一种用于分离牛肌肉干细胞的肌肉组织提取方法及其应用

1.本发明属于细胞工程技术领域，特别涉及一种用于分离牛肌肉干细胞的肌肉组织提取方法及其应用。


背景技术：

2.肌肉发育是影响家畜的生长速度、产肉量、肉质等重要经济性状的重要因素，而肌肉发育依赖于肌肉干细胞(muscle stem cells，muscs)的增殖、成肌纤维分化功能。muscs是一种来自中胚层的间充质干细胞，其功能在肌肉生成过程中影响成肌细胞的数量、肌管融合而调节肌纤维肥大。由此可见，muscs在畜牧业的家畜精准改良、干细胞育种、体内外养殖肉类生产等新兴研究领域中扮演越来越重要的角色。同时，muscs的肌纤维分化还与肌肉萎缩、肌肉损伤等疾病密切相关。因此深度剖析肌肉发育中muscs功能的调控机制，对于畜牧业的发展以及肌肉发育相关疾病的治疗具有重要的研究意义。
3.在遗传学中，超级增强子(super enhancer，se)是哺乳动物基因组的区域，其包含多个增强子，其由一系列转录因子蛋白共同结合，以驱动控制细胞身份基因的表达，从而在调控细胞命运中发挥重要作用。现有研究表明，在细胞转变过程中，se受到动态调节，是肿瘤发生、免疫功能和肌肉分化等生物过程中潜在关键调节剂，具有识别关键靶基因作用和介导mirna、lncrna生成的生物学功能。另一方面，circrna是se转录调控产生的超级增强子rna(serna)之一，使用se标记方法能够快速鉴定调节细胞身份的关键circrna。例如，骨骼肌细胞受到tnfα信号刺激下，增强子产生应答识别出控制代谢的基因；作为serna，circnifx是心脏再生的关键调节剂，是改善心肌梗死后心肌功能和预后的作用靶点(huang et al.2019)。在癌症领域中，破坏se结构直接靶向se组分的治疗策略已显示出良好治愈作用。
4.现有研究表明，在细胞分化过程中，染色质开放性的变化对基因表达具有调控作用。当se联合染色质开放区域时，可更好识别关键调控信息。因此，结合目前最新的atac-seq技术，分析se和染色质可及性交互修饰的区域，有助于筛选调控细胞功能关键基因。在肌肉发育中，有报道证实了casz1转录因子利用染色质可及性和se交互修饰区域直接找到调控骨骼肌发育的基因。而pax7也存在类似的现象，其通过启动子-增强子关联作用找到了可能调控三维染色质构象的se，预示染色质开放性在肌肉生成过程扮演着重要作用。
5.综上所述，se在细胞分化上具有重要的调控作用。然而，驱动牛muscs成肌纤维分化的se遗传景观有待被揭示；同时，se与serna在muscs的交互对话参与肌肉发育调控的机制有待被研究，且se在肌肉发育中是否具有调控染色质开放性的作用也有待被揭示。那么，在研究肌肉发育中muscs功能的调控机制时，需要将牛肌肉干细胞从牛肉肌肉组织中分离出来，然后构建肌肉干细胞增强启动子。


技术实现要素：

6.本发明目的在于提供一种提取牛肌肉组织的方法，所述牛肌肉组织用于分离牛肌
肉干细胞，该提取方法不同于以往单一使用磷酸盐缓冲液进行处理，本发明使用磷酸盐缓冲液、三蒸水、酒精联合处理，降低成本。
7.所述肌肉组织提取方法包括：(1)用70-80％酒精擦拭牛皮肤表面，然后采集牛背最长肌肌肉组织，立即放入35-38℃的磷酸盐缓冲液中漂洗至少一次，每次25-30s，并置于35-38℃的磷酸盐缓冲液浸润；(2)将所述牛背最长肌肌肉组织表面筋膜、白膜剔除干净；(3)其次将所述牛背最长肌肌肉组织使用三蒸水中漂洗至少一次，再置于磷酸盐缓冲液中漂洗至少一次，接着在70-80％酒精中漂洗15-20s，接着在磷酸盐缓冲液中漂洗至少一次得所述牛肌肉组织。
8.进一步，本发明目的在前述提取牛肌肉组织的方法的基础上提供一种分离牛肌肉干细胞的方法。所述方法可以将牛肌肉干细胞很有效的从牛肌肉组织中分离出来。
9.所述方法包括：(a)按照前述提取牛肌肉组织的方法提取牛肌肉组织，然后切成碎粒，再用35-38℃的磷酸盐缓冲液重悬、洗涤碎粒组织血丝，37℃恒温静置5min，去上清；(b)将所述切碎的牛肌肉组织制备成牛肌肉组织消化液；(c)将所述牛肌肉组织消化液分别使用70μm，40μm过滤器过滤组织液，离心收集细胞沉淀，并加入37℃磷酸盐缓冲液洗涤细胞以致进一步除去血丝，再次离心收集细胞沉淀得原代牛肌肉干细胞。
