一种紫外活性氧双响应门控肝癌细胞靶向纳米药物载体及其制备方法

1.本发明属于纳米药物载体材料领域，具体涉及一种紫外/活性氧双响应门控肝癌细胞靶向纳米药物载体及其制备方法。


背景技术：

2.癌症是因为人体在环境污染、化学污染、电离辐射、自由基毒素、微生物及其代谢毒素、遗传特性、内分泌失衡、免疫功能紊乱等各种致癌物质、致癌因素的作用下导致身体正常细胞发生癌变的结果。
3.近年来较高的发病率与死亡率，使得hcc(肝癌)成为严重威胁人类健康的疾病之一。化疗产生的毒副作用导致hcc的治疗受到限制。因此提高药物富集以及响应释放化疗方法是hcc治疗的迫切需求。经功能化修饰的纳米载药系统可通过改善化疗药物的体内分布，提高化疗药物的治疗选择性等方式。其中，使用多重刺激联用的策略可提高药物释放的可控性，避免药物在复杂的体内环境中提前释放的问题。
4.asgpr是肝癌细胞的细胞表面过量表达的糖蛋白受体，并且与gal、半乳糖胺等分子具有较强的亲和力，且研究发现，asgpr与gal分子的多价识别可以表现出更强的结合作用，更容易介导纳米粒子的内吞。因此提高纳米粒子表面的gal基的密度，是促进hcc细胞对纳米粒子摄取的一种可行方式。
5.靶向响应纳米载体是近年来研究的热点，设计一种高效的纳米载体，满足靶向、局部化疗和生物安全协同的要求，提升效率，减少副作用，这对肿瘤治疗具有重要意义。因此，本发明提出一种紫外/活性氧双响应门控肝癌细胞靶向纳米药物载体及其制备方法，该药物载体具有高的生物相容性、响应释放以及靶向特性，是提高肿瘤治疗效果的有效途径。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种紫外/活性氧双响应门控肝癌细胞靶向纳米药物载体的制备方法，利用层层结构化设计，获得一种紫外/活性氧双响应门控肝癌细胞靶向纳米药物载体，弥补了传统药物利用率低，毒副作用强的缺陷，解决了纳米材料肝癌靶向与响应释放的问题，达到高效治疗癌症的目的。
7.为了实现上述目的，所采用的技术方案为：
8.一种紫外/活性氧双响应门控肝癌细胞靶向纳米药物载体的制备方法，包括以下步骤：
9.(1)制备介孔二氧化硅；
10.(2)对所述的介孔二氧化硅进行氨基化修饰；
11.(3)对所述的步骤(2)得到的氨基化修饰后的介孔二氧化硅进行硫缩酮修饰；
12.(4)所述的步骤(3)得到的硫缩酮修饰的介孔二氧化硅负载抗癌药物；
13.(5)将所述的步骤(4)得到的负载抗癌药物的介孔二氧化硅进行环糊精修饰；
14.(6)再将紫外光响应的靶向聚合物链与所述的环糊精相连，得所述的紫外/活性氧双响应门控肝癌细胞靶向纳米药物载体。
15.进一步的，所述的步骤(1)中，介孔二氧化硅的制备方法为：
16.将ctac、超纯水、三乙醇胺混合，60℃搅拌1h，搅拌均匀后，再滴加20v/v％的teos/环己烷溶液，反应12h，然后用去离心洗涤、用6g/l的硝酸铵/乙醇溶液在60℃下搅拌12h，离心洗涤，真空干燥，得介孔二氧化硅的纳米颗粒。
17.进一步的，所述的步骤(3)中硫缩酮修饰的步骤为：将所述的氨基化修饰后的介孔二氧化硅溶于dmf中，加入dic、nhs，在n2保护后反应24h，依次用dmf、水洗涤，真空干燥；
18.所述的步骤(4)中，硫缩酮修饰的介孔二氧化硅与抗癌药物的质量体积比为20mg：3ml。
19.再进一步的，所述的步骤(3)中，所述的氨基化修饰后的介孔二氧化硅与dic、nhs的质量比为1:3-4：3-4；
20.所述的步骤(4)中，抗癌药物为抗癌药物dox。
21.再进一步的，所述的步骤(3)中，所述的氨基化修饰后的介孔二氧化硅与dic、nhs的质量比为1:4：4；
22.所述的步骤(4)中，抗癌药物dox浓度为1000μg/ml。
