唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的LAMP检测引物组、试剂盒以及冻干微球的制备方法与流程

唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的lamp检测引物组、试剂盒以及冻干微球的制备方法
技术领域
1.本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的lamp检测引物组、试剂盒以及冻干微球的制备方法。


背景技术：

2.唐菖蒲伯克霍尔德氏菌为革兰氏阴性短杆菌、两端钝圆，无牙孢，有鞭毛，在自然界分布广泛。唐菖蒲伯克霍尔德氏菌为兼性厌氧，易在食品表面生长。唐菖蒲伯克霍尔德氏菌可以产生米酵菌酸引起食物中毒，唐菖蒲伯克霍尔德氏菌不耐高温，很容易被高温杀死，但是它所产生的“米酵菌酸”毒素耐热，一般烹调方法不能破坏其毒性。由于唐菖蒲伯克霍尔德氏菌食物中毒流行规模较大、发病率和病死率极高，而且目前缺乏特效的解毒措施。因此唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的检测方法是否灵敏、快速至关重要。
3.目前米酵菌酸的检测方法的依据是gb 5009.189-2016《食品安全国家标准食品中米酵菌酸的测定》，用的是高相液相色谱法检测，检测的仪器及试剂成本非常相对较高，除此以外也有用薄层层析、紫外分光光度、elisa、胶体金试纸条等方法检测唐菖蒲伯克霍尔德氏菌所产生的外毒素的。这些方法虽然操作相对简单一些，但很容易出现假阳性现象。
4.环介导恒温扩增技术是一种不需要精确控温过程的基因诊断技术，借助6条特异性引物和一种具有链置换特性的dna聚合酶，可在等温条件下快速，高特异性和灵敏的扩增靶序列，检测全过程只需要在60-65℃条件下扩增40-60min，具有操作简单、反应时间短、特异性高、灵敏度高等特点，广泛应用于病原菌检测领域。
5.环介导恒温扩增法结果判读方法主要有1：浊度法，可通过反应后肉眼观察是否存在白色絮状沉淀，判定检测结果，主观因素较强，灵敏度低。2、显色法，反应结束后加入核酸染料sybr green、hnb、钙黄绿素等，在紫外灯或肉眼条件下显示不同的颜色，结果判定简单，但需要反应结束后开盖，极易造成气溶胶污染。3、荧光检测法，该方法通过向反应体系中加入荧光染料sybr green，通过荧光pcr仪可实时观察体系中荧光变化，生成荧光曲线，通过曲线观察扩增结果，该方法闭管检测，杜绝气溶胶污染，但因sybr green染料特性，能和任意的双链dna结合，并发生荧光，特异性低易出现假阳性。


