一种用于检测棉花中17L397-1的核酸序列及其检测方法

一种用于检测棉花中17l397-1的核酸序列及其检测方法
技术领域
1.本发明涉及植物生物技术领域。具体的说，涉及一种用于检测棉花中17l397-1的核酸序列及其检测方法，特别是涉及一种产量性状改良和耐受草甘膦除草剂施用的转基因棉花事件中17l397-1和用于检测生物样品中是否包含特定转基因棉花事件中17l397-1的核酸序列及其检测方法。


背景技术：

2.棉花是世界上最重要的天然纤维作物，也是蛋白、油脂的重要来源。全球棉花种植面积约为4.9亿亩，产值超过500亿美元。中国、印度、美国等五国占总产的70％以上。其中美、澳等先进植棉国家，由于实现了全程机械化，其棉花产业具有极强的国际竞争力，引领着棉花产业的发展方向。
3.我国是棉花生产大国，全国约有1亿棉农，年种植棉花面积约6000～8000万亩，年产原棉450～560万吨，占世界产棉总量的25％左右。同时中国是世界最大的棉花进口国家，未来几年中国棉花进口预期继续猛增，中国官方媒体报告，近几年，中国每年棉花进口将猛增至大约700万公吨。原因是中国纺织和服装工业在蓬勃发展。因此通过生物技术提高我国棉花的产量，将对棉花种植业、棉纺业的发展起到极大的影响。
4.fca和aba脱落酸有高亲和性，立体专一性，而且符合受体动力学原理。aba的结合直接控制了fca介导的mrna前体的加工，fca是一个参与了rna代谢的aba受体。研究发现：将控制fca基因的rrm2结构域和耐除草剂基因g10-epsps转到受体中，得到的转化体均表现出品质性状改良和除草剂抗性等方面的明显改变，因此认为该方法可广泛应用于双子叶和单子叶作物的经济性状的改良。
5.田间杂草与作物竞争水、肥、光及生长空间，直接影响农作物产量与质量。同时许多杂草又是作物病原菌及害虫的中间寄主，是作物增产的重要生物限制因子之一。据联合国粮食与农业组织统计，全球因杂草导致的粮食生产损失每年高达950亿美元，相当于损失了3.8亿吨小麦，约合2009年全球小麦产量的半数以上。在950亿美元的经济损失中，贫困的发展中国家承受了大约700亿美元(fao.the lurking menace of weeds[j/ol].(http://www.fao.org/news/story/en/item/29402/icode/)，2009-08-11.)。因此，有效地控制田间杂草是促进粮食增产的重要措施之一。随着我国农村人口往城市迁移速度的加快，玉米种植的规模化和机械化是一个可预见的趋势，这使得传统的人工除草方式变得不现实。当前，市场上广泛应用的选择性除草剂施用量大，残留期长、容易影响下茬作物的正常生长。草铵膦等灭生性除草剂具有高效、低毒、易降解、无残留等特点。但它们除草没有选择性，不能直接用在作物的生长期。通过转基因技术培育耐该类灭生性除草剂的棉花可以克服这一难题。在棉花生长期喷施1-2次就能有效解决杂草问题，减少了除草剂的用量及投入成本。因此，耐除草剂转基因棉花具有非常广阔的应用价值和市场潜力。
[0006]
已知外源基因在植物体内的表达受到它们的染色体位置的影响，可能是由于染色质结构(如异染色质)或转录调节元件(如增强子)接近整合位点。为此，通常需要筛选大量
的事件才有可能鉴定出可以商业化的事件(即导入的目标基因得到最优表达的事件)。例如，在植物和其他生物体中已经观察到导入基因的表达量在事件间可能有很大差异；在表达的空间或时间模式上可能也存在差异，如在不同植物组织之间转基因的相对表达存在差异，这种差异表现在实际的表达模式可能与根据导入的基因构建体中的转录调节元件所预期的表达模式不一致，从而导致了转化事件在性状表现上存在差异。因此，通常需要产生成百上千个不同的事件并从这些事件中筛选出具有以商业化为目的所预期的转基因表达量和表达模式的单一事件。具有预期的转基因表达量和表达模式的事件可用于采用常规育种方法通过有性异型杂交将转基因渗入到其他遗传背景中。通过这种杂交方式产生的后代保持了原始转化事件的转基因表达特征。应用这种策略模式可以确保在许多品种中具有可靠的基因表达，而这些品种能很好地适应当地的生长条件。因此，需要对更多的转化事件进行性状鉴定和筛选，以获得综合性状表现优异，具有商业化前景的优异转化事件。
[0007]
能够检测特定事件的存在以确定有性杂交的后代是否包含目的基因将是有益的。此外，检测特定事件的方法还将有助于遵守相关法规，例如来源于重组农作物的食物在投入市场前需要获得正式批准和进行标记。通过任何熟知的多核苷酸检测方法来检测转基因的存在都是可能的，例如聚合酶链式反应(pcr)。这些检测方法通常集中于常用的遗传元件，例如启动子、终止子、标记基因等。因此，除非与插入的转基因dna相邻的染色体dna(“侧翼dna”)的序列是己知的，上述这种方法就不能够用于区别不同的事件，特别是那些用相同的dna构建体产生的事件。所以，目前常利用跨越了插入的转基因和侧翼dna的接合部位的一对引物通过pcr来鉴定转基因特定事件，具体地说是包含侧翼序列的第一引物和包含插入序列的第二引物。


技术实现要素：

[0008]
本发明的目的是提供一种产量性状优良和耐除草剂性状的优异棉花转化事件以及用于检测棉花中17l397-1的核酸序列及其检测方法。转基因棉花事件中17l397-1产量性状优良并对草甘膦除草剂具有较好的耐受性，且检测方法可以准确快速地鉴定生物样品中是否包含特定转基因棉花事件中17l397-1的dna分子。
[0009]
为实现上述目的，本发明使用pcambia1300/epsps-csrrm2表达载体，通过农杆菌介导的方法转化棉花自交系中棉所24，获得了13株阳性转化苗。并鉴定到一个产量性状和草甘膦除草剂耐受性均较好的转化事件中17l397-1，该事件比包含同样基因的转化事件icr24-397(申请号：201811442263.1)具有更佳的产量性状和对除草剂草甘膦的耐受性，因此中17l397-1能够用来改良棉花的产量和耐除草剂性状。
[0010]
为了表征中17l397-1的身份特征，本发明提供了一种核酸分子，所述核酸分子包含seq id no:1和/或seq id no:2所示序列，或其反向互补序列。