23.进一步的，所述的步骤(5)中偶联的步骤为：
24.将所述的负载抗癌药物的介孔二氧化硅分散于mes缓冲液中，加入edc、nhs，混匀后，预热至37℃，反应15min后，离心后分散于含有氨基化环糊精的pbs缓冲液中，搅拌反应12h。
25.再进一步的，所述的步骤(5)中，负载抗癌药物的介孔二氧化硅与edc、nhs、氨基化环糊精的质量比为1:4:6:1；
26.负载抗癌药物的介孔二氧化硅与mes缓冲液、pbs缓冲液的质量体积比为2g：2ml：1ml。
27.进一步的，所述的步骤(6)的步骤为：将靶向聚合物链加入所述的步骤(5)搅拌反应12h后的反应中，混匀后，搅拌反应12h。
28.再进一步的，所述的步骤(6)中，靶向聚合物链与所述的步骤(4)得到的负载抗癌药物的介孔二氧化硅的质量比为2:1。
29.本发明的另一个目的在于提供一种紫外/活性氧双响应门控肝癌细胞靶向纳米药物载体，采用上述的制备方法制备而成，是一种紫外/活性氧响应的靶向治疗肿瘤的纳米药物载体，gal在表面的修饰使其合成的纳米粒子可以具有靶向肝癌细胞的特点，靶向可以实现纳米粒子在肿瘤中的高效蓄积；提高了药物载体的生物相容性、可控释放性。
30.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
31.本发明技术方案紫外/活性氧双响应门控肝癌细胞靶向纳米药物载体的制备方法，具有以下的优点：
32.(1)改进氨基修饰的环糊精与硫缩酮的偶联方法更为有效而且与后续修饰靶向能够在一锅中进行。
33.(2)具有紫外活性氧双响应的特征。
34.(3)靶向半乳糖的修饰使得药物载体进行主动靶向，进一步提高了其在肿瘤部位
的聚集。本发明展现了提高载体生物相容性、可控释放以及在肿瘤部位的聚集，可用于肿瘤部位药物的递送。
35.(4)将肿瘤微环境的内部刺激与时间、空间可控性的外部刺激相结合，实现肿瘤细胞胞内的精确释放，提高化疗药物的治疗效率的同时，减少对正常组织的毒副作用。
附图说明
36.图1为实施例1中步骤(1)、(6)中纳米粒子修饰大分子前后透射电镜图，图比例尺为200纳米；
37.图2为实施例2中修饰过程中的表面电位变化情况；
38.图3为实施例3中红外光谱图；
39.图4为实施例4中纳米粒子粒径分布；
40.图5为实施例6中药物释放情况；
41.图6为实施例1中步骤(3)中纳米粒子的xps分析。
具体实施方式
42.为了进一步阐述本发明一种紫外/活性氧双响应门控肝癌细胞靶向纳米药物载体及其制备方法，达到预期发明目的，以下结合较佳实施例，对依据本发明提出的一种紫外/活性氧双响应门控肝癌细胞靶向纳米药物载体及其制备方法，其具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如后。在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。此外，一或多个实施例中的特定特征、结构或特点可由任何合适形式组合。
43.下面将结合具体的实施例，对本发明一种紫外/活性氧双响应门控肝癌细胞靶向纳米药物载体及其制备方法做进一步的详细介绍：
44.本发明将活性氧响应的硫缩酮与功能化氨基β-cd连接在介孔硅球表面为基础，并将合成的含azo与gal的聚合物主客体作用包裹于硅球表面，制备出具有肝癌靶向性、紫外/活性氧双响应的纳米系统msn-tk-cd/gap，纳米粒子表面由聚合物gap提供的高密度的gal可提高hepg2细胞对纳米粒子的摄取，药物在双重刺激下的控制释放，可进一步提高对肝癌的治疗效果。
45.肿瘤环境处于富氧化环境，活性氧含量是人体正常环境中的10-100倍，本发明利用这种微环境的特性接入响应物质，再结合靶向物质达到主动靶向的目的。