10.优选地，所述牛背最长肌肌肉组织来自胎牛。
11.优选地，所述胎牛为3-4月龄胎牛。
12.进一步，步骤(b)中，将所述切碎的牛肌肉组织制备成牛肌肉组织消化液，分成两步法进行：第一步，在胶原酶溶液中添加中性酶ⅱ，37℃、无菌摇床环境摇动消化；第二步，弃除胶原酶溶液，加入0.25％胰酶溶液，重悬混匀，37℃、无菌摇床环境摇动消化。
13.进一步，将所述原代牛肌肉干细胞进行原代培养，包括：将所述原代牛肌肉干细胞混匀、静置2h，再将上层细胞液继续培养，静置1-1.5h，再转移上层细胞液继续培养；在两次培养过程中，使用原代培养基，所述原代培养基包括：糖分含量为0.5-1.5g/l dmem基础培养基，19-21nm两性霉素,0.62-0.63mg/ml庆大霉素，95-105μl/ml青链霉素，胎牛血清，其体积比为39-40ml：0.1-1：0.1-1：0.1-1：9-11。
14.进一步，在所述原代培养后进行传代培养，包括：使用牛肌肉干细胞普通培养基进行培养，所述牛肌肉干细胞普通培养基包括：含量为0.5-1.5g/l dmem基础培养基，95-105μl/ml青链霉素，胎牛血清，其体积比为：44-45：0.1-1：4-6。
15.进一步，将所述传代培养结束后的牛肌肉干细胞使用磷酸盐缓冲液洗涤，然后使用成肌分化诱导培养基进行培养诱导所述牛肌肉干细胞成肌；所述成肌分化诱导培养基包括：糖分含量0.5-1.5g/l的dmem基础培养基，95-105μl/ml青链霉素，马血清，其体积比为48-49:0.1-1：0.5-1.5。
16.进一步，将上述牛肌肉干细胞进行成脂诱导：待牛肌肉干细胞汇合度达80％时，吸走培养液，磷酸缓冲液轻轻洗2次，换入成脂诱导液1，每三天换一次液；6d后，换入成脂诱导液2，每三天换一次液；12d后结束诱导，用油红o染色，染色前先弃液，随后磷酸缓冲液轻轻洗3次，4％多聚甲醛固定30min后弃液。
17.进一步，将上述牛肌肉干细胞进行成骨诱导：待牛肌肉干细汇合度为80％时，弃液，磷酸缓冲液轻轻洗2次，换入成骨诱导液，每三天换一次液；14d后结束诱导。
18.进一步，将上述牛肌肉干细胞进行成软骨诱导：待牛肌肉干细汇合度为80％时，弃
液，磷酸缓冲液轻轻洗2次，加入成软骨诱导液开始诱导，每三天换一次液体，诱导时间为21d。
19.本发明目的在于还提供一种牛肌肉干细胞超级增强子的构建方法，所述构建方法包括：(i)根据权利要求所述的方法获得所述牛肌肉干细胞；(ii)对所述肌肉干细胞进行染色质免疫共沉淀高通量测序，获得全基因组中不同染色体上构成增强子标记；(iii)依次使用h3k4me1 bed文件和h3k27ac bam文件的rose算法进行肌肉干细胞超级增强子鉴定，并对12.5kb范围内的h3k4me1结合峰进行缝合，获得构成增强子，之后通过h3k27ac bam文件计算每个构成增强子内的信号值，并基于h3k27ac信号值对构成增强子进行排序，获得所述牛肌肉干细胞超级增强子。
20.进一步，所述步骤(2)中，所述染色质免疫共沉淀高通量测序的数据进行质控，优化、综合reads读数数量、nsc值、rsc值及nrf值进行评价；选择tss及前后2k区域内存在reads读数；nsc》1.10，rsc》1.0；nrf》0.7的数据。
21.本发明有益效果在于：
22.本发明提供的提取牛肌肉组织的方法，所述牛肌肉组织用于分离牛肌肉干细胞，该提取方法不同于以往单一使用磷酸盐缓冲液进行处理，本发明使用磷酸盐缓冲液、三蒸水、酒精联合处理，降低成本。