[0011]
进一步地，所述核酸序列包含seq id no:3和/或seq id no:4所示序列，或其反向互补序列。
[0012]
更进一步地，所述核酸序列包含seq id no:6和/或seq id no:7所示序列，或其反向互补序列。
[0013]
更进一步地，所述核酸序列包含seq id no:5所示序列或其反向互补序列。
[0014]
本发明还提供了用于检测棉花转化事件的探针，其特征在于，包括seq id no:1或
seq id no:2或seq id no:3或seq id no:4或seq id no:6或seq id no:7所示序列或其片段或其变体或其反向互补序列。
[0015]
本发明还提供了用于检测棉花转化事件的引物对，其特征在于，所述引物对的扩增产物包含seq id no:1或seq id no:2或seq id no:3或seq id no:4或seq id no:6或seq id no:7所示序列或其片段或其变体或其反向互补序列。
[0016]
在一些实施方案中，上述引物对为seq id no:8和seq id no:9所示的序列；或者seq id no:10和seq id no:11所示的序列。
[0017]
本发明还提供了用于检测棉花转化事件的试剂盒或微阵列，其特征在于，包含上述的探针和/或引物对。
[0018]
本发明还提供了检测棉花转化事件的方法，其特征在于，包括利用上述的探针或上述的引物对或上述的探针和引物对或上述的试剂盒或微阵列来检测待测样品中是否存在所述转化事件。
[0019]
本发明还提供了对棉花进行育种的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
[0020]
1)获得包含上述核酸分子的棉花；
[0021]
2)将步骤1)所获得的棉花通过花粉培养、未受精胚培养、加倍培养、细胞培养、组织培养、自交或杂交或以上的组合得到棉花植物、种子、植物细胞、后代植物或植物部分；以及任选地，
[0022]
3)对步骤2)所获得的后代植物进行产量性状和/或除草剂抗性鉴定，并利用上述的方法来检测其中是否存在所述转化事件。
[0023]
进一步的，本发明还提供了利用上述方法获得的棉花植物、种子、植物细胞、后代植物或植物部分制成的制品，包括食品、饲料或工业原料。
[0024]
所述seq id no:1为转基因棉花事件中17l397-1中在插入序列的5’末端位于插入接合部位附近的一个长度为22个核苷酸的序列，所述seq id no:1跨越了棉花插入位点的左侧翼基因组dna序列和插入序列的左边界5’末端的dna序列，包含所述seq id no:1或其反向互补序列即可鉴定为转基因棉花事件中17l397-1的存在。所述seq id no:2为转基因棉花事件中17l397-1中在插入序列的3’末端位于插入接合部位附近的一个长度为22个核苷酸的序列，所述seq id no:2跨越了插入序列的右边界3’末端的dna序列和棉花插入位点的右侧翼基因组dna序列，包含所述seq id no:2或其反向互补序列即可鉴定为转基因棉花事件中17l397-1的存在。
[0025]
本发明中，所述核酸序列可以为所述seq id no:3或其反向互补序列中转基因插入序列的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸(第一核酸序列)，或者为所述seq id no:3或其反向互补序列中5’左侧翼棉花基因组dna区域的任何部分的至少11个或更多个连续多核苷酸(第二核酸序列)。所述核酸序列进一步可以为同源于或反向互补于包含完整的所述seq id no:1或seq id no:6的所述seq id no:3的一部分。当第一核酸序列和第二核酸序列一起使用时，这些核酸序列在产生扩增产物的dna扩增方法中包括dna引物对。使用dna引物对在dna扩增方法中产生的扩增产物是包括seq id no:1或seq id no:3或seq id no:6或其反向互补序列的扩增产物时，可以诊断转基因棉花事件中17l397-1或其后代的存在。
[0026]
所述seq id no:3为转基因棉花事件中17l397-1中在插入序列的5’末端位于插入
或“基因组5’侧翼序列”等。当该侧翼区位于下游时，其也可以称为“右边界侧翼”或“3’侧翼”或“3’基因组侧翼区”或“基因组3’侧翼序列”等。
[0042]
引起外源dna的随机整合的转化程序会导致含有不同侧翼区的转化事件，所述不同侧翼区是每个转化事件所特异性含有的。当重组dna通过传统杂交被引入植物时，其侧翼区通常不会改变。转化事件也会含有异源插入物dna和基因组dna的段之间或两段基因组dna之间或两段异源dna之间的独特的接合。“接合”是两个具体的dna片段连接的点。例如，接合存在于插入物dna连接侧翼dna的位置。接合点还存在于转化的生物体中，其中两个dna片段以修饰自天然生物体中发现的方式的连接在一起。“接合dna”是指包含接合点的dna。
[0043]
本发明提供了称为中17l397-1的转基因棉花事件及其后代，所述转基因棉花事件中17l397-1即为棉花中17l397-1，其包括转基因棉花事件中17l397-1的植物和种子及其植物细胞或其可再生部分，所述转基因棉花事件中17l397-1的植物部分，包括但不限于细胞、花粉、胚珠、花、芽、根、茎、叶和来自棉花中17l397-1的产物，例如棉籽、棉籽油、棉衣、棉被、棉絮、棉布和留在棉花作物田间的生物量。
[0044]