46.本发明的技术方案为：
47.一种紫外/活性氧双响应门控肝癌细胞靶向纳米药物载体的制备方法，包括以下步骤：
48.(1)制备介孔二氧化硅；
49.(2)对所述的介孔二氧化硅进行氨基化修饰；
50.(3)对所述的步骤(2)得到的氨基化修饰后的介孔二氧化硅进行硫缩酮修饰；
51.(4)所述的步骤(3)得到的硫缩酮修饰的介孔二氧化硅负载抗癌药物；
52.(5)将所述的步骤(4)得到的负载抗癌药物的介孔二氧化硅进行环糊精修饰；
53.(6)再将紫外光响应的靶向聚合物链通过主客体作用，与所述的环糊精相连，得所述的紫外/活性氧双响应门控肝癌细胞靶向纳米药物载体。
54.制备方法的过程为：先制备介孔二氧化硅，然后在其表面进行氨基化修饰，再将修饰后介孔二氧化硅表面的氨基与硫缩酮中的一个羧基偶联(硫缩酮含有双端羧基，即两个羧基)，然后将硫缩酮的另一个羧基与环糊精偶联，最后将靶向聚合物链通过主客体作用与环糊精相连。
55.优选的，所述的步骤(1)中，介孔二氧化硅的制备方法为：
56.将ctac、超纯水、三乙醇胺混合，60℃搅拌1h，搅拌均匀后，再滴加20v/v％的teos/环己烷溶液，反应12h，然后用去离心洗涤、用6g/l的硝酸铵/乙醇溶液在60℃下搅拌12h，离心洗涤，真空干燥，得介孔二氧化硅的纳米颗粒。
57.所述的teos必须为gc纯度，ctac纯度必须为99％，溶解后必须为浓稠胶状品质。
58.所述的反应温度必须为60℃
±
1。
59.所述步骤(1)所有药物纯度以及反应温度要严格遵守。在滴加teos/环己烷时磁子转速必须为150rpm。
60.优选的，所述的步骤(2)中氨基化过程需要控制体系中水量，试剂需要除水。
61.优选的，所述的步骤(3)中硫缩酮修饰的步骤为：将所述的氨基化修饰后的介孔二氧化硅溶于dmf中，加入dic、nhs，在n2保护后反应24h，依次用dmf、水洗涤，真空干燥；
62.所述的步骤(4)中，硫缩酮修饰的介孔二氧化硅与抗癌药物的质量体积比为20mg：3ml。
63.进一步优选的，所述的步骤(3)中，所述的氨基化修饰后的介孔二氧化硅与dic、nhs的质量比为1:3-4：3-4；
64.所述的步骤(4)中，抗癌药物为抗癌药物dox。
65.进一步优选的，所述的步骤(3)中，所述的氨基化修饰后的介孔二氧化硅与dic、nhs的质量比为1:4：4；
66.所述的步骤(4)中，抗癌药物dox浓度为1000μg/ml。
67.优选的，所述的步骤(5)中偶联的步骤为：
68.将所述的负载抗癌药物的介孔二氧化硅分散于mes缓冲液中，加入edc、nhs，混匀后，预热至37℃，反应15min后，离心后分散于含有氨基化环糊精的pbs缓冲液中，搅拌反应12h。
69.进一步优选的，所述的步骤(5)中，负载抗癌药物的介孔二氧化硅与edc、nhs、氨基化环糊精的质量比为1:4:6:1；
70.负载抗癌药物的介孔二氧化硅与mes缓冲液、pbs缓冲液的质量体积比为2g：2ml：1ml。
71.本发明(3)、(5)步骤的酰化反应设计能使得有机物更为有效快速的连接在无机载体表面。
72.优选的，所述的步骤(6)的步骤为：将靶向聚合物链加入所述的步骤(5)搅拌反应12h后的反应中，混匀后，搅拌反应12h。
73.进一步优选的，所述的步骤(6)中，靶向聚合物链与所述的步骤(4)得到的负载抗癌药物的介孔二氧化硅的质量比为2:1。
74.本发明说明书中的试剂为：
75.dic为n,n'-二异丙基碳二亚胺；edc为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸
盐)；nhs为n-羟基琥珀酰亚胺。
76.实施例1.