23.本发明提供的牛肌肉干细胞超级增强子的构建基于肌肉干细胞体外分离培养技术体系进行建立，在染色体免疫共沉淀高通量数据基础分析上，使用h3k4me1、h3k27ac双标记方法，再通过rose编程工具绘制肌肉干细胞超级增强子遗传图谱，形成用于牛肌肉超级增强子分析的方法。并且，通过对超级增强子进行注释获得了超级增强子可能影响的信号通路及其调控基因，进一步获得肌肉干细胞超级增强子区域可能存在显著富集的转录因子，这些转录因子或成为超级增强子中发挥调控功能的重要组分。在超级增强子分析结果基础上，可将超级增强子与转录组测序数据结合，可进一步筛选受到超级增强子调控的基因，形成转录因子
→
超级增强子
→
关联基因的调控通路。
附图说明
24.图1为本发明实施例设计流程。
25.图2为牛肌肉干细胞分离培养与成肌分化诱导情况。
26.图3为牛肌肉干细胞的鉴定情况。
27.图4为牛肌肉干细胞成脂分化情况。
28.图5为牛肌肉干细胞成骨分化情况。
29.图6为牛肌肉干细胞成软骨分化情况。
30.图7为增殖细胞样本(gm)。
31.图8为肌肉干细胞完全成肌分化细胞样本(dm)。
32.图9为利用蛋白质免疫印迹(western blot，wb)分析细胞增殖标志基因的蛋白表达水平情况。
33.图10为利用rt-pcr分析细胞增殖标志基因、肌肉标志基因的rna表达水平。
34.图11为利用细胞免疫荧光技术分析肌肉标志基因myod1在完全成肌分化细胞样本(dm)的表达情况。
35.图12为reads区域分布情况。
36.图13为reads链互相关分析结果。
37.图14为超级增强子和普通增强子之间的阈值。
38.图15为超级增强子图谱分布
39.图16为超级增强子中心位置的前后5kb区域的分布情况。
40.其中，图2中，(a)为3月龄的黄牛胎儿；(b)为p0代肌肉干细胞；(c)为p1代肌肉干细胞；(d)为经过成肌诱导后，p2代肌肉干细胞能向成肌分化形成肌管。
41.其中，图3中，(a)为利用细胞免疫荧光技术检测间充质干细胞特异性表面抗原cd44的表达情况；(b)为肌肉干细胞向骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞分化情况；(c-d)利用rt-pcr检测特异性抗原基因、细胞多能性基因、骨细胞特异性基因、脂肪细胞特异性基因的表达情况。
42.其中，图15中，由外向内分别为：dm h3k27ac，dm h3k4me1，gm h3k27ac,gm h3k4me1。
具体实施方式
43.所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
44.本发明实施例，按照图1所示的流程进行实施例验证。
45.实施例1牛肌肉干细胞体外分离培养体系的建立
46.本发明实施例中，使用的50mlⅰ型胶原酶溶液(0.2％)的配方如表1所示。表1 50mlⅰ型胶原酶溶液(0.2％)配方一种低糖dmem基础培养基39ml(糖分含量：1.0g/l)一种中性酶ⅱ10ml(终浓度：1u/ml)一种胶原酶ⅰ1ml(终浓度：0.1mg/ml)
47.本发明实施例中，使用的50ml胰酶溶液(0.25％)的配方如表2所示。表2 50ml胰酶溶液(0.25％)配方磷酸盐缓冲液39ml胰酶10ml(终浓度：1u/ml)
48.本发明实施中，使用的50ml牛肌肉干细胞原代培养基的配方如表3所示。表3 50ml牛肌肉干细胞原代培养基配方一种低糖dmem基础培养基39.5ml(糖分含量：1.0g/l)两性霉素0.5ml(终浓度：20nm)庆大霉素0.5ml(终浓度：0.625mg/ml)青链霉素0.5ml(终浓度：100μl/ml)胎牛血清10ml
49.本发明实施例中，50ml牛肌肉干细胞普通培养基的配方如表4所示。表4 50ml牛肌肉干细胞普通培养基配方一种低糖dmem基础培养基44.5ml(糖分含量：1.0g/l)
青链霉素0.5ml(终浓度：100μl/ml)胎牛血清5ml
50.本发明实施例中，50ml牛肌肉干细胞成肌分化诱导培养基的配方如表5所示。表5 50ml牛肌肉干细胞成肌分化诱导培养基配方一种低糖dmem基础培养基48.5ml(糖分含量：1.0g/l)青链霉素0.5ml(终浓度：100μl/ml)马血清1ml
