一种非洲猪瘟病毒一体式检测系统及其检测方法

1.本发明属于生物医药技术领域，涉及病毒检测设备的制造，涉及一种非洲猪瘟病毒一体式检测系统及其检测方法。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.据发明人研究了解，目前非洲猪瘟病毒(asfv)主要为实验室诊断方法，血清学检测方法是一种常规的实验室诊断方法，然而该方法诊断周期长，在时间上具有一定的滞后性，无法对早期asfv感染做出诊断，即病毒感染早期检出率低；另外它们对实验室生物安全防护措施、实验操作条件和实验设备要求较高，并对操作人员具有一定的技术要求。常规pcr和实时pcr用于对asfv遗传物质dna的生物体外扩增，均具有速度快、灵敏度高、特异性好等特点，广泛应用于asf的早期诊断和监测。然而，由于pcr技术需要经历高温变性、低温退火、中温延伸三个热循环步骤，高度依赖电源和精密的温控装置，因此受到电力、成本、空间和检测速度的限制，无法在实验室外进行实时现场检测。


技术实现要素：

4.为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种非洲猪瘟病毒一体式检测系统及其检测方法，在疑似疫情出现的地区对病原体进行快速精确诊断。
5.为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
6.一方面，一种非洲猪瘟病毒一体式检测系统，包括：
7.荧光反应和检测单元，对非洲猪瘟病毒的dna分子进行重组酶介导等温扩增(rra)，同时对扩增后产生的荧光进行实时检测；
8.加热和温控单元，对荧光反应和检测单元进行加热和温控，使得重组酶介导等温扩增过程的酶保持活性；
9.信号处理单元，对荧光反应和检测单元输出的荧光信号和加热和温控单元输出的温度信号进行数字化处理。
10.本发明利用rra方法来实现非洲猪瘟病毒的dna分子在生物体外的大量扩增，这种方法仅需要保持一种温度就可以到达与pcr相同的核酸扩增效果。本发明通过设置加热和温控单元，保持rra反应过程中的酶的活性，从而保证rra的效率。通过信号处理单元不仅对荧光信号进行数字化处理，而且通过信号处理单元能够控制反应试剂的用量和反应温度的变化，从而极大地提高了整个检测实验的灵敏度和准确性。
11.为了避免样品中其他病毒影响检测结果，荧光反应和检测单元设置富集和提纯装置，所述富集和提纯装置内设置免疫磁探针，所述免疫磁探针由磁珠与非洲猪瘟病毒抗体连接形成。通过设置免疫磁探针，能够可以在现场提取的检测样本溶液中与非洲猪瘟病毒
通过抗原-抗体反应特异性结合，并在外加磁场的吸引下作定向移动，从而达到分离、提纯非洲猪瘟病毒的目的。
12.为了保证rra的进行，需要从非洲猪瘟病毒中将目标dna分离出来，荧光反应和检测单元设置dna分子提取装置，所述dna分子提取装置内设置超顺磁纳米微球，所述超顺磁纳米微球表面进行羧基功能化。dna分子能够吸附在羧基功能化超顺磁纳米微球表面，在外加磁场的作用力下，能够将其他杂质与dna分子分离，从而获得纯净的asfv核酸分子。
13.为了更好的实现rra，荧光反应和检测单元设置dna扩增装置，所述dna扩增装置设置特异性引物、荧光探针、重组酶、单链dna结合蛋白和dna聚合酶，所述特异性引物能够与非洲猪瘟病毒的dna特异性结合，然后通过重组酶、单链dna结合蛋白和dna聚合酶进行rra，并通过荧光探针产生荧光信号。
14.另一方面，一种非洲猪瘟病毒的检测方法，提供上述非洲猪瘟病毒一体式检测系统，将从猪提取的样品加入至荧光反应和检测单元，通过加热和温控单元与信号处理单元控制荧光反应和检测单元的处理温度，荧光反应和检测单元将处理产生的荧光信号实时输送至信号处理单元，信号处理单元对荧光信号进行数字化处理。
15.本发明的有益效果为：
16.本发明提供了一个快速、精确诊断非洲猪瘟病毒的系统，实现集病毒富集过程、核酸提取过程、dna体外扩增过程及荧光检测和信号处理过程于一体的病毒自动化检测。该非洲猪瘟病毒检测系统，可以实现在整个检测过程中无需开盖操作，避免检测样本的气溶胶污染和交叉感染；省去了复杂的温控装置，降低了系统开发的成本，摆脱了高压电源供电的限制；整个检测流程在微型计算机的控制下可以实现在一个系统内完成，促进了检测设备小型化，有利于实现非洲猪瘟病毒现场实时检测，而无需先将待检样本处理保存后再送至实验室内进行检测。
附图说明
17.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
18.图1为本发明实施例1中非洲猪瘟病毒一体式检测系统的单元结构图；
19.图2为本发明实施例1中富集和提纯装置进行富集和提纯的原理图；
20.图3为本发明实施例1中dna分子提取装置进行dna分子提取的原理图；