77.具体操作步骤如下：
78.(1)制备聚多巴胺掺杂的介孔二氧化硅(pda/msn)：
79.将25wt％的ctac(纯度99％)8ml、12ml超纯水、48μl三乙醇胺混合，60℃搅拌1h，搅拌均匀后，再用恒压漏斗滴加20v/v％的teos/环己烷溶液(teos纯度gc)，60℃反应12h，然后用去离心洗涤、用6g/l的硝酸铵/乙醇溶液60℃搅拌12h，来洗去ctac，最后离心洗涤，真空干燥得到介孔二氧化硅。
80.(2)氨基化介孔二氧化硅(msn-nh2)：
81.无水乙醇用醋酸调节ph到5，将150mg介孔二氧化硅分散于40ml乙醇醋酸溶液中，加入1gaptes后60℃搅拌24h，离心洗涤，得氨基化修饰后的介孔二氧化硅(msn-nh2)。
82.(3)硫缩酮修饰的介孔二氧化硅(msn-tk)：
83.将msn-nh2分散于dmf中，加入dic和nhs，n2保护后反应24h，dmf洗涤三次，水洗5次，真空干燥，得硫缩酮修饰的介孔二氧化硅(msn-tk)。
84.(4)制备负载抗癌药物dox的介孔二氧化硅(dox/msn-tk)：
85.将硫缩酮修饰的介孔二氧化硅的纳米粒子和抗癌药物dox加入到水中(纳米粒子、dox和水的质量比为1：1.5：1.5)，搅拌24h，得负载抗癌药物的介孔二氧化硅(dox@msn-tk)。
86.通过对上清液吸光度的测定，进一步定量负载的dox在纳米颗粒上的吸附量。
87.(5)环糊精偶联(msn-tk-cd)：
88.大分子环糊精与硅球上硫缩酮羧基偶联的制备方法：
89.制备0.1m mes缓冲液和0.1m pbs缓冲液。
90.先将步骤(4)中负载抗癌药物的介孔二氧化硅分散在mes缓冲液中，加入edc、nhs，超声30s，摇床预热到37℃，将上述反应液放置于摇床中震荡15min后快速离心，随后分散于含有氨基化环糊精的pbs中，继续搅拌12h。
91.负载抗癌药物的介孔二氧化硅与edc、nhs、氨基化环糊精的质量比为1:4:6:1。
92.(6)靶向配体偶联(dox@msn-tk-cd/gap)
93.将靶向聚合物链加入所述的步骤(5)搅拌反应12h后的反应中，超声3min，搅拌反应12h。
94.靶向聚合物链与步骤(4)得到的负载抗癌药物的介孔二氧化硅的质量比为2:1。
95.为了提高产品的保质期，4℃保存。
96.制备的纳米粒子悬液滴在硅片上烘干。修饰前的纳米粒子表面很多孔洞，而修饰后的纳米粒子表面被聚合物覆盖，证明了纳米粒子的成功合成。
97.对步骤(1)的介孔二氧化硅和步骤(6)得到的dox@msn-tk-cd/gap进行扫描电镜观察。结果如图1所示，左图为msn扫描电镜，尺寸范围200nm；右图为dox@msn-tk-cd/gap扫描电镜，尺寸范围200nm。
98.由图1可知，将左图与右图进行对比可知，右图上纳米粒子的表面上缝隙在完成大分子与靶向聚合物的修饰后明显更少和消失，说明纳米粒子的成功合成。
99.实施例2.