本发明转基因棉花事件中17l397-1包含了一个dna构建体，当其在植物细胞内表达时，所述转基因棉花事件中17l397-1获得产量性状改良和/或草甘膦除草剂的耐受性。所述dna构建体包含一个表达盒，表达盒包含用于在植物中表达的适合的启动子和适合的多聚腺苷酸化信号序列，所述启动子可操作地连接具有细胞增大功能的csrrm2基因，所述csrrm2蛋白的核酸序列能提高棉花产量。所述dna构建体包含另一个表达盒，表达盒包含用于在植物中表达的适合的启动子和适合的多聚腺苷酸化信号序列，所述启动子可操作地连接编码5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(epsps)的基因g10-epsps，所述epsps蛋白的核酸序列对草甘膦除草剂具有耐受性。进一步地，所述启动子可以为从植物分离的适合启动子，包括组成型、诱导型和/或组织特异型启动子，所述适合启动子包括但不限于，花椰菜花叶病毒(camv)35s启动子、玄参花叶病毒(fmv)35s启动子、泛素蛋白(ubiquitin)启动子、肌动蛋白(actin)启动子、土壤农杆菌(agrobacterium tumefaciens)胭脂碱合成酶(nos)启动子、章鱼碱合成酶(ocs)启动子、夜香树属(cestrum)黄叶卷曲病毒启动子、马铃薯块茎储藏蛋白(patatin)启动子、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(rubisco)启动子、谷胱甘肽硫转移酶(gst)启动子、e9启动子、gos启动子、alca/alcr启动子、毛根农杆菌(agrobacterium rhizogenes)rold启动子和拟南芥属(arabidopsis thaliana)suc2启动子。所述多聚腺苷酸化信号序列可以为在植物中起作用的适合多聚腺苷酸化信号序列，所述适合多聚腺苷酸化信号序列包括但不限于，来源于土壤农杆菌(agrobacterium tumefaciens)胭脂碱合成酶(nos)基因的多聚腺苷酸化信号序列、来源于花椰菜花叶病毒(camv)35s终止子、来源于蛋白酶抑制剂ⅱ(pinⅱ)基因的多聚腺苷酸化信号序列和来源于α-微管蛋白(α-tubulin)基因的多聚腺苷酸化信号序列。
[0045]
此外，所述表达盒还可以包括其他的遗传元件，所述遗传元件包括但不限于，增强子和信号肽/转运肽。所述增强子可以增强基因的表达水平，所述增强子包括但不限于，烟草蚀刻病毒(tev)翻译激活因子、camv35s增强子和fmv35s增强子。所述信号肽/转运肽可以引导epsps蛋白转运到细胞外或者细胞内特定的细胞器或区室，例如，利用编码叶绿体转运肽序列靶向叶绿体，或者利用
‘
kdel’保留序列靶向内质网。
[0046]
培养具有产量性状改良特性和对草甘膦除草剂具有耐受性的转基因棉花事件中
17l397-1，通过以下步骤：首先使第一亲本棉花植物与第二亲本棉花植物有性杂交，从而产生了多样的第一代子代植株，所述第一亲本棉花植物由培育自转基因棉花事件中17l397-1及其后代的棉花植物组成，该转基因棉花事件中17l397-1及其后代是通过利用本发明的产量性状改良和对草甘膦除草剂具有耐受性的表达盒进行转化而得到的，第二亲本棉花植物缺乏产量性状改良特性或对草甘膦除草剂具有耐受性；然后选择对草甘膦除草剂具有耐受性的子代植株，可以培育出对草甘膦除草剂具有耐受性的棉花植物。这些步骤可以进一步包括使产量性状改良和草甘膦耐受的子代植株与第二亲本棉花植物或第三亲本棉花植物进行回交，然后通过用草甘膦除草剂施加或通过与性状相关的分子标记物(如包含转基因棉花事件中17l397-1中插入序列的5’端和3’端鉴定出的接合位点的dna分子)的鉴定来选择子代，从而产生产量性状改良特性和对草甘膦除草剂具有耐受性的棉花植物。
[0047]
还应理解的是，两种不同的转基因植物也可以杂交以产生含有两个独立的、分离式添加的外源基因的后代。适当后代的自交可以得到对两个添加的外源基因来说都是纯合子的后代植株。如前所述的对亲本植株的回交和与非转基因植物的异型杂交也是可以预期的，无性繁殖也是同样的。
[0048]
如本发明使用的，基本同源的序列是一段核酸分子，该核酸分子在高度严格条件下能够和相匹配的另一段核酸分子的互补链发生特异性杂交。促进dna杂交的适合的严格条件，例如，大约在45℃条件下用6.0
×
氯化钠/柠檬酸钠(ssc)处理，然后在50℃条件下用2.0
×
ssc洗涤，这些条件对本领域技术人员是公知的。例如，在洗涤步骤中的盐浓度可以选自低度严格条件的约2.0
×
ssc、50℃到高度严格条件的约0.2
×
ssc、50℃。此外，洗涤步骤中的温度条件可以从低度严格条件的室温约22℃，升高到高度严格条件的约65℃。温度条件和盐浓度可以都发生改变，也可以其中一个保持不变而另一个变量发生改变。优选地，本发明的一个核酸分子可以在中度严格条件下，例如在约2.0
×
ssc和约65℃下与seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6和seq id no:7中一个或多个核酸分子或其互补序列，或者上述序列的任一片段发生特异性杂交。更优选地，本发明的一个核酸分子在高度严格条件下与seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6和seq id no:7中一个或多个核酸分子或其互补序列，或者上述序列的任一片段发生特异性杂交。本发明中，优选的标记物核酸分子具有seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:6或seq id no:7或其互补序列，或者上述序列的任一片段。
[0049]
本发明另一优选的标记物核酸分子与seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:6或seq id no:7或其互补序列，或者上述序列的任一片段具有80％到100％或90％到100％的序列同一性。seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:6和seq id no:7可以用作植物育种方法中的标记物以鉴定遗传杂交的后代。探针与目标dna分子的杂交可以通过任何一种为本领域技术人员所熟知的方法进行检测，这些方法包括但不限于，荧光标记、放射性标记、抗体类标记和化学发光标记。
[0050]
