一种中药化学成分肾毒性预测与评价方法

1.本发明涉及毒理学技术领域，具体涉及一种基于计算毒理学技术的中药化学成分肾毒性预测与评价方法。


背景技术：

2.现阶段，我国对中药毒性早期预测模型的相关研究尚在起步阶段，且多集中于肝毒性研究，对肾毒性研究报道较少。并且，虽然计算毒理学技术是体外毒性早期预测替代法的核心内容之一，但任何理论预测都离不开实验验证，计算毒理学研究亦是如此。而现阶段，肾毒性预测技术多只聚焦于纯粹的计算机算法，并没有后续生物学实验确证。然而，只有对毒性预测结果进行生物学实验，才能验证预测结果的准确性和可靠度。与此同时，应用单一化合物的毒性预测外推到实际环境的评价可能导致不可靠的结论。因此，将精准预测与有效评价联合的毒性发现与评价技术的建立对于中药的安全性研究具有重要意义。


技术实现要素：

3.针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种中药化学成分肾毒性预测与评价方法。
4.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
5.一种中药化学成分肾毒性预测与评价方法，具体过程为：
6.一、预测
7.首先收集来自西药不良反应数据库中的药物不良反应信息，所述药物不良反应信息主要包括有肾毒不良反应记录的化合物以及无肾毒不良反应记录的化合物；
8.另外通过查阅文献，找出文献收集的已知肾毒性的中药成分化合物；
9.利用pubchem下载从西药不良反应数据库收集到的有肾毒不良反应记录的化合物、无肾毒不良反应记录的化合物以及通过查阅文献收集的文献收集的已知肾毒性的中药成分化合物的sdf文件，然后建立这些化合物的数学模型训练集，并利用mold2软件对训练集中的每个化合物进行分子结构描述符计算，得到描述符矩阵数据；
10.利用得到的描述符，建立最优的中药肾毒性早期预测模型：
11.1)使用r软件对描述符，首先剔除在超过总数90％的化合物中计算值都为恒定值的描述符；在此基础上除去两两相关系数高于0.9的两个描述符中的一个,确保各个描述符之间没有严重的依赖关系；然后对余下的描述符之间存在的多元相关性进行剔除；
12.2)分子结构描述符筛选步骤：
①
利用bootstrap重采样方法将描述符数据分成训练集和测试集两类；
②
基于训练集数据,利用所有的描述符,构建预测模型,并对测试集数据进行预测评价,同时基于预测结果对参与构建预测模型的变量进行评价并排序；
③
选取不同个数的最重要描述符,并基于训练集数据利用随机森林算法构建模型,利用leave-10％-out方法交叉验证方法进行比较,选择最优模型用来对测试集数据进行预测评价；重复步骤
①
、
②
、
③
，统计分析不同个数的最重要描述符所构建模型的预测情况,并决定最优
描述符集以及最优的预测模型；
13.利用最优预测模型对《中华人民共和国药典》记录的有毒中药包含的化学成分进行肾毒性预测，初步预测得到具有肾毒性的化学成分；
14.二、评价
15.将hrgec细胞以8000个/孔的密度接种在96孔黑色透底培养板，于37℃、5％co2培养到对数期，实施评价时加入利用所述最优预测模型预测得到的具有肾毒性的化学成分处理hrgec细胞24h构成实验组；另外增加一个空白组，空白组中接种细胞不加药，48h后弃去原培养基，用pbs洗细胞，重复洗两次；将hoechst33342、green reagents及mitotrackertmred cmxros染料根据说明书用含10％fbs的dmem稀释至合适浓度的染料混合液，分别加入到实验组和空白组的细胞孔板内，37℃、5％co2培养箱中继续孵育45min后弃染料混合液，用pbs缓冲液清洗细胞2次，最后每孔加入100μl的pbs缓冲液上机检测；
16.采用gen5软件采集并分析图像：
17.选择20倍物镜，采集条件如下：第一通道波长为350/461nm检测hoechst33342标记的细胞核并记录细胞数目、细胞核内dna含量；第二道波长为485/520nm检测green reagents标记的ros；第三通道波长为579/599nm检测mitotrackertmred cmxros标记的线粒体膜电位；