51.本发明实施例中，脂滴诱导液1的配方法：高糖dmem中10％fbs,1μg/ml dex,0.5mm ibmx,5μg/ml insulin即50ml体系：0.5ml双抗 5ml fbs 50μl dex 50μl ibmx 100μlinsulin 44.3ml dmem；脂滴诱导液2：高糖dmem中10％fbs,25μg/ml insulin，50ml体系：5ml fbs 500μl insulin 44.5ml dmem。
52.本发明实施例中，成骨诱导液、软骨诱导液均来自gibco公司。
53.本发明实施例中，油红o染液的制备为：用100ml异丙醇溶解0.5g油红干粉，得0.5％油红储存液，4℃，避光保存。
54.本发明实施例中，茜素红染液的制备为：量取100ml trise hcl将1.3692g茜素红充分溶解后过0.22μm微筛过滤除菌，4℃下保存备用。
55.本发明实施例中，阿尔新蓝染液的制备为：量取浓度为0.1m的盐酸溶液100ml，其中充分溶解阿尔新蓝1g，将ph调节至1.0，存放于4℃备用。
1.本发明实施中，选取黄牛3月龄胎儿上获得肌肉组织，经过胶原酶法分离获得p0代肌肉干细胞，经过传代培养、诱导成肌分化，情况如图2所示。
2.本发明实施例中，牛胎儿的选择及准备为：从屠宰场刚屠宰的雌性黄牛腹腔中采集3月龄胎牛，生理盐水清洗表面后立即放入37℃的高压灭菌处理后的生理盐水中，1-2h内运回实验室。
3.本发明实施例中，提取牛肌肉组织，其方法为：(1)用75％酒精擦拭胎牛皮肤表面，利用无菌眼科剪采集胎牛背最长肌肌肉组织，立即放入37℃的磷酸盐缓冲液中漂洗3次，每次30s，并置于37℃的磷酸盐缓冲液浸润备用。(2)在无菌超净台中，准备磷酸盐缓冲液、75％酒精、三蒸水。首先，用无菌镊子将肌肉组织表面筋膜、白膜剔除干净；其次，用镊子夹起肌肉组织进行漂洗，先在三蒸水中漂洗2次，再置于磷酸盐缓冲液中漂洗1次，接着在75％酒精中漂洗15-20s，接着在磷酸盐缓冲液中漂洗2次，然后将肌肉组织置于60mm细胞培养皿，用无菌眼科剪把组织剪成1mm3的肌肉组织碎粒备用。
4.本发明实施例中，将肌肉组织消化制备肌肉组织消化液，其方法为：(1)用37℃的磷酸盐缓冲液重悬肌肉组织碎粒并转移至50ml无菌细胞离心管，洗涤组织除血丝，在37℃环境中静置3-5min，接着弃上清液，加入37℃0.2％胶原酶ⅰ溶液完全浸润肌肉组织并重悬，将肌肉组织悬液置于37℃摇床消化50-60min。(2)接着，将肌肉组织悬液进行1200rpm离心5min，弃上清，加入0.25％胰酶完全浸润肌肉组织并重悬，将组织悬液置于37℃摇床消化20-30min得肌肉组织消化液。
5.本发明实施例中，原代肌肉干细胞悬液的制备为：将肌肉组织消化液中加入两倍体积的牛肌肉干细胞普通培养基终止消化，并进行过滤。先用70μm细胞过滤器进行过滤，再用40μm细胞过滤器进行过滤，接着将细胞悬液进行1200rpm离心3min，弃上清；加入37℃磷
酸盐缓冲液洗涤细胞以致进一步除去血丝，再次离心收集细胞沉淀，加入牛肌肉干细胞原代培养基重悬，即获得原代肌肉干细胞悬液。
6.本发明实施例中，肌肉干细胞的成肌诱导分化的步骤为：
7.(1)肌肉干细胞的原代培养：将原代肌肉干细胞悬液接种至培养皿中，摇匀，置于37℃、5％co2培养箱中静置2h，随即用移液枪将上层细胞悬液转移至新的培养皿，继续置于37℃、5％co2培养箱培养1-1.5h，之后再用移液枪将上层细胞悬液转移至新的培养皿，继续置于37℃、5％co2培养箱中培养；待细胞贴壁生长后，用磷酸盐缓冲液润洗2次，加入新的原代培养基继续培养；
8.(2)肌肉干细胞的传代培养：待肌肉干细胞生长至80％汇合度时，分别用磷酸盐缓冲液润洗肌肉干细胞2次，再0.25％胰酶进行消化2.5min，用牛肌肉干普通培养基进行终止消化，收集细胞悬液，1200rpm离心3min，弃上清，加入牛肌肉干细胞普通培养基重悬，接种至培养皿，置于37℃、5％co2培养箱中培养。
9.(3)肌肉干细胞的成肌诱导分化：取p1-p5代的肌肉干细胞进行成肌诱导分化。待肌肉干细胞生长至90％汇合度时，分别用磷酸盐缓冲液润洗肌肉干细胞2次，弃上清，加入牛肌肉干细胞成肌分化诱导培养基，每24h进行换液，连续换液4-5天。