基于dna扩增方法的dna检测试剂盒含有dna引物分子，它们在适当的反应条件下特异性杂交到目标dna上并扩增诊断性扩增子。试剂盒可提供基于琼脂糖凝胶的检测方法或者现有技术已知的检测诊断性扩增子的许多方法。含有与seq id no:3或seq id no:4的棉花基因组区的任何部分同源或反向互补的以及与seq id no:5的转基因插入区的任何部
分同源或反向互补的dna引物的试剂盒是本发明所提供的。特别地，鉴别在dna扩增方法中有用的引物对是seq id no:8和seq id no:9，其扩增与转基因棉花事件中17l397-1的5’转基因/基因组区的一部分同源的诊断性扩增子，其中扩增子包括seq id no:1。鉴别在dna扩增方法中有用的引物对还包括seq id no:10和seq id no:11，其扩增与转基因棉花事件中17l397-1的3’转基因/基因组区的一部分同源的诊断性扩增子，其中扩增子包括seq id no:2。用作dna引物的其它dna分子可选自seq id no:5。
[0051]
可以使用本发明所述的组合物和dna检测领域描述的或已知的方法来开发dna检测试剂盒。所述试剂盒有利于鉴定样品中是否存在转基因棉花事件中17l397-1的dna，还可以用于培育含有转基因棉花事件中17l397-1的dna的棉花植物。所述试剂盒可以含有dna引物或探针，其同源于或反向互补于seq id no:1、2、3、4、5、6或7的至少一部分，或含有其它dna引物或探针，其同源于或互补于dna的转基因遗传元件中所含的dna，这些dna序列可以用于dna扩增反应，或作为dna杂交方法中的探针。在棉花基因组中含有的以及在图1和表1中说明的转基因插入序列与棉花基因组结合部位的dna结构包含：位于转基因插入序列5’末端的棉花中17l397-1左侧翼基因组区域，来自第一个表达盒由2个串联的花椰菜花叶病毒的35s启动子(2
×
p35s)，可操作地连接到草甘膦抗性基因序列(g10-epsps)上，并可操作地连接到花椰菜花叶病毒的35s终止子(t35s)上而组成；第二个表达盒由花椰菜花叶病毒的35s启动子(p35s)，可操作地连接到细胞增大基因csrrm2上，并可操作地连接到胭脂碱合成酶基因终止子(tnos)上而组成，来自农杆菌的右侧边界区域(rb)的一部分插入序列，以及位于转基因插入序列3’末端的棉花中17l397-1右侧翼基因组区域(seq id no:5)。在dna扩增方法中，作为引物的dna分子可以是来源于转基因棉花事件中17l397-1中转基因插入序列的任何部分，也可以是来源于转基因棉花事件中17l397-1中侧翼棉花基因组的dna区域的任何部分。
[0052]
转基因棉花事件中17l397-1可以与其他转基因棉花品种组合，例如除草剂(如草甘膦、草铵膦等)耐受性的棉花，或携带抗虫基因的转基因棉花品种。所有这些不同转基因事件的各种组合，与本发明的转基因棉花事件中17l397-1一起育种，可以提供抗虫并抗多种除草剂的改良杂种转基因棉花品种。这些品种相比于非转基因品种和单性状的转基因品种可以表现出抗虫、多种除草剂抗性等更优异的特征。
[0053]
本发明提供了一种用于检测棉花植物的核酸序列及其检测方法，转基因棉花事件中17l397-1具有提高产量性状和耐受草甘膦除草剂的作用。该性状的棉花植株表达csrrm2蛋白和5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(epsps)蛋白，其赋予植物产量性状改良和对草甘膦的耐受性。同时本发明检测方法中seq id no:1或其反向互补序列、seq id no:2或其反向互补序列、seq id no:3或其反向互补序列、seq id no:4或其反向互补序列、seq id no:6或其反向互补序列、或者seq id no:7或其反向互补序列可以作为dna引物或探针以产生诊断为转基因棉花事件中17l397-1或其后代的扩增产物，且可以快速、准确、稳定的鉴定出来源于转基因棉花事件中17l397-1的植物材料的存在。
[0054]
虽然中17l397-1插入序列不完整，且品质性状相比对照没有显著提升，但是其草甘膦耐受能力更佳，产量性状更突出。这些特征使得中17l397-1这个转化体可以用来改良棉花的草甘膦除草剂耐受性和产量性状，从而培育高产耐除草剂的棉花新品种。
[0055]
下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
附图说明
[0056]
图1转基因插入序列与棉花基因组结合部位的结构示意图。
[0057]
图2重组表达载体pcambia1300/epsps-csrrm2的物理图谱。各元件英文及缩写含义列举如下：
[0058]
lb
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
农杆菌的t-dna左边界序列。
[0059]
t35s
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
花椰菜花叶病毒(camv)的35s终止子。
[0060]
g10-epsps
ꢀꢀꢀꢀ
编码epsps蛋白，解除草甘膦毒性。
[0061]
ch-l
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
信号肽
[0062]
p2
×
35s
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
串联的花椰菜花叶病毒(camv)的35s启动子。
[0063]
tnos
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
胭脂碱合成酶基因的终止子。
[0064]
csrrm2
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
csrrm2基因cds。
[0065]
p35s
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