18.运用gen5软件分析图像的荧光强度，其中细胞数目为第一通道的荧光数目，细胞核内dna含量为第一通道的荧光强度，ros为细胞质和细胞核中第二通道荧光强度，线粒体膜电位为细胞质内第三通道的荧光强度；
19.hoechst33342可穿过细胞膜，可结合于活细胞，因此用于活细胞标记；
20.cellrox oxidative stress reagents用来检测活细胞内活性氧ros；当处于还原态时无荧光或极弱荧光，一旦被氧化后发出强荧光。氧化自由基过度积累导致细胞膜中脂质过氧化使细胞膜的完整性和通透性发生改变、导致细胞中蛋白质多肽链断裂及诱发基因突变导致细胞凋亡；mitotrackertmred cmxros染料作为一种具有细胞通透性的x-rosamine衍生物能够特异性地标记细胞中具有生物活性的线粒体，检测线粒体膜电位；
21.ros可促进线粒体膜通透性转移孔开放，一方面导致线粒体内钙离子浓度升高，打破钙离子稳态，阻断呼吸链传递电子，使atp生成终止，能量代谢等发生改变导致线粒体功能紊乱，继而引发细胞凋亡；另一方面线粒体膜间隙的细胞色素c释放激活相关caspase蛋白，从而激活下游凋亡途径，导致细胞凋亡。因此，细胞膜完整性和通透性、线粒体膜电位(mmp)和氧化应激损伤等都可以作为高内涵检测受试物肾毒性的指标。
22.实验以空白组的相应参数为100％，实验组数值表示为相对于溶剂对照的百分数。实验数据以均数
±
标准差的形式表示，采用spss statistics 21统计软件对各组数据进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析进行统计处理，以p《0.05表示差异具有统计学意义。
23.进一步地，在预测模型的构建中，设定迭代次数为10次。
24.本发明的有益效果在于：本发明基于计算毒理学技术构建对中药化学成分的肾毒性进行预测的模型，并将构建肾毒性预测模型与高内涵分析肾小球内皮细胞毒性评价相结合，实现对含有潜在肾毒性成分的中药方剂进行预测与评价。本发明利用毒性替代方法，将
精准预测与有效评价相联合，成功发明了从模型构建-毒性测试-毒性评价的全景式动态中药肾毒性毒性发现与评价，致力于更科学、更精准、更全面地评价、降低和预防中药不良反应事件的发生，提高临床用药的安全性。
附图说明
25.图1为本发明实施例的方法原理示意图。
具体实施方式
26.以下将结合附图对本发明作进一步的描述，需要说明的是，本实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于本实施例。
27.本实施例提供一种中药化学成分肾毒性预测与评价方法，首先通过全面收集国内外有关中药化合物肾毒性数据，建立基于计算毒理学技术的中药肾毒性早期预测模型。同时本实施例构建基于高内涵分析技术的肾小球内皮细胞hrgec评价模型，模拟肾小球滤过屏障的关键成分和功能，用于评价中药肾毒性早期预测模型预测出的风险物质的肾毒性，在校正该模型预测准确率的基础上进一步对风险物质的毒性进行确认，形成全景式的中药化学成分肾毒性预测与评价方法。
28.如图1所示，所述方法的具体过程包括：
29.一、预测
30.首先收集来自西药不良反应数据库(side effect resource，sider)中的药物不良反应信息，所述药物不良反应信息主要包括有肾毒不良反应记录的化合物以及无肾毒不良反应记录的化合物。
31.另外通过查阅文献，找出文献收集的已知肾毒性的中药成分化合物；
32.利用pubchem下载从西药不良反应数据库收集到的有肾毒不良反应记录的化合物、无肾毒不良反应记录的化合物以及通过查阅文献收集的文献收集的已知肾毒性的中药成分化合物的sdf文件，然后建立这些化合物的数学模型训练集，并利用mold2软件对训练集中的每个化合物进行分子结构描述符计算，得到的描述符矩阵数据。
33.利用得到的描述符，建立中药肾毒性早期预测模型：
34.1)使用r软件对所有的2d描述符，首先剔除在超过总数90％的化合物中计算值都为恒定值的描述符；在此基础上除去两两相关系数高于0.9的两个描述符中的一个,确保各个描述符之间没有严重的依赖关系；然后对余下的描述符之间存在的多元相关性进行剔除。