10.本发明实施中，对获得的牛肌肉干细胞进行鉴定，利用细胞免疫荧光技术检测间充质干细胞特异性表面抗原cd44的表达，间充质干细胞不表达表面抗原是cd45；进一步证明肌肉干细胞具有多能性，分别对肌肉干细胞进行成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞诱导分化，表明，该细胞均能向骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞分化；收集肌肉干细胞增殖期样本，提取总rna后反转成cdna，利用rt-pcr检测特异性抗原基因、细胞多能性基因、骨细胞特异性基因、脂肪细胞特异性基因的表达；结果如图3所示，从结果看来，说明获得的肌肉干细胞具有干细胞特性，且所获得的细胞是肌肉干细胞，具有多向分化的细胞干性。
11.本发明实施例中，将牛肌肉干细胞成脂诱导和鉴定：待牛肌肉干细胞汇合度达80％时，吸走培养液，磷酸缓冲液轻轻洗2次，换入成脂诱导液1，每三天换一次液；6d后，换入成脂诱导液2，每三天换一次液；12d后结束诱导，用油红o染色，染色前先弃液，随后磷酸缓冲液轻轻洗3次，4％多聚甲醛固定30min后弃液，磷酸缓冲液再轻洗三次后用油红o工作液染色30min，最后用磷酸缓冲液轻洗三次去除多余染料并于光学显微镜下观察，并拍照记录，如图4所示。
12.本发明实施中，将牛肌肉干细胞成骨诱导和鉴定：待牛肌肉干细胞汇合度为80％时，弃液，磷酸缓冲液轻轻洗2次，换入成骨诱导液，每三天换一次液；14d后结束诱导，对其用茜素红染色，并在光学显微镜下观察，并拍照记录，如图5所示。
13.本发明实施例中，将牛肌肉干细胞成软骨诱导和鉴定：待牛肌肉干细胞汇合度为80％时，弃液，磷酸缓冲液轻轻洗2次，加入成软骨诱导液开始诱导，每三天换一次液体，诱导时间为21d。之后进行阿尔新蓝染色，并用光学显微镜观察、并拍照记录，如图6所示。
14.本发明实施例中，肌肉干细胞样本的制备为：
15.(1)增殖细胞样本(简称gm)制备:肌肉干细胞生长至80％汇合度时，用磷酸盐缓冲液润洗细胞2次，再0.25％胰酶进行消化2.5min，用牛肌肉干普通培养基进行终止消化，收集细胞悬液，1200rpm离心3min，弃上清，分别磷酸盐缓冲液洗涤和离心细胞3次，立即进行4％甲醛固定和细胞交联；如图7所示。
16.(2)完全成肌分化细胞样本(dm)制备:肌肉干细胞成肌分化成肌管后，用磷酸盐缓冲液润洗细胞2次，再0.25％胰酶进行消化2.5min，用普通培养基进行终止消化，收集细胞悬液，1200rpm离心3min，弃上清，分别磷酸盐缓冲液洗涤和离心细胞3次，立即进行4％甲醛固定和细胞交联；如图8所示。
17.本发明实施中，分别提取增殖细胞样本(gm)和完全成肌分化细胞样本(dm)的细胞蛋白，利用蛋白质免疫印迹(western blot，wb)分析细胞增殖标志基因的蛋白表达水平，结果如图9所示，结果显示，增殖标志基因pcna、cdk2在增殖细胞样本(gm)的蛋白水平显著高于完全成肌分化细胞样本(dm)。
18.本发明实施例中，分别提取增殖细胞样本(gm)和完全成肌分化细胞样本(dm)的细胞rna，利用rt-pcr分析细胞增殖标志基因、肌肉标志基因的rna表达水平，结果如图10所示，结果显示，增殖标志基因bcl-2和肌肉标志基因pax7在增殖细胞样本(gm)的rna表达水平显著高于完全成肌分化细胞样本(dm)，肌肉标志基因myod1、myog、myhc在完全成肌分化细胞样本(dm)的rna表达水平显著高于增殖细胞样本(gm)。
19.本发明实施例中，利用细胞免疫荧光技术分析肌肉标志基因myod1在完全成肌分化细胞样本(dm)的表达，结果如图11所示，结果表示，myod1呈阳性表达。
20.以上实施例结果均符合细胞样本表型预期，说明收集的肌肉干细胞增殖和完全成肌分化样本能用于下一步的超级增强子分析。
21.实施例2牛肌肉干细胞超级增强子方法的构建
