藤黄酸联合索拉非尼在制备肝癌治疗药物中的应用的制作方法

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及藤黄酸联合索拉非尼在制备肝癌治疗药物中的应用。


背景技术：

2.多靶点激酶抑制剂(包括索拉菲尼、伦伐替尼、多纳非尼等)和奥沙利铂系统化疗是现有的肝癌标准一线治疗，但客观缓解率仍不理想，5年生存率在常见癌症中最低。靶向药物的反跳致死反应和耐药性仍是现有肝癌治疗无法逾越的瓶颈问题，严重影响病人生存期的延长和生活质量的提升。中国肝癌患者异质性高，多以乙型肝炎逐步演变为肝癌，且合并有肝功能不良，严重影响治疗的反应和毒性。临床上有相当一部分的患者(约30％)，由于体质、肝功能及病情较晩较重等多种原因，不适合采用现有的靶向治疗、系统化疗及免疫治疗，缺乏标准的一线治疗方案和药物，存在着巨大的未被满足的临床需求。
3.肝癌病因复杂，只有以“组合拳”出击，联合用药，才能进一步提升治疗效果。已有多篇文献报道多靶点激酶抑制剂治疗肝癌能通过诱导线粒体自噬产生耐药；而藤黄属于清热解毒类中药，能降低线粒体功能和机体能量代谢速率，抑制线粒体自噬；因此联合应用藤黄酸和索拉非尼治疗肝癌，在机制上互相配合，阻止细胞代偿，可大大肝癌治疗效果。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供藤黄酸联合索拉非尼在制备肝癌治疗药物中的应用。
5.本发明发现天然产物藤黄中提取的藤黄酸(ga)联合肝癌一线靶向治疗药物索拉非尼(sorafenib)能显著抑制人肝细胞癌hepg2细胞的生长。通过mtt实验验证了较低浓度的藤黄酸可增强索拉非尼的肝癌生长抑制作用，提示这种联合给药方式在治疗肝细胞癌中的应用潜力。
附图说明
6.图1为藤黄酸联合索拉非尼对人肝细胞癌细胞株hepg2细胞增殖的影响结果。
具体实施方式
7.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。
8.本发明采用的试剂如下：
9.(1)藤黄酸(gambogic acid,c
33h44
o8，分子量：628.7512)由中国药科大学提供，黄色粉末，纯度95％，使用前用二甲亚砜(dmso)将药物粉末配制为0.01m母液，置于-80℃保存。
10.索拉非尼粉末购于csnpharm试剂公司，-20℃避光保存，使用前用无菌水配制为0.01m的母液，-80℃保存。
11.所有试剂临用前用含10％胎牛血清的rpmi-1640培养液配成所需浓度。
12.(2)细胞培养试剂
13.①
培养液：rpmi-1640培养基，购自美国gibco公司。取rpmi-1640粉末10.39g溶于1000ml灭菌三蒸水中，并加入2.0g nahco3，用1m盐酸调ph值至7.0，圆筒式过滤器过滤除菌、分装，4℃冰箱保存。使用前加入100u/ml的青霉素和100u/ml的链霉素。
14.②
胎牛血清：美国gibco公司产品。经56℃水浴灭活30min，分装并保存于-20℃低温冰箱中。
15.③
pbs缓冲液：称取nacl 8.0g、kcl 0.20g、na2hpo4·
h2o 1.56g、kh2po4.2.0g，溶于1000ml三蒸水中，高压灭菌，4℃冰箱保存。
16.(3)细胞生长活力抑制检测相关试剂
17.mtt粉末购自sigma-aldrich公司。
18.(3)细胞株
19.人肝细胞癌细胞株hepg2购自上海中国科学院细胞所。细胞均用含100u/ml青霉素、100mg/ml链霉素和10％胎牛血清的rpmi1640培养液培养。
20.实施例1
21.通过mtt实验测定藤黄酸(ga)联合索拉非尼(sorafenib)处理hepg2细胞48h的生长抑制作用
22.mtt溶液能够被活细胞内的线粒体脱氢酶还原为蓝紫色的结晶甲臜，dmso可溶解甲臜，形成的溶液颜色深浅与细胞活力成正比，据此可以检测细胞的活力。将细胞按照合适的细胞密度培养在96孔酶标板内，每孔内的细胞体积为100μl，待细胞贴壁且融合度达50％，吸去培养基，加入100μl指定浓度的ga和索拉非尼；将给过药物的细胞继续置于孵箱培养48h后，每孔加入20μl mtt溶液；继续孵育4h后将上清液移除，每孔加入100μldmso，置于微型振荡器振荡，待结晶完全溶解后，使用570nm波长检测其吸光度。将检测后的吸光值整理后按下面的公式计算药物对细胞的生长抑制率：
23.抑制率％＝(1-a
给药组
/a
对照组
)
×
100％。
24.通过mtt实验测定藤黄酸(ga)联合索拉非尼(sorafenib)处理hepg2细胞48h的生长抑制作用。实验结果如图1所示，单用组中sorafenib的ic50为4.66μm，联用组中sorafenib的ic50为1.34μm；联合sorafenib能显著提高对人肝细胞癌hepg2细胞的生长抑制作用。
25.如表1所示，与单用sorafenib相比，当0.8μm ga与较低剂量sorafenib(0.325、0.625和1.25μm)分别联用后，生长抑制率的增幅均呈现显著性差异，显示ga能显著增效较低浓度sorafenib对人肝癌hepg2细胞的生长抑制作用。
26.表1.ga联合索拉非尼对人肝细胞癌细胞株hepg2细胞增殖抑制作用
[0027][0028]
以上结果说明较低浓度的藤黄酸可增强索拉非尼的肝癌生长抑制作用，提示这种联合给药方式在治疗肝细胞癌中的应用潜力。


技术特征：
1.藤黄酸联合索拉非尼在制备肝癌治疗药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述肝癌治疗药物中藤黄酸和索拉非尼的摩尔比为0.8：0.325-5。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述肝癌治疗药物中藤黄酸和索拉非尼的摩尔比为0.8：0.325-1.25。

技术总结
本发明公开了藤黄酸联合索拉非尼在制备肝癌治疗药物中的应用，属于生物医药技术领域。本发明发现天然产物藤黄中提取的藤黄酸（GA）联合肝癌一线靶向治疗药物索拉非尼（sorafenib）能显著抑制人肝细胞癌HepG2细胞的生长。通过MTT实验验证了较低浓度的藤黄酸可增强索拉非尼的肝癌生长抑制作用，提示这种联合给药方式在治疗肝细胞癌中的应用潜力。联合给药方式在治疗肝细胞癌中的应用潜力。联合给药方式在治疗肝细胞癌中的应用潜力。


技术研发人员：魏立彬 郭青龙 周煜新 曹雪君 高源 葛展虹
受保护的技术使用者：南京芩康医药科技有限公司
技术研发日：2022.01.11
技术公布日：2022/5/25