花椰菜花叶病毒(camv)的35s启动子。
[0066]
rb
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
农杆菌的t-dna右边界序列。
[0067]
pvs1 sta
ꢀꢀꢀꢀꢀ
pvs1质粒的质粒稳定位点。
[0068]
pvs1 rep
ꢀꢀꢀꢀꢀ
pvs1质粒的复制起始位点。
[0069]
pbr322 bom
ꢀꢀꢀ
pbr322质粒的bom位点。
[0070]
pbr322 ori
ꢀꢀꢀ
pbr322质粒的复制起始位点。
[0071]
kanamycin(r)编码氨基糖苷磷酸转移酶蛋白，赋予细菌卡那霉素抗性。
[0072]
图3中17l397-1事件与受体对照中棉所24的产量性状表现。中棉所24：非转基因受体对照棉花植株；中17l397-1：中17l397-1转化事件棉花植株。a为叶片；b为幼铃；c为植株；d为成铃。
[0073]
图4中17l397-1事件与受体对照中棉所24植株的抗草甘膦除草剂的情况。中棉所24：非转基因受体对照棉花植株；中17l397-1：中17l397-1转化事件棉花植株。
[0074]
图5中17l397-1转化事件特异性pcr验证结果。m：marker，大小标注在旁(单位：bp)；n：空白对照；p：载体pcambia1300/epsps-csrrm2；c：受体对照中棉所24的基因组dna；t：含有中17l397-1转化事件的棉花材料基因组dna。a：左边界pcr片段预期大小295bp；b：右边界pcr片段预期大小445bp。
[0075]
图6southern杂交酶切和探针位置。
[0076]
图7中17l397-1目的基因csrrm2插入拷贝数的southern印记杂交图
[0077]
a：bamhi酶消化dna杂交图；b：ecori酶消化dna杂交图；c：探针位置及限制性内切酶的酶切位点，横线标示探针位置，竖线标示酶切位点。
[0078]
a1：dna marker，条带大小标注在旁，单位bp；
[0079]
a2：bamhi酶切质粒；
[0080]
a3：bamhi酶切中棉所24；
[0081]
a4：bamhi酶切中17l397-1；
[0082]
b1：dna marker，条带大小标注在旁，单位bp；
[0083]
b2：ecori酶切质粒；
[0084]
b3：ecori酶切中棉所24；
[0085]
b4：ecori酶切中17l397-1。
[0086]
图8中17l397-1目的基因g10-epsps插入拷贝数的southern印记杂交图
[0087]
a：bamhi酶消化dna杂交图；b：ecori酶消化dna杂交图；c：g10-epsps探针位置及限制性内切酶的酶切位点，横线标示探针位置，竖线标示酶切位点。
[0088]
a1：bamhi酶切质粒；
[0089]
a2：空白对照；
[0090]
a3：bamhi酶切中棉所24；
[0091]
a4：空白对照；
[0092]
a5：bamhi酶切中17l397-1；
[0093]
a6：dna marker，条带大小标注在旁，单位bp；
[0094]
b1：dna marker，条带大小标注在旁，单位bp；
[0095]
b2：ecori酶切质粒；
[0096]
b3：ecori酶切中棉所24；
[0097]
b4：空白对照；
[0098]
b5：ecori酶切中17l397-1。
[0099]
图9中17l397-1载体骨架
①
区和
④
区插入拷贝数southern印记杂交图
[0100]
a：bamhi酶消化dna杂交图；b：ecori酶消化dna杂交图；c：
①
区和
④
区的探针位置及限制性内切酶的酶切位点。
[0101]
a1：dna marker，条带大小标注在旁，单位bp；
[0102]
a2：bamhi酶切质粒；
[0103]
a3：空白对照；
[0104]
a4：bamhi酶切中棉所24；
[0105]
a5、a6：bamhi酶切中17l397-1；
[0106]
a7、a8：r1(探针
①
杂交区域内引物的pcr扩增产物)；
[0107]
a9、a10：r4(探针
④
杂交区域内引物的pcr扩增产物)；
[0108]
b1：dna marker，条带大小标注在旁，单位bp；
[0109]
b2：ecori酶切的质粒；
[0110]
b3：空白对照；
[0111]
b4：ecori酶切中棉所24；
[0112]
b5、b6：ecori酶切转化体中17l397-1；
[0113]
b7：r1(探针
①
杂交区域内引物的pcr扩增产物)；
[0114]
b8：r4(探针
④
杂交区域内引物的pcr扩增产物)。
[0115]
图10载体骨架
②
区和
③
区插入拷贝数southern印记杂交图
[0116]
a：bamhi酶消化dna杂交图；b：ecori酶消化dna杂交图；c：骨架2区和3区的探针位置及限制性内切酶的酶切位点。
[0117]
a1：dna marker，条带大小标注在旁，单位bp；
[0118]
a2：bamhi酶切的质粒；
[0119]
a3：空白对照；
[0120]
a4：bamhi酶切中棉所24；
[0121]
a5、a6：bamhi酶切中17l397-1；
[0122]
a7、a8：r2(探针
②
杂交区域内引物的pcr扩增产物)；
[0123]
a9、a10：r3(探针
③
杂交区域内引物的pcr扩增产物)；
[0124]
b1：dna marker，条带大小标注在旁，单位bp；
[0125]
b2：ecori酶切的质粒；
[0126]
b3：空白对照；
[0127]
b4：ecori酶切中棉所24；
[0128]
b5、b6：ecori酶切中17l397-1；
[0129]
b7：r2(探针
②
杂交区域内引物的pcr扩增产物)；
[0130]
b8：r3(探针
③
杂交区域内引物的pcr扩增产物)。
具体实施方式
[0131]