22.本发明实施中，基于肌肉干细胞进行染色质免疫共沉淀高通量测序，获得全基因组中不同染色体上构成增强子标记，具体步骤为：
23.(1)构成增强子原始数据的获取
24.①
采用组蛋白h3的第四位赖氨酸残基甲基化(简称h3k4me1)、组蛋白h3的第27位赖氨酸残基乙酰化(简称h3k27ac)特异性抗体将细胞样本目的蛋白进行染色质免疫共沉淀反应，获得h3k4me1、h3k27ac标记蛋白所结合的基因组dna片段；
②
分别对dna片段进行纯化、富集；
③
分别对dna片段产物进行高通量测序；
④
原始下机bcl文件进行碱基识别(base calling)分析，转化为fastq格式的序列文件(raw data)，即获得构成增强子原始数据。
25.(2)构成增强子原始数据的序列比对分析
26.①
利用mutiqc、fastqc软件将超级增强子原始数据文件进行过滤，得到构成增强子有效数据(clean data)；
②
使用bowtie2软件分别对构成增强子有效数据进行参考基因组比对，产生构成增强子有效reads序列结果，计算比对率，比对结果为bam格式(binary alignment/map format)的二进制文件。本方法所选择参考基因组为bostau 9(ensembl version:bos_taurus.ars-ucd1.2.101)。结果如表6所示。表6构成增强子有效reads比对结果统计样本名称原始reads(％)比对reads(％)dm_k4_ip51,605,286(100.00％)49,024,055(95.00％)dm_k27_ip57,694,412(100.00％)54,852,348(95.07％)gm_k4_ip64,208,842(100.00％)60,864,752(94.79％)gm_k27_ip59,964,256(100.00％)56,175,000(93.68％)
27.(3)构成增强子有效reads的质量控制
28.采用reads在基因组各区域的分布情况、链互相关分析(strand cross-correlation，scc)及非冗余分数值(nonredundant fraction,nrf)三项指标对构成增强子有效reads质量进行评价。
29.①
统计、比对reads在转录起始位点(transcriptional start site，tss)区域及转录终止位点(transcription end site，tes)区域，要求tss(tes)及前后2k区域内存在reads读数；(读数越多，表明质控效果越好)；结果如图12所示。
30.②
计算reads互相关性(cross-correlation，cc)、标准化的链互相关系数(normalized strand coefficient，nsc)和相对链互相关系数(relative strand correlation，rsc)来评价scc指标，要求nsc》1.10，rsc》1.0；(nsc值越大、rsc值大于1，表明质控效果越好)；结果如图13所示。
31.③
计算reads的nrf值，要求nrf》0.7。(nrf值越接近于1.0，表明质控效果越好)nrf的计算公式如下：的计算公式如下：的计算公式如下：的计算公式如下：
32.(4)构成增强子有效reads信号的标记
33.采用integrative genomics viewer(igv)软件对bam文件进行分析，在全基因范围内标记构成增强子有效reads信号分布和峰值大小；峰值越大，信号越大。
34.(5)构成增强子的识别
35.①
采用macs2软件分别对构成增强子有效reads信号标记的基因组区域进行扫描(可信度参数：p value《0.05)；
36.②
计算所有扫描区域的平均长度，得到片段长度d；
37.③
根据片段长度d得到poisson分布的参数
38.④
根据poisson分布识别构成增强子在全基因上的结合位点，输出为结合位点注释文件(browser extensible data，简称bed文件)，而这些结合位点识别概率服从二项分布和fdr(false discovery rate)原则。