21.图4为本发明实施例1中加热和温控单元的不平衡电桥测温的电路图。
具体实施方式
22.应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
23.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
24.鉴于现有常用检测非洲猪瘟病毒的pcr方法存在电力、成本、空间和检测速度的限制导致无法在实验室外进行实时现场检测，本发明提出了一种非洲猪瘟病毒一体式检测系统及其检测方法。
25.本发明的一种典型实施方式，提供了一种非洲猪瘟病毒一体式检测系统，包括：
26.荧光反应和检测单元，对非洲猪瘟病毒的dna分子进行重组酶介导等温扩增，同时对扩增后产生的荧光进行实时检测；
27.加热和温控单元，对荧光反应和检测单元进行加热和温控，使得重组酶介导等温扩增过程的酶保持活性；
28.信号处理单元，对荧光反应和检测单元输出的荧光信号和加热和温控单元输出的温度信号进行数字化处理。
29.本发明利用rra方法来实现非洲猪瘟病毒的dna分子在生物体外的大量扩增，这种方法仅需要保持一种温度就可以到达与pcr相同的核酸扩增效果。本发明通过设置加热和温控单元，保持rra反应过程中的酶的活性，从而保证rra的效率。通过信号处理单元不仅对荧光信号进行数字化处理，而且通过信号处理单元能够控制反应试剂的用量和反应温度的变化，从而极大地提高了整个检测实验的灵敏度和准确性。
30.该实施方式的一些实施例中，荧光反应和检测单元设置富集和提纯装置，所述富集和提纯装置内设置免疫磁探针，所述免疫磁探针由磁珠与非洲猪瘟病毒抗体连接形成。通过设置免疫磁探针，能够可以在现场提取的检测样本溶液中与非洲猪瘟病毒通过抗原-抗体反应特异性结合，并在外加磁场的吸引下作定向移动，从而分离、提纯非洲猪瘟病毒，避免样品中其他病毒影响检测结果。
31.该实施方式的一些实施例中，荧光反应和检测单元设置dna分子提取装置，所述dna分子提取装置内设置超顺磁纳米微球，所述超顺磁纳米微球表面进行羧基功能化。dna分子能够吸附在羧基功能化超顺磁纳米微球表面，在外加磁场的作用力下，能够将其他杂质与dna分子分离，获得纯净的asfv核酸分子，从而使得rra更容易进行。
32.该实施方式的一些实施例中，荧光反应和检测单元设置dna扩增装置，所述dna扩增装置设置特异性引物、荧光探针、重组酶、单链dna结合蛋白和dna聚合酶，所述特异性引物能够与非洲猪瘟病毒的dna特异性结合，然后通过重组酶、单链dna结合蛋白和dna聚合酶进行rra，并通过荧光探针产生荧光信号。荧光反应和检测单元包括荧光检测装置，dna扩增装置与荧光检测装置配合，从而使dna扩增装置内产生荧光并对产生的荧光进行检测。
33.在一种或多种实施例中，dna扩增装置设置正电极、负电极，正电极与负电极同时连接电源，使dna扩增装置内的溶液产生外加电场。所述正电极优选为石墨烯电极，采用石墨烯电极更容易在dna扩增装置中设置。在外加电场力的作用下，dna分子能够进行聚集，在rra反应过程中，更容易使荧光分子聚集，从而增加荧光强度，提高检测灵敏度。所述正电极优选设置在靠近荧光检测口，能够使聚集的荧光分子聚集在荧光检测口，从而进一步提高检测灵敏度。
34.该实施方式的一些实施例中，设置光电倍增管(pmt)，光电倍增管将荧光信号转化为电流信号输送至信号处理单元。信号处理单元中包括运算放大器电路、数字转换芯片和单片机，运算放大器电路将荧光信号转化后的电流信号转换成模拟电压信号，然后将模拟电压信号输送至数字转换芯片转化成数字电压信号，单片机对数字电压信号进行处理。
35.该实施方式的一些实施例中，荧光反应和检测单元设置校准模块，所述校准模块对扩增后产生的荧光进行光补偿或校准。具体地，在dna扩增装置设置发光二极管，发光二极管的发光强度与荧光探针中荧光基团的发光强度相同。发光二极管采用稳定电流源供电。
36.加热和温控单元包括加热装置和温控装置，用于对扩增进行加热和温度控制。该实施方式的一些实施例中，加热和温控单元中加热装置为加热丝，所述加热丝缠绕在dna扩增装置的外壁。加热丝通过继电器的关闭或启动，实现电流通入或断开，从而使加热丝是否加热。
37.该实施方式的一些实施例中，加热和温控单元中温控装置为铂电阻温度传感器。所述铂电阻温度传感器采用铂电阻不平衡电桥测温法对温度进行控制。铂电阻温度传感器输出的电压信号输送至转换器中转换成数字信号，单片机对数字信号相近处理，将加热温度比目标温度高0.1℃或低0.1℃时，由单片机控制加热装置的关闭或启动，从而实现对加热温度的精确控制。