本技术涉及的转化事件中17l397-1是指以棉花自交系中棉所24为受体经过遗传转化后得到在特定基因组序列之间插入外源基因插入物(t-dna插入物)的棉花植株。在具体实施例中，转基因所用表达载体具有图2所示的物理图谱，所得到的t-dna插入物具有seq id no:5的第178-4096位核苷酸所示序列。转化事件中17l397-1可以指这一转基因过程，也可以指由这一过程所得到的基因组内的t-dna插入物，或t-dna插入物与侧翼序列的组合，或可以指由这一转基因过程得到的棉花植株。在具体实例中，该事件也适用于同样的表达载体转化其他受体品种，从而将t-dna插入物插入到同样基因组位置而获得的植物。转化事件中17l397-1还可以指由上述植物进行无性繁殖、有性繁殖、减倍或加倍繁殖或以上的组合而得到的后代植物。
[0132]
实施例1转化事件的获得和性状鉴定
[0133]
csrrm2基因是控制fca基因的rrm2结构域，与植物品质性状紧密相关；g10-epsps基因编码5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶，能提高植物对草甘膦除草剂的耐受能力。先前获得的转化事件icr24-397(申请号：201811442263.1)在转入上述两个表达盒后，具有了比受体更好的品质性状，icr24-397棉花的纤维长度、比强度和整齐度等都得到了显著的提升。然而，在鉴定除草剂耐受性时发现，当施用田间推荐浓度中量2倍的草甘膦时，icr24-397中有近10％的植株出现药害；施用田间推荐浓度中量4倍的草甘膦时，icr24-397中有近20％的植株出现药害。因此，icr24-397的抗除草剂表现并不是十分理想。
[0134]
为了获得除草剂耐性更加优秀的转化事件，本发明使用pcambia1300/epsps-csrrm2表达载体(载体物理图谱见图2，包含csrrm2基因表达盒和g10-epsps基因表达盒)，通过农杆菌介导的方法转化受体材料中棉所24，获得了13株阳性转化苗，并对这些转化苗的除草剂抗性和品质相关农艺性状做了筛选和鉴定。
[0135]
1、筛选抗除草剂性状优异的转化体
[0136]
以受体中棉所24和转化体icr24-397作为参照，通过田间喷施田间推荐浓度中量2倍的草甘膦的方法，从上述13株阳性转化苗筛选除草剂耐性较好的转化体。结果表明，仅3个转化事件(中17l397-1、中17l397-2和中17l397-3)对草甘膦除草剂的耐受能力显著高于对照，且不低于转化体icr24-397。
[0137]
随后，将上述4种棉花转化体和受体对照中棉所24的种子播种于河南省安阳市中国棉花所试验基地，通过田间喷施不同浓度的草甘膦，系统的鉴定了中17l397-1等转化体
的除草剂耐受性。同时，通过考察棉花纤维长度、整齐度、比强度等农艺性状的方法鉴定转基因棉花品质性状改良的有效性，并对中17l397-1、中17l397-2和中17l397-3这三个转化事件的插入位置做了鉴定和分析。
[0138]
2、除草剂耐受性鉴定
[0139]
于2018年夏季开展除草剂耐受性鉴定。在棉花苗期4～6片真叶时按照田间推荐浓度中量1倍(82g/亩)、2倍(164g/亩)和4倍(328g/亩)喷施草甘膦，一周后，受体对照棉花植株全部枯黄死亡，成苗率为0，药害率100％，而4个转化事件能够正常成苗，但表现出不同程度的药害率(表2)。当喷施田间推荐浓度中量2倍的草甘膦时，中17l397-1和中17l397-2的草甘膦耐受能力显著高于中17l397-3和icr24-397；当喷施田间推荐浓度中量4倍的草甘膦时，中17l397-1的草甘膦耐受能力显著高于其余3个转化体材料。因此，中17l397-1的草甘膦除草剂抗性表现最佳。
[0140]
表2 除草剂耐性表现
[0141][0142]
数值来自于3个生物学重复的平均值
±
标准差。统计分析使用lsd进行多重比较(α＝0.05)，不同字母表示相同除草剂浓度下同列数据差异显著性。
[0143]
3、分析中17l397-1、中17l397-2和中17l397-3在基因组上的插入位置
[0144]
取100mg植株叶片，液氮快速研磨后采用ctab法提取总dna。将检测合格的样品基因组dna用超声波片段化，然后对片段化的dna进行纯化、末端修复、3'端加a、连接测序接头。再用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，进行pcr扩增形成测序文库。质检合格的文库利用illumina nova测序平台对材料进行测序，测序深度为10
×
。将测序获得的raw data进行质量评估，获得过滤序列clean data，自主编写perl脚本将clean data的fq文件转换为fa格式，然后将过滤序列与棉花gh zm24-cri v1参考基因组序列(https://www.cottongen.org/blast/nucleotide/nucleotide)进行比对。定位过滤序列在参考基因组上的位置，获得外源插入片段插入位置信息。
[0145]
将中17l397-1、中17l397-2和中17l397-3的测序数据分别与参考基因组和外源t-dna序列进行比对，根据比对结果分为两类，第1类为一端序列(reads)比对上参考基因组序列，另一端序列(reads)比对上插入序列；第2类为两端中任何一端的一部分比对上参考基因组序列，另一部分比对上插入序列。用blast比对参考基因组，组装能比对上外源插入序列的全部reads。根据组装的contig使用blast分别比对外源插入序列和参考基因组，选取contig序列比对到染色体的区域，获得外源插入片段插入位置信息。随后，在插入位点左右边界处的基因组侧翼序列和外源插入序列上分别设计正向和反向引物，通过pcr扩增的方法对3个转化事件的插入位点进行了验证，并对pcr产物进行了测序分析。
[0146]