39.其中，n是标记区域read数目，p是置信概率，l是单个read的长度，s是染色质区段
的大小。例如，根据实验组(treatment)和对照组(control)分布，macs分析某碱基附近的染色质区段(如10k)，此时，上述公式中n表示相同reads信号标记在10k区间内的read数目，s被置为10k，针对特定read数目，可算出对应的置信概率p。macs对特定p计算了相应的fdr值，利用实验组(treatment)和对照组(control)的信息，fdr越小，表明构成增强子的识别可信度越高。
40.⑤
基于rose(rank ordering of super-enhancers)算法对基因组上12.5kb范围内h3k4me1标识的增强子结合位点进行缝合形成增强子区域，获得构成增强子信息，包括数目、染色体号、基因组位置、片段长度。
41.综上，通过构成增强子有效reads信号的标记，统计有效reads信号数量(统计峰的数量)；对目标区域进行扫描，得到峰片段长度d，计算峰的平均长度和总长度；并进一步标记目标区域的有效reads信号数量(也称为标记区域read数目)的结果如下表7所示。表7结合峰统计样本名称峰的数量峰的平均长度峰的总长度dm_k4_ip121,6701,716.73208,874,127dm_k27_ip89,0261,847.47164,472,566gm_k4_ip70,7201,499.71106,059,588gm_k27_ip131,6391,493.47196,598,846
42.实施例3构建牛肌肉干细胞超级增强子图谱
43.本发明实施例中，构建牛肌肉干细胞超级增强子图谱，具体步骤为：
44.(1)超级增强子的识别
45.①
基于rose算法对对基因组上每个增强子区域范围内h3k27ac标识的增强子结合位点计算各个构成增强子的h3k27ac信号值；
46.②
根据构成增强子的h3k27ac信号值，计算每个增强子区域的med1信号；
47.③
对增强子区域的med1信号排序，用坐标轴表示。例如，y轴上的med1富集度沿x轴排列，绘制获得一张曲线图，该曲线上斜率为1的切线的切点所得的信号值作为区分超强增强子和普通增强子之间的阈值，高于该值为超级增强子；结果如图14所示。
48.(2)超级增强子图谱的绘制
49.采用deep tools工具、基因组浏览器进一步对超级增强子数据进行可视化展示，并绘制超级增强子全基因分布图谱；结果如图15和图16所示。
50.最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围。

技术特征：
1.一种用于分离牛肌肉干细胞的肌肉组织提取方法，其特征在于，所述提取方法包括：(1)用70-80％酒精擦拭牛皮肤表面，然后采集牛背最长肌肌肉组织，立即放入35-38℃的磷酸盐缓冲液中漂洗至少一次，每次25-30s，并置于35-38℃的磷酸盐缓冲液浸润；(2)将所述牛背最长肌肌肉组织表面筋膜、白膜剔除干净；(3)其次将所述牛背最长肌肌肉组织使用三蒸水中漂洗至少一次，再置于磷酸盐缓冲液中漂洗至少一次，接着在70-80％酒精中漂洗15-20s，接着在磷酸盐缓冲液中漂洗至少一次得所述牛肌肉组织。2.一种分离牛肌肉干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：(a)按照权利要求1所述的肌肉组织提取方法提取牛肌肉组织，然后切成碎粒，再用35-38℃的磷酸盐缓冲液重悬、洗涤碎粒组织血丝，37℃恒温静置5min，去上清；(b)将所述切碎的牛肌肉组织制备成牛肌肉组织消化液；(c)将所述牛肌肉组织消化液分别使用70μm，40μm过滤器过滤组织液，离心收集细胞沉淀，并加入37℃磷酸盐缓冲液洗涤细胞以致进一步除去血丝，再次离心收集细胞沉淀得原代牛肌肉干细胞。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述牛背最长肌肌肉组织来自胎牛。