35.2)分子结构描述符筛选步骤：
①
利用bootstrap重采样方法将描述符数据分成训练集和测试集两类；
②
基于训练集数据,利用所有的描述符,构建预测模型,并对测试集数据进行预测评价,同时基于预测结果对参与构建预测模型的变量进行评价并排序；
③
选取不同个数的最重要描述符,并基于训练集数据利用随机森林算法构建模型,利用leave-10％-out方法交叉验证方法进行比较,选择最优模型(准确率最高)用来对测试集数据进行预测评价；重复步骤
①
、
②
、
③
，统计分析不同个数的最重要描述符所构建模型的预测情况,并决定最优描述符集以及最优的预测模型；
36.本实施例利用最优预测模型对《中华人民共和国药典》记录的有毒中药包含的化学成分进行肾毒性预测，初步预测得到具有肾毒性的化学成分。
37.二、评价
38.将hrgec细胞以8000个/孔的密度接种在96孔黑色透底培养板，于37℃、5％co2培养到对数期，实施评价时加入利用所述最优预测模型预测得到的具有肾毒性的化学成分处理hrgec细胞24h构成实验组；另外增加一个空白组，空白组中接种细胞不加药，48h后弃去原培养基，用pbs洗细胞，重复洗两次。将hoechst33342、cellrox oxidative stress reagents及mitotrackertmred cmxros染料根据说明书用含10％fbs的dmem稀释至合适浓度的染料混合液，分别加入到实验组和空白组的细胞孔板内(100μl/孔)，37℃、5％co2培养箱中继续孵育45min后弃染料混合液，用pbs缓冲液清洗细胞2次，最后每孔加入100μl的pbs缓冲液上机检测。
39.采用gen5软件采集并分析图像：
40.选择20倍物镜，采集条件如下：第一通道波长为350/461nm检测hoechst33342标记的细胞核并记录细胞数目、细胞核内dna含量；第二道波长为485/520nm检测green reagents标记的ros；第三通道波长为579/599nm检测mitotrackertmred cmxros标记的线粒体膜电位(mmp)；
41.运用gen5软件分析图像的荧光强度，其中细胞数目为第一通道的荧光数目，细胞核内dna含量为第一通道的荧光强度，ros为细胞质和细胞核中第二通道荧光强度，线粒体膜电位(mmp)为细胞质内第三通道的荧光强度。
42.hoechst33342可穿过细胞膜，可结合于活细胞，因此用于活细胞标记；
43.cellrox oxidative stress reagents用来检测活细胞内活性氧ros；当处于还原态时无荧光或极弱荧光，一旦被氧化后发出强荧光。氧化自由基过度积累导致细胞膜中脂质过氧化使细胞膜的完整性和通透性发生改变、导致细胞中蛋白质多肽链断裂及诱发基因突变导致细胞凋亡；mitotrackertmred cmxros染料作为一种具有细胞通透性的x-rosamine衍生物能够特异性地标记细胞中具有生物活性的线粒体，检测线粒体膜电位；
44.ros可促进线粒体膜通透性转移孔开放，一方面导致线粒体内钙离子浓度升高，打破钙离子稳态，阻断呼吸链传递电子，使atp生成终止，能量代谢等发生改变导致线粒体功能紊乱，继而引发细胞凋亡；另一方面线粒体膜间隙的细胞色素c释放激活相关caspase蛋白，从而激活下游凋亡途径，导致细胞凋亡。因此，细胞膜完整性和通透性、线粒体膜电位(mmp)和氧化应激损伤等都可以作为高内涵检测受试物肾毒性的指标。
45.实验以空白组的相应参数为100％，实验组数值表示为相对于溶剂对照的百分数。实验数据以均数
±
标准差的形式表示，采用spss statistics 21统计软件对各组数据进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析(one-way anova)进行统计处理，以p《0.05表示差异具有统计学意义。
46.对于本领域的技术人员来说，可以根据以上的技术方案和构思，给出各种相应的改变和变形，而所有的这些改变和变形，都应该包括在本发明权利要求的保护范围之内。