结果显示，3个转化体的外源片段分别整合到了基因组的不同位点，这些位点是棉花基因组基因间隔区，没有已知的功能基因。此外，中17l397-2和中17l397-3的外源序列的表达盒是完整的，而中17l397-1转化事件的载体边界序列在插入过程中发生了缺失，包括部分边界序列和终止子t35s的部分序列(详见表3)。通常，终止子的不完整会导致基因的异常转录和翻译，进而影响目标性状。然而出人意料的是，从除草剂抗性性状鉴定结果来看，中17l397-1转化事件的草甘膦耐性显著高于受体对照，且比icr24-397、中17l397-2和中17l397-3转化体更加突出。
[0147]
表3 外源片段插入位置信息
[0148][0149]
4、品质性状鉴定
[0150]
在棉花吐絮至最终收获期间调查了中17l397-1等转化体和受体对照的棉花纤维长度、整齐度和比强度等品质性状。结果显示，中17l397-1、中17l397-2和中17l397-3的棉花纤维长度、整齐度和比强度等品质性状相差不大，与受体对照中棉所24相比，并没有表现出显著的差异，且比icr24-397还弱。
[0151]
5、产量性状鉴定
[0152]
在对这几个转化体进行品质性状鉴定的同时，还对它们的其他性状(如籽棉重量、花蕾数、成铃数、单铃重、株高、第一果枝节位高度、果节数、果枝数和叶片大小等)做了详细的记录。在进行数据统计时意外的发现，中17l397-1籽棉总重量和单铃重不仅远高于受体对照，而且显著高于包括icr24-397在内的其他3个转化体(表4)，中17l397-1的株高、第一果枝节位高度在苗期、蕾期、花铃期和吐絮期也均显著高于受体对照(表5)
[0153]
表4 吐絮期籽棉产量
[0154][0155]
[0156]
数值来自于3个生物学重复的平均值
±
标准差。统计分析使用lsd进行多重比较(α＝0.05)，不同字母表示相同时期同列数据差异显著性。
[0157]
表5 主要农艺性状
[0158][0159]
数值来自于3次生物学重复的平均值
±
标准差。不同材料间的小写字母代表在α＝0.05水平下显著差异。
[0160]
以上结果表明，虽然中17l397-1插入序列不完整，且品质性状相比对照没有显著提升，但是其草甘膦耐受能力更佳，产量性状更突出。这些特征使得中17l397-1这个转化体可以用来改良棉花的草甘膦除草剂耐受性和产量性状，从而培育高产耐除草剂的棉花新品种。
[0161]
实施例2转化事件中17l397-1分子特征鉴定
[0162]
为了进一步明确转化事件中17l397-1的身份特征，本发明对中17l397-1外源序列在棉花基因组上插入位点的侧翼序列和插入拷贝数进行了分析。
[0163]
1、外源序列在棉花基因组上的插入位点侧翼序列分析
[0164]
如实施例1中所述，转化事件中17l397-1的外源t-dna序列正向插入棉花基因组chr a11:7085972或chr d11:6406857位置处。在插入位点的左边界，截取基因组上插入位点的上游500bp及t-dna序列上500bp，右边界则取基因组插入位点下游500bp及t-dna序列上500bp，利用ncbi网站的primerblast软件(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast)对截取的序列进行引物设计，扩增产物融合一部分棉花基因组序列和一部分t-dna序列。
[0165]
以转基因棉花株系基因组dna为模板，进行pcr扩增。pcr反应在20μl体系中进行。扩增循环程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，退火30s，72℃延伸一定时间(按产物片段大小设置)，35个循环；72℃延伸5min。
[0166]
根据侧翼序列和插入位置的结果利用基因组上游引物(seq id no:8)与载体左边界引物(seq id no:9)扩增以及载体右边界引物(seq id no:10)与基因组下游引物(seq id no:11)对中17l397-1转化事件进行pcr扩增，以验证外源片段插入位置。结果见图5。结果证明中17l397-1外源片段稳定插入到棉花基因组chr a11:7085972或chr d11:6406857位置处，插入序列大小为3919bp。
[0167]
通过分析左右侧翼的边界序列可知，外源序列的插入造成了受体基因组89bp的序列删除，同时载体序列也缺失了131bp。缺失的载体序列包括部分边界序列和终止子t35s的部分序列。
[0168]
2、外源序列的插入拷贝数分析
[0169]
采用southern印记杂交的方法确定外源序列拷贝数。southern杂交检测中选取在
t-dna区上且不在杂交区域的两个限制性内切酶消化基因组dna，则基因组中每个插入拷贝杂交后将显示为一个单一且特异的条带，基因组dna经过限制性内切酶酶切后，选取待测区域作为探针进行southern印记杂交实验。
[0170]
southern杂交选取bamhi和ecori两种酶消化阳性对照质粒、受体对照中棉所24以及中17l397-1基因组dna，并设计覆盖目的基因和全覆盖载体骨架序列的探针，探针和酶切位置示意图见图6。探针引物的具体序列见表6。
[0171]
表6 southern杂交试验探针扩增引物位置和序列
[0172][0173]
1：单位bp。
[0174]
目的基因csrrm2的插入拷贝数杂交检测选取bamhi和ecori两种限制性内切酶，分别酶切阳性对照质粒、阴性对照中棉所24基因组dna和中17l397-1基因组dna。跑胶转膜后用csrrm2基因探针标记，杂交结果见图7a、b所示。外源基因csrrm2的探针位置及限制性内切酶bamhi和ecori的酶切位点如图7c所示。从杂交结果看，csrrm2基因为单拷贝插入棉花基因组。
[0175]
目的基因g10-epsps的插入拷贝数杂交检测选取bamhi和ecori两种限制性内切酶，分别酶切阳性对照质粒、阴性对照中棉所24基因组dna和中17l397-1转化体基因组dna。跑胶转膜后用g10-epsps基因探针标记，杂交结果见图8a、b所示。目的基因g10-epsps的探针位置及限制性内切酶bamhi和ecori的酶切位点如图8c所示。g10-epsps基因也为单拷贝插入棉花基因组。
