml的1，4二氧六环，再分别加入蒸馏水的体积为0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1ml，同时在荧光光谱仪上测定最大的荧光强度f
max
为556.1、464.4、394.4、314.2、260.2、191.9、142.1、94.4、41.1，以极性(δf)为横坐标，以荧光强度f
max
为纵坐标绘制图，得到极性的工作曲线；线性回归方程为：f
max
＝3297.0-10830.5δf，见图5。
[0045]
实施例4
[0046]
配制ph＝7.4、浓度为10mm的pbs缓冲溶液，配制2mmnir-bt-p的dmso溶液，在荧光比色皿中，各加入2ml的纯pbs缓冲溶液和10μlnir-bt-p的dmso溶液，再分别加入不同摩尔量的分析物：water,kcl(100μm),cacl2(2mm),zncl2(150μm),cucl2(100μm),mgcl2(1mm),na2co3(2mm),nano3(2mm),na2s(150μm),na2so4(150μm),nahso4(100μm),gsh(10mm),hcy(10mm),and cys(10mm)的水溶液，另外，再在另一个荧光比色皿中加入2ml的1，4二氧六环和10μlnir-bt-p的dmso溶液作为对照组。荧光比色皿中在荧光分光光度仪上检测，绘制不同分析物对应的830nm处荧光强度柱状图(见图6)。1，4二氧六环使得检测体系在830nm处荧光强度明显升高，其它的分析物基本没有引起检测体系荧光强度的变化。
[0047]
实施例5
[0048]
配置配制ph＝7.4、浓度为10mm的pbs缓冲溶液，配制2mmnir-bt-p的dmso溶液，把10μlnir-bt-p的dmso溶液加入到2ml的pbs缓冲溶液中；将探针溶液加入hela细胞培养液中，使得其浓度为10μm，与hela细胞在37℃下，反应15min；将体系在荧光成像仪下观测；紧接着将0.2μmmitotracker green加入刚刚的体系中，在37℃下，反应20min。将体系在荧光成像仪下观测，同时对得到的荧光图片进行共定位率计算，见图7。
[0049]
实施例6
[0050]
配制ph＝7.4、浓度为10mm的pbs缓冲溶液，配制2mmnir-bt-p的dmso溶液，把10μlnir-bt-p的dmso溶液加入到2ml的pbs缓冲溶液中；将探针溶液分别加入hela、hepg2、7702细胞培养液中，使得其浓度为10μm，与hela、hepg2、7702细胞在37℃下，反应15min，体系在
荧光成像仪下，显示用nir-bt-p处理的癌细胞(hela与hepg2细胞)的红色荧光强度高于正常细胞(7702细胞)，见图8。
[0051]
实施例7
[0052]
配制2mmnir-bt-p的dmso溶液，将hela细胞皮下注射到balb/c雌性裸鼠中，大约两周后获得肿瘤块。然后将20μl nir-bt-p注射到balb/c雌性裸鼠的肿瘤部位和左下肢部位(正常部位)。在710nm激发下，发现红色通道中的小鼠肿瘤部位显示出明显的荧光信号，而正常部位显示出非常微弱的荧光信号(见图9)。

技术特征：
1.一种三苯胺-苯并吡喃鎓盐衍生物nir-bt-p，其特征在于，结构式为：2.如权利要求1所述的一种三苯胺-苯并吡喃鎓盐衍生物nir-bt-p的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)在0℃下，将环己酮滴加到浓h2so4中，并保持溶液搅拌，然后加入4-(二乙氨基)-2-羟基苯甲醛；将混合物进一步在90℃加热2～3小时，冷却至室温后，将混合物缓慢倒入冰水中，然后加入hclo4，将混合物过滤，水洗，真空干燥，得到的棕色固体即为6-(二乙氨基)-1,2,3,4-四氢氧嘧啶；其中4-(二乙氨基)-2-羟基苯甲醛与环己酮的摩尔比为1：1.5-2.5；(2)按摩尔比为1：1.5-2.5将6-(二乙氨基)-1,2,3,4-四氢氧嘧啶和4-(二苯氨基)苯甲醛溶解在ch3cooh中；将混合物在110℃加热2～3小时；反应完成后，将反应产物冷却至室温，减压除去溶剂，真空干燥，得到粗产物；然后，粗产物用体积比20:1的二氯甲烷和甲醇作洗脱剂经硅胶柱色谱分离，纯化即得(e)-6-(二乙氨基)-4-(4(二苯基氨基)亚苄基)-1,2,3,4四氢氧嘧啶(nir-bt-p)。3.如权利要求2所述的nir-bt-p的合成方法，其特征在于，所述的步骤(1)中4-(二乙氨基)-2-羟基苯甲醛与环己酮的摩尔比为1：2。4.如权利要求2所述的nir-bt-p的合成方法，其特征在于，所述的步骤(2)中6-(二乙氨基)-1,2,3,4-四氢氧嘧啶和4-(二苯氨基)苯甲醛的摩尔比为1：2。5.一种近红外检测极性的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将权利要求1所述nir-bt-p溶于dmso配制成2mm的溶液；(2)取2ml的1，4二氧六环、10μlnir-bt-p的dmso溶液加入到一个荧光比色皿中，在荧光分光光度仪上检测，随着体系中蒸馏水体积比的增大，830nm处的荧光强度逐渐降低；(3)分别将体积为1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1、0.9ml的1，4二氧六环加到荧光比色皿中，分别加入蒸馏水的体积为0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1ml，同时在荧光光谱仪上测定最大的荧光强度f
max
为556.1、464.4、394.4、314.2、260.2、191.9、142.1、94.4、41.1，以极性(δf)为横坐标，以荧光强度f
max
为纵坐标绘制图，得到极性的工作曲线；线性回归方程为：f
max
＝3297.0-10830.5δf。6.如权利要求1所述的三苯胺-苯并吡喃鎓盐衍生物nir-bt-p在制备检测细胞线粒体中极性的试剂中的应用。

技术总结
本发明提供一种三苯胺-苯并吡喃鎓盐衍生物NIR-BT-P及其合成方法和应用。所述衍生物NIR-BT-P的中文名称为：(E)-6-(二乙氨基)-4-(4(二苯基氨基)亚苄基)-1,2,3,4四氢氧嘧啶；英文名称为(E)-6-(diethylamino)-4-(4(diphenylamino)benzylidene)-1,2,3,4tetrahydroxanthylium。所述衍生物NIR-BT-P作为荧光探针，在不同的有机溶剂中，通过荧光分光光度计实现不同荧光强度信号对极性的检测。该方法利用生物体内癌细胞与正常细胞中极性的不同，实现了近红外荧光成像用于生物体内肿瘤组织与正常组织的区分检测。肿瘤组织与正常组织的区分检测。肿瘤组织与正常组织的区分检测。


技术研发人员：张涛 阴彩霞 霍方俊
受保护的技术使用者：山西大学
技术研发日：2022.02.17
技术公布日：2022/5/25