技术实现要素：

6.本发明的第一目的在于提供一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的lamp检测引物组，该引物组针对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的保守序列16s～23s rrna设计，能够特异性的识别唐菖蒲伯克霍尔德氏菌，特异性强。
7.本发明的第二目的在于提供一种用于检测唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的冻干微球的制备方法，该方法采用冻干预混液的方式，将所有的试剂包含在一个冻干微球中，制备过程简单，冻干微球中试剂的稳定性好。
8.本发明的第三目的在于提供一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的lamp检测试剂盒，该试
剂盒利用上述冻干微球，能够简单、快速、高效的检测出唐菖蒲伯克霍尔德氏菌存在与否，进而判断出检测样本中是否含有米酵菌酸毒素，特异性强，不易出现假阳性。
9.本发明的第四目的在于提供一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的lamp检测方法，该检测方法仅需将上述冻干微球复溶后与模板dna混合扩增，即可完成检测，方法简便，特异性强，能够有效避免传统检测过程中加样的繁琐过程以及加样过程中导致试剂污染、假阳性等结果。
10.本发明通过以下技术方案实现：
11.第一方面，本发明提供一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的lamp检测引物组，检测引物组针对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的16s～23s rrna保守序列设计，检测引物组包括外引物f3、外引物b3、内引物fip、内引物bip、环引物lf和环引物lb；
12.外引物f3的核苷酸序列如seq id no.1所示：
13.外引物b3的核苷酸序列如seq id no.2所示；
14.内引物fip的核苷酸序列如seq id no.3所示；
15.内引物bip的核苷酸序列如seq id no.4所示；
16.环引物lf的核苷酸序列如seq id no.5所示；
17.环引物lb的核苷酸序列如seq id no.6所示。
18.进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述外引物f3和外引物b3的浓度均为0.15～0.25μm，内引物fip与内引物bip的浓度均为1.5～1.7μm，环引物lf和环引物lb的浓度为0.4～0.8μm。
19.第二方面，本技术提供一种用于检测唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的冻干微球的制备方法，其包括：
20.将上述检测引物组与lamp反应基液混合，得到扩增反应体系；
21.将扩增反应体系与冻干保护剂混合，逐滴滴入液氮中速冻成球后，冷冻干燥。
22.进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述冷冻干燥的步骤包括：将在液氮中形成的微球于﹣50～60℃下进行第一次干燥8～16h后，在20～30℃下进行二次升华干燥4～10h。
23.优选地，上述冷冻干燥的步骤包括：将在液氮中形成的微球于-50～60℃下进行第一次干燥10h后，在20～30℃下进行二次升华干燥6h。
24.进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述冻干保护剂包括海藻糖、peg20000和甘氨酸中的至少一种。
25.进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述冻干保护剂是通过质量分数为65～75％的海藻糖、质量分数为6～10％的甘氨酸以及质量分数为20～30％的peg20000按照体积比2:3:6混合所得。
26.进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述lamp反应基液包括：dna聚合酶、dntps、mgso4、显色剂、甜菜碱、ph调节剂、ddh2o和buffer。
27.进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述显色剂为酚红、甲酚或中性红。
28.第三方面，本技术提供一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的lamp检测试剂盒，试剂盒包括上述制备方法制得的冻干微球。
29.第四方面，本技术提供一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的lamp检测方法，其利用上述检测试剂盒进行检测，包括：
rrna，以此为靶点基因，运用在线引物设计软件(https://primerexplorer.jp/lamp3.0.0/index.html)设计lamp引物，进行分析和优化后，最终确定的引物序列如表1所示：
47.表1.检测唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的lamp引物序列
[0048][0049]
实施例2
[0050]
本实施例提供一种用于检测唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的冻干微球，其制备方法包括：
[0051]
(1)制备冻干保护剂：取70％海藻糖、8％的苏氨酸、25％的peg20000按照体积比2:3:6混合，得到冻干保护剂。
[0052]
(2)构建扩增反应体系：
[0053]