100.采用实施例1中步骤(1)-(6)的方法，
101.对制备的过程中纳米粒子表面电荷变化进行表征。
102.结果如图2所示，通过zeta电位的表征进一步展现了纳米粒子的制备过程中zeta电位不断变化，证明各个物质的成功修饰。
103.实施例3.
104.将实施例1制备过程中各个部分分开来测红外光谱，结果图3所示。
105.由图3可知，对比可以发现环糊精的修饰后明显的谱图变化。
106.实施例4：测定纳米粒子的粒径分布。
107.对实施例1制备的纳米粒子分散在pbs中24h后进行粒径分布测试，结果图4所示。
108.由图4可知，可见粒径分布呈正态分布，大部分纳米粒子在200纳米以内，符合高效利用纳米粒子的粒径大小，且纳米粒子可以在体液状态下实现稳定分布存在。
109.实施例5：测定纳米粒子药物释放效果。
110.对dox@msn-tk-cd/gap在不同环境的pbs溶液中进行释药的实验测试，结果如图5所示。
111.由图5可知，dox在紫外光、活性氧等不同环境中具有响应的释药效果。
112.实施例6：msn-tk的xps分析
113.采用实施例1步骤(3)制备的msn-tk进行xps分析，结果如图6所示。
114.由图6可知，在偶联硫缩酮后，纳米粒子表面出现s的特征峰，证明tk(硫缩酮)的成功偶联。
115.在本发明中，硫缩酮在二氧化硅表面的接枝和环糊精与硫缩酮的共价偶联是本发明的重点，本发明探究了不同的酰化方式对这两个反应的偶联效果。
116.在用edc、nhs连接介孔二氧化硅和硫缩酮的修饰后，纳米粒子在pbs和超纯水中不能稳定存在而快速聚集，则表明纳米粒子表面含有大量氨基正电荷导致在缓冲液中快速聚集，因此偶联不成功。在dic、nhs连接介孔二氧化硅和硫缩酮的修饰后，纳米粒子在pbs和超纯水中能稳定一段时间而不会立即产生聚集现象，则证明偶联成功。
117.在探究edc、nhs偶联有硫缩酮的二氧化硅和环糊精时候尝试了不同溶剂，在dmf、除氧超纯水、缓冲液中进行酰化反应进行偶联。在使用dmf和除氧超纯水进行反应后，再进行主客体修饰后在pbs中的分散效果明显差于缓冲液中进行的偶联反应。因此，此酰化反应的偶联方式采用mes缓冲液和pbs缓冲液充当反应介质。
118.本发明通过有效的酰胺化反应修饰上硫缩酮，然后高效快速修饰功能化环糊精，能够有效将疏水型抗癌药物封堵在孔道中与载体紧密结合，并在紫外光的照射下或者过活性氧存在的环境中产生响应释药的效果，这有利于在肿瘤的氧化环境中有效释放药物，并且同时可由紫外光控实现癌症组织的紫外/活性氧双控的药物释放治疗，减少载药载体的泄露情况，提升药物在体内的生物安全性。通过外层偶氮苯偶联肝癌靶向聚合物的修饰，在纳米粒子进入细胞后，紫外光照的情况下偶氮苯产生异构从环糊精中解离释放部分药物分子。通过偶氮苯单体与半乳糖单体的共聚随后修饰在纳米粒子表面来进行主动的靶向进一步提高了药物在肿瘤部位的聚集。
119.本发明建立在生物安全的基础上的同时，极大的提高了药物载体的生物相容性、在人体中的泄露问题。该纳米粒子不仅在包裹药物后不泄露，具有生物安全性、肝靶向的效果，并且给肿瘤氧化环境中的纳米粒子药物的定点释放做出新的方案。
120.以上所述，仅是本发明实施例的较佳实施例而已，并非对本发明实施例作任何形式上的限制，依据本发明实施例的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明实施例技术方案的范围内。

技术特征：