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述胎牛为3-4月龄胎牛。5.根据权利要求2-4任一所述的方法，其特征在于，步骤(b)中，将所述切碎的牛肌肉组织制备成牛肌肉组织消化液，分成两步法进行：第一步，在胶原酶溶液中添加中性酶ⅱ，37℃、无菌摇床环境摇动消化；第二步，弃除胶原酶溶液，加入0.25％胰酶溶液，重悬混匀，37℃、无菌摇床环境摇动消化。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，将所述原代牛肌肉干细胞进行原代培养，包括：将所述原代牛肌肉干细胞混匀、静置2h，再将上层细胞液继续培养，静置1-1.5h，再转移上层细胞液继续培养；在两次培养过程中，使用原代培养基，所述原代培养基包括：糖分含量为0.5-1.5g/l dmem基础培养基，19-21nm两性霉素,0.62-0.63mg/ml庆大霉素，95-105μl/ml青链霉素，胎牛血清，其体积比为39-40ml：0.1-1：0.1-1：0.1-1：9-11。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述原代培养后进行传代培养，包括：使用牛肌肉干细胞普通培养基进行培养，所述牛肌肉干细胞普通培养基包括：含量为0.5-1.5g/l dmem基础培养基，95-105μl/ml青链霉素，胎牛血清，其体积比为：44-45：0.1-1：4-6。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将所述传代培养结束后的牛肌肉干细胞使用磷酸盐缓冲液洗涤，然后使用成肌分化诱导培养基进行培养诱导所述牛肌肉干细胞成肌；所述成肌分化诱导培养基包括：糖分含量0.5-1.5g/l的dmem基础培养基，95-105μl/ml青链霉素，马血清，其体积比为48-49:0.1-1：0.5-1.5。9.一种牛肌肉干细胞超级增强子的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：(i)根据权利要求2-8任一所述的方法获得所述牛肌肉干细胞；(ii)对所述肌肉干细胞进行染色质免疫共沉淀高通量测序，获得全基因组中不同染色体上构成增强子标记；(iii)依次使用h3k4me1 bed文件和h3k27ac bam文件的rose算法进行肌肉干细胞超级增强子鉴定，并对12.5kb范围内的h3k4me1结合峰进行缝合，获得构成增强子，之后通过h3k27ac bam文件计算每个构成增强子内的信号值，并基于h3k27ac信号值对构成增强子进行排序，获得所述牛肌肉干细胞超级增强子。
10.根据权利要求9所述的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述染色质免疫共沉淀高通量测序的数据进行质控，综合reads读数数量、nsc值、rsc值及nrf值进行评价；选择tss及前后2k区域内存在reads读数；nsc>1.10，rsc>1.0；nrf>0.7的数据。

技术总结
本发明属于细胞工程技术领域，特别涉及一种用于分离牛肌肉干细胞的肌肉组织的提取方法及其应用。所述方法包括：(1)用酒精擦拭牛皮肤表面后采集牛背最长肌肌肉组织，立即用磷酸盐缓冲液漂洗；(2)然后将表面筋膜、白膜剔除干净；(3)先使用三蒸水中漂洗，再依次使用磷酸盐缓冲液、酒精、磷酸盐缓冲液漂洗。该提取方法不同于以往单一使用磷酸盐缓冲液进行处理，本发明三种洗涤液联合处理，降低了成本。然后将提取的肌肉组织分离肌肉干细胞用于构建超级增强子，在染色体免疫共沉淀高通量数据基础分析上，使用H3K4me1、H3K27ac双标记方法，优化形成用于牛肌肉超级增强子分析的方法，不同于现有技术的单一标记。技术的单一标记。技术的单一标记。


技术研发人员：张瑞门 杨素芳 韦英明 梁菁媛 邓彦飞 郑自华 王乐怡 安强
受保护的技术使用者：广西大学
技术研发日：2022.03.31
技术公布日：2022/5/25