本实施例中构建的lamp检测扩增体系总体积为15μl，将如表2所示检测引物组与如表2所示的lamp反应基液混合，得到扩增反应体系。
[0054]
表2.扩增反应体系
[0055]
[0056][0057]
其中，buffer为100mmkcl、100mm(nh4)2so4、100mmmgso4、1％triton-100；
[0058]
显色剂为酚红、甲酚或中性红，优选为酚红。
[0059]
ph调节剂为tris-hcl或naoh，优选地，ph调节剂优选tris-hcl，naoh易受环境污染，从而改变扩增体系ph。
[0060]
(3)将步骤(2)得到的扩增反应体系与步骤(1)制得的冻干保护剂按照体积比15:11混合，逐滴滴入液氮中，控制每个液滴的体积为26μl，速冻成球后，将在液氮中形成的微球转移到冻干机中，于-50～60℃下进行第一次干燥10h后，在20～30℃下进行二次升华干燥6h，即得用于检测唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的冻干微球。
[0061]
实施例3建立lamp检测反应体系
[0062]
本实施例中构建的lamp检测反应体系总体积为26μl，具体包括：
[0063]
将实施例2制备的冻干微球加入26μl的水进行复溶，将从待测样品中提取的模板dna(2μl)加入到复溶后的反应体系中，在60～65℃下反应50～70min，进行lamp扩增；本实施例是在63℃下反应60min进行扩增的。
[0064]
结果判定：
[0065]
(1)目视法：直接观察颜色变化，从而判定lamp扩增的情况及样品中唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的存在与否，进而判断出检测样本中是否含有米酵菌酸毒素。当反应体系发生有效扩增时，反应体系由红色变为亮黄色，当未发生有效扩增时，反应体系保持红色。
[0066]
(2)恒温变色扩增法：可通过恒温变色扩增仪直接判读反应体系颜色变化，并可实时绘制颜色变化曲线，设定阈值，判读结果。
[0067]
实施例4样本检测
[0068]
本发明提供的试剂盒检测的真实样品，具体包括：
[0069]
(1)样本处理：用无菌操作取样品25g，加入盛有225ml增菌液的500ml三角瓶中(鲜银耳样品取1g，用剪刀剪碎，加入盛有20ml增菌液的100ml三角瓶中)放36
±
1℃培养48h。增菌后，取1ml增菌液，低速离心收集沉淀，加入200ul chelex100裂解液，震荡混匀，100℃煮
沸5min，取上清作为待测模板dna。
[0070]
(2)lamp扩增：将冻干微球加入26μl的水进行复溶，将2μl的模板dna加入到复溶后的反应体系中，在63℃下反应60min，进行lamp扩增。
[0071]
其中，该冻干微球通过将冻干保护剂和如表3所示的扩增反应体系混合，逐滴滴入液氮中速冻成球后，将在液氮中形成的微球于﹣50℃下进行第一次干燥10h后，在25℃下进行二次升华干燥6h，制备得到。
[0072]
表3.lamp反应体系
[0073]
组分名称浓度(μm)加入量(μl)外引物f3/b30.2μm0.1内引物fip/bip1.6μm0.4环引物lf/lb0.4μm0.2bst dna聚合酶8u1.5dntp1.4mm each3.5甜菜碱5m4显色剂8mm1ph调节剂0.6mm1.2buffer-2.5冻干保护剂-11加水补齐至-26
[0074]
其中，冻干保护剂为海藻糖、甘氨酸和peg2000按照体积比2：3：6混合所得。
[0075]
(3)结果判定：
[0076]
a.目视法判定：结果如图1所示，反应结束后直接观察反应体系颜色变化，当反应体系由红色变为亮黄色，说明成功发生了特异性扩增，待测样本中含有唐菖蒲伯克霍尔德氏菌。
[0077]
b.恒温变色曲线判定：结果如图2所示，检测到典型的扩增曲线，说明待测样本中含有唐菖蒲伯克霍尔德氏菌。
[0078]
实施例5灵敏度评价
[0079]
将唐菖蒲伯克霍尔德氏菌增菌液进行十倍梯度稀释后，浓度依次为：107cfu/ml、106cfu/ml、105cfu/ml、104cfu/ml、103cfu/ml、102cfu/ml、101cfu/ml按照实施例4的样本处理和反应体系对各稀释度唐菖蒲伯克霍尔德氏菌样本进行lamp检测，以确定检测方法的灵敏度。
[0080]
结果如图3和图4所示，其中管1～7的样品浓度依次为107cfu/ml、106cfu/ml、105cfu/ml、104cfu/ml、103cfu/ml、102cfu/ml、101cfu/ml，管8为阴性对照例。由图可以看出，管7和管8的颜色呈红色，没有变成亮黄色，而管1～7的颜色均变成了亮黄色。由此说明，将唐菖蒲伯克霍尔德氏菌增菌液进行10倍梯度稀释后，建立的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌恒温变色检测体系灵敏度可达到102cfu/ml。
[0081]
实施例6特异性评价
[0082]
将唐菖蒲伯克霍尔德氏菌和常见的食源性微生物(大肠杆菌o157：h7、志贺氏菌、单增李斯特氏菌、副溶血弧菌、溶血链球菌、沙门氏菌、蜡样芽胞杆菌、铜绿假单胞杆菌、黄
曲霉等)的基因组dna，按照实施例4的样本处理和反应体系对各稀释度唐菖蒲伯克霍尔德氏菌样本进行lamp检测，进行特异性实验。
[0083]
结果如图5所示，由图可以看出，只有唐菖蒲伯克霍尔德氏菌对应的反应体系颜色发生变化，出现典型的荧光扩增曲线，呈现阳性反应。
[0084]
实验例1
[0085]
对冻干保护剂的进行筛选：
[0086]
按照表3，配制扩增反应体系，再将扩增反应体系与如表4所示的冻干保护剂混合，其中，海藻糖的质量分数为70％、甘氨酸的质量分数为8％以及peg20000的质量分数为25％。逐滴滴入液氮中，控制每一滴的体积为26ul速冻成球后，将在液氮中形成的微球于﹣50～60℃下进行第一次干燥8～16h后，在20～30℃下进行二次升华干燥3～4h。
[0087]