1.一种紫外/活性氧双响应门控肝癌细胞靶向纳米药物载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备介孔二氧化硅；(2)对所述的介孔二氧化硅进行氨基化修饰；(3)对所述的步骤(2)得到的氨基化修饰后的介孔二氧化硅进行硫缩酮修饰；(4)所述的步骤(3)得到的硫缩酮修饰的介孔二氧化硅负载抗癌药物；(5)将所述的步骤(4)得到的负载抗癌药物的介孔二氧化硅进行环糊精修饰；(6)再将紫外光响应的靶向聚合物链与所述的环糊精相连，得所述的紫外/活性氧双响应门控肝癌细胞靶向纳米药物载体。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(1)中，介孔二氧化硅的制备方法为：将ctac、超纯水、三乙醇胺混合，60℃搅拌1h，搅拌均匀后，再滴加20v/v％的teos/环己烷溶液，反应12h，然后用去离心洗涤、用6g/l的硝酸铵/乙醇溶液在60℃下搅拌12h，离心洗涤，真空干燥，得介孔二氧化硅的纳米颗粒。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(3)中硫缩酮修饰的步骤为：将所述的氨基化修饰后的介孔二氧化硅溶于dmf中，加入dic、nhs，在n2保护后反应24h，依次用dmf、水洗涤，真空干燥；所述的步骤(4)中，硫缩酮修饰的介孔二氧化硅与抗癌药物的质量体积比为20mg：3ml。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(3)中，所述的氨基化修饰后的介孔二氧化硅与dic、nhs的质量比为1:3-4：3-4；所述的步骤(4)中，抗癌药物为抗癌药物dox。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(3)中，所述的氨基化修饰后的介孔二氧化硅与dic、nhs的质量比为1:4：4；所述的步骤(4)中，抗癌药物dox浓度为1000μg/ml。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(5)中偶联的步骤为：将所述的负载抗癌药物的介孔二氧化硅分散于mes缓冲液中，加入edc、nhs，混匀后，预热至37℃，反应15min后，离心后分散于含有氨基化环糊精的pbs缓冲液中，搅拌反应12h。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(5)中，负载抗癌药物的介孔二氧化硅与edc、nhs、氨基化环糊精的质量比为1:4:6:1；负载抗癌药物的介孔二氧化硅与mes缓冲液、pbs缓冲液的质量体积比为2g：2ml：1ml。8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(6)的步骤为：将靶向聚合物链加入所述的步骤(5)搅拌反应12h后的反应中，混匀后，搅拌反应12h。9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述的步骤(6)中，靶向聚合物链与所述的步骤(4)得到的负载抗癌药物的介孔二氧化硅的质量比为2:1。
10.一种紫外/活性氧双响应门控肝癌细胞靶向纳米药物载体，其特征在于，采用权利要求1-9任一项所述的制备方法制备而成。

技术总结
本发明为一种紫外/活性氧双响应门控肝癌细胞靶向纳米药物载体及其制备方法。一种紫外/活性氧双响应门控肝癌细胞靶向纳米药物载体的制备方法，包括以下步骤：(1)制备介孔二氧化硅；(2)对所述的介孔二氧化硅进行氨基化修饰；(3)进行硫缩酮修饰；(4)负载抗癌药物；(5)进行环糊精修饰；(6)再将紫外光响应的靶向聚合物链与所述的环糊精相连，得所述的紫外/活性氧双响应门控肝癌细胞靶向纳米药物载体。本发明所述的一种紫外/活性氧双响应门控肝癌细胞靶向纳米药物载体及其制备方法，利用层层结构化设计，弥补了传统药物利用率低，毒副作用强的缺陷，解决了纳米材料肝癌靶向与响应释放的问题，达到高效治疗癌症的目的。达到高效治疗癌症的目的。达到高效治疗癌症的目的。


技术研发人员：杨盛超 杨怡平 崔林 刘志勇 吴建宁 孟桂花
受保护的技术使用者：石河子大学
技术研发日：2022.02.17
技术公布日：2022/5/25