[0176]
同样的，载体骨架区southern杂交检测结果表明，载体骨架区序列未插入到棉花基因组中(见图9、图10)。
[0177]
实施例3转化事件中17l397-1的检测方法
[0178]
可由转基因棉花事件中17l397-1进行育种，并用育成的新品种生产诸如农产品或
商品。如果在所述农产品或商品中检测到足够的量，所述农产品或商品预期含有能够诊断转基因棉花事件中17l397-1材料在所述农产品或商品中存在的核苷酸序列。所述农产品或商品包括但不限于棉籽油、棉絮、棉被、棉布、棉衣以及将要作为食物源供动物消费的任何其它食品、或者另外作为膨大剂或化妆组合物中的成分用于化妆用途等。基于探针或引物对的核酸检测方法和/或试剂盒可以被开发以检测生物样品中诸如seq id no:1或seq id no:2所示的转基因棉花事件中17l397-1核苷酸序列，其中探针序列或引物扩增序列选自如seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:6和seq id no:7中所示的序列，以诊断转基因棉花事件中17l397-1的存在。
[0179]
其中一个检测方法为：利用pcr方法对两个中17l397-1植株中的特异性边界序列进行检测，所用的pcr引物对分别为seq id no:8、seq id no:9和seq id no:10、seq id no:11，pcr反应体系：
[0180][0181]
反应程序为：
[0182]
94℃，5min；(94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，30sec)
×
35循环；72℃，5min；4℃，5min。
[0183]
取pcr产物于1％(w/v)1
×
tae琼脂糖凝胶中电泳检测，结果见图5。中17l397-1转化事件中可以扩增得到预期的目标条带(分别为seq id no:6和seq id no:7)。而且该pcr方法能够追踪转化事件的存在，从而应用于育种工作。
[0184]
综上所述，本发明转基因棉花事件中17l397-1可提高棉铃产量并对草甘膦除草剂具有较高的耐受性，且检测方法可以准确快速的鉴定生物样品中是否包含转基因棉花事件中17l397-1的dna分子。
[0185]
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

技术特征：
1.一种核酸分子，其特征在于，包括如下任意一种：i)包含seq id no:1和/或seq id no:2所示序列，或其反向互补序列；ii)包含seq id no:3和/或seq id no:4所示序列，或其反向互补序列；iii)包含seq id no:6和/或seq id no:7所示序列，或其反向互补序列；iv)包含seq id no:5所示序列，或其反向互补序列。2.用于检测棉花转化事件的探针，其特征在于，包括seq id no:1或seq id no:2或seq id no:3或seq id no:4或seq id no:6或seq id no:7所示序列或其片段或其变体或其反向互补序列。3.用于检测棉花转化事件的引物对，其特征在于，所述引物对的扩增产物包含权利要求2所述的序列；任选地，所述引物对为seq id no:8和seq id no:9所示的序列；或者seq id no:10和seq id no:11所示的序列。4.用于检测棉花转化事件的试剂盒或微阵列，其特征在于，包含权利要求2所述的探针和/或权利要求3所述的引物对。5.检测棉花转化事件的方法，其特征在于，包括利用以下任一项来检测待测样品中是否存在所述转化事件：i)权利要求2所述的探针；ii)权利要求3所述的引物对；iii)权利要求2所述的探针和权利要求3所述的引物对；iv)权利要求4所述的试剂盒或微阵列。6.对棉花进行育种的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：1)获得包含权利要求1所述核酸分子的棉花；2)将步骤1)所获得的棉花通过花粉培养、未受精胚培养、加倍培养、细胞培养、组织培养、自交或杂交或以上的组合得到棉花植物、种子、植物细胞、后代植物或植物部分；以及任选地，3)对步骤2)所获得的后代植物进行产量性状的评估和/或除草剂的抗性鉴定，并利用权利要求5所述的方法来检测其中是否存在所述转化事件。7.由权利要求6的方法获得的棉花植物、种子、植物细胞、后代植物或植物部分制成的制品，包括食品、饲料或工业原料。8.一种保护棉花植物免受由除草剂引起的损伤的方法，其特征在于，包括将含有有效剂量草甘膦除草剂施加到种植至少一种转基因棉花植物的大田中，所述转基因棉花植物在其基因组中依次包含seq id no:1、seq id no:5第178-3842位核酸序列和seq id no:2，或者所述转基因棉花植物的基因组中包含seq id no:5；所述转基因棉花植物具有对草甘膦除草剂的耐受性。9.一种棉花植物产量性状改良的方法，其特征在于，包括种植至少一种转基因棉花植物，所述转基因棉花植物在其基因组中依次包含seq id no:1、seq id no:5第178-3842位核酸序列和seq id no:2，或者所述转基因棉花植物的基因组中包含seq id no:5；所述转基因棉花植物具有明显且稳定改良的产量性状。

技术总结
本发明涉及一种用于检测棉花中17L397-1的核酸序列及其检测方法，所述棉花中17L397-1的核酸序列包括SEQ ID NO:1所示序列或其反向互补序列、或者SEQ ID NO:2所示序列或其反向互补序列。本发明棉花中17L397-1具有产量性状改良和耐草甘膦除草剂的特性，且检测方法可以准确快速地鉴定生物样品中是否包含转基因棉花事件中17L397-1的DNA分子。1的DNA分子。1的DNA分子。


技术研发人员：王鹏 李付广 葛晓阳 秦文强 王晔 杨召恩 曾小林
受保护的技术使用者：中国农业科学院棉花研究所
技术研发日：2022.04.02
技术公布日：2022/5/25