表4.冻干保护剂的筛选配比
[0088][0089]
冻干结束后观察冻干微球的外形，如图6所示，从外观看，实验1～4得到的冻干微球外观饱满，没有萎缩现象。
[0090]
将得到的上述冻干微球加入复溶液进行复溶，实验1的复溶速度最快，且复溶期间没有气泡产生。
[0091]
实验例2
[0092]
对ph调节剂tris-hcl添加量的筛选：
[0093]
按照表3，将扩增反应体系与冻干保护剂混合，逐滴滴入液氮中速冻成球后，将在液氮中形成的微球于﹣50℃下进行第一次干燥10h后，在25℃下进行二次升华干燥6h，平行设置实验1(tris-hcl为0.6mmol/l)和实验2(tris-hcl为0.8mmol/l)，得到冻干微球1和冻干微球2。
[0094]
再将冻干微球1和冻干微球2分别复溶后，形成lamp反应体系，将来自待测样品中的模板dna与所述lamp反应体系混合，于63℃下反应60min，进行lamp扩增。
[0095]
结果如图7所示，当tris-hcl添加量为0.8mmol/l(见图7b)，反应前后的颜色对比更加明显。
[0096]
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的lamp检测引物组，其特征在于，所述检测引物组针对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的16s～23s rrna保守序列设计，所述检测引物组包括外引物f3、外引物b3、内引物fip、内引物bip、环引物lf和环引物lb；所述外引物f3的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述外引物b3的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述内引物fip的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述内引物bip的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述环引物lf的核苷酸序列如seq id no.5所示；所述环引物lb的核苷酸序列如seq id no.6所示。2.根据权利要求1所述的唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的lamp检测引物组，其特征在于，所述外引物f3和所述外引物b3的浓度均为0.15～0.25μm，所述内引物fip与所述内引物bip的浓度均为1.5～1.7μm，所述环引物lf和环引物lb的浓度为0.4～0.8μm。3.一种用于检测唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的冻干微球的制备方法，其特征在于，其包括：将如权利要求1或2所述的检测引物组与lamp反应基液混合，得到扩增反应体系；将所述扩增反应体系与冻干保护剂混合，逐滴滴入液氮中，控制每个液滴的体积为23～28μl，速冻成球后，冷冻干燥。4.根据权利要求3所述的冻干微球的制备方法，其特征在于，所述冷冻干燥的步骤包括：将在液氮中形成的微球于-50～60℃下进行第一次干燥8～16h后，在20～30℃下进行二次升华干燥4-10h。5.根据权利要求3所述的冻干微球的制备方法，其特征在于，所述冻干保护剂包括海藻糖、peg20000和甘氨酸中的至少一种。6.根据权利要求5所述的冻干微球的制备方法，其特征在于，所述冻干保护剂是通过质量分数为65％～75％的海藻糖、质量分数为6％～10％的甘氨酸以及质量分数为20％～30％的peg20000按照体积比2:3:6混合所得。7.根据权利要求3所述的冻干微球的制备方法，其特征在于，所述lamp反应基液包括：dna聚合酶、dntps、mgso4、显色剂、甜菜碱、ph调节剂、ddh2o和buffer。8.根据权利要求7所述的冻干微球的制备方法，其特征在于，所述显色剂为酚红、甲酚或中性红。9.一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的lamp检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求3～8任一项所述的制备方法制得的冻干微球。10.一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的lamp检测方法，其特征在于，其利用如权利要求9所述的检测试剂盒进行检测，包括：将所述冻干微球复溶后，形成lamp反应体系；将来自待测样品中的模板dna与所述lamp反应体系混合，于60～65℃下反应50～70min，进行lamp扩增。

技术总结
本发明公开了一种唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的LAMP检测引物组、试剂盒以及冻干微球的制备方法，属于核酸检测领域。该检测引物组针对唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的16S～23S rRNA保守序列设计，检测引物组包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物LF和环引物LB。包含这种检测引物组的冻干微球的制备方法包括：将上述检测引物组与LAMP反应基液混合，得到扩增反应体系；将扩增反应体系与冻干保护剂混合，逐滴滴入液氮中速冻成球后，冷冻干燥。这种检测方法，利用上述冻干微球，能够简单、高效的检测出唐菖蒲伯克霍尔德氏菌存在与否，进而判断出检测样本中是否含有米酵菌酸毒素，特异性强，不易出现假阳性。不易出现假阳性。不易出现假阳性。


技术研发人员：许世伟 许远 邵俊影 吴镇宇 王欣 林圣博
受保护的技术使用者：河南中检食安生物科技有限公司
技术研发日：2022.03.31
技术公布日：2022/5/25