38.本发明的另一种实施方式，提供了一种非洲猪瘟病毒的检测方法，提供上述非洲猪瘟病毒一体式检测系统，将从猪提取的样品加入至荧光反应和检测单元，通过加热和温控单元与信号处理单元控制荧光反应和检测单元的处理温度，荧光反应和检测单元将处理产生的荧光信号实时输送至信号处理单元，信号处理单元对荧光信号进行数字化处理。
39.该实施方式的一些实施例中，荧光反应和检测单元的处理温度为37
±
0.09℃。
40.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
41.实施例1
42.一种非洲猪瘟病毒一体式检测系统，如图1所示，由荧光反应和检测单元、加热和温控单元、信号处理单元组成。
43.在荧光反应及光检测单元中，主要进行病毒样本的raa反应过程及对荧光的实时检测。为了保证等温扩增反应的最大效率，设计了加热和温控单元，使反应过程保持在酶的最佳活性温度37℃。在信号处理单元中，使用微处理器aduc834芯片对检测到的荧光信号和温度传感器的输出信号进行数字化处理，实现信号的可视化。
44.荧光反应和检测单元中设置富集和提纯装置，富集和提纯装置内通过免疫磁性纳米探针特异性分离非洲猪瘟病毒，原理如图2所示。首先将链霉亲和素偶联在超顺磁纳米微球上得到免疫磁珠，并与生物素化的asfv抗体溶液充分混合，通过亲和素-生物素之间的高亲和力作用，能够得到asfv抗体与磁珠稳定结合的免疫磁性纳米探针。免疫磁性纳米探针可以在现场提取的检测样本溶液中与非洲猪瘟病毒通过抗原-抗体反应特异性结合,并在外加磁场的吸引下作定向移动，从而达到分离、提纯非洲猪瘟病毒的目的。
45.荧光反应和检测单元中设置dna分子提取装置，dna分子提取装置进行非洲猪瘟病毒dna分子的提取，原理如图3所示。首先在已提纯的asfv溶液中加入病毒裂解液，用来破坏病毒的蛋白质外壳并释放其遗传物质dna。裂解后的溶液中不仅含有游离的核酸分子，还有其他的生物大分子杂质。将由sio2包裹的超顺磁纳米微球表面进行羧基功能化，在高浓度的聚乙二醇和氯化钠结合缓冲液中dna分子可以吸附在功能化超顺磁纳米微球表面。在外加磁场的作用力下，加入洗涤液使其他杂质物质从dna-磁珠结合物溶液中分离出去，最后
使用洗脱液将dna分子从磁珠上洗脱下来，同时，在单片机及蠕动泵的控制下可以将杂质溶液抽离，在从而得到纯净的asfv核酸分子。
46.荧光反应和检测单元中设置dna扩增装置(反应试管)，在dna扩增装置内对得到的纯净的asfv核酸分子进行重组酶介导扩增。该过程主要使用三种酶:重组酶、单链dna结合蛋白和dna聚合酶。在37℃恒温下，重组酶与dna引物紧密结合形成酶-引物聚合物，该复合物能在双链dna模板上找到同源序列并进行链置换反应。同源片段打开后，引物与模板配对，然后在dna聚合酶的作用下生成新的dna双链。单链dna结合蛋白将与解旋过程中由置换反应而产生的单链结合，防止dna单链被降解。与传统pcr反应相比，整个扩增反应不需要经历高温-低温-中温等复杂的温度变化，只需要保持在37℃便可以实现dna目标片段的指数级扩增。
47.根据非洲猪瘟病毒的保守基因b646l(p72)为raa反应提供了特异性引物(包括上游引物和下游引物)和荧光探针。使用荧光探针可以实时监测dna扩增反应过程以及病毒检测结果。探针完好时，报告基团发出的荧光波长被淬灭基团吸收；在dna复制过程中，dna聚合酶的5'-3'外切酶活性可以切断探针链并将报告基团与淬灭基团分离开来，从而使荧光信号可以被系统检测到。每条双链dna扩增一次，就会产生一个荧光分子。
48.上游引物的核苷酸序列为：ccagatacgttgcgtccgtgataggagtga，见seq id no.1。
49.下游引物的核苷酸序列为：
50.atgaaaatgatacgcagcgaacgtgcagcca，见seq id no.2。
51.荧光探针的核苷酸序列为：tgtttacctgctgtttggatattgtgagag[fam-dt]t[thf][bhq-dt]cgggaaaatgttgtg[3
′
spacer]，见seq id no.3。
[0052]
利用dna分子在碱性条件下带有负电荷的原理，在外加电场的作用下能够实现对dna分子富集的效果。由于荧光信号检测口位于反应试管(dna扩增装置)的底部，在试管底部附着一层石墨烯薄膜。一方面，石墨烯具有良好的导电性，可以作为电极在试管中产生电场；另一方面，它具有高透光性，因此不会对荧光的检测效果产生影响。利用化学气相沉积法(cvd)在铜箔上生长单层石墨烯，并用铜基底蚀刻法将石墨烯薄膜转移到反应试管(dna扩增装置)底部作为柔性透明电极。将石墨烯电极作为正电极通过一个稳定电流源与试管上另一负电极相连，从而给反应试管的溶液施加一个电场。在外加电场力的作用下，溶液中的dna分子聚集在试管底部，则在扩增反应中产生的荧光分子也会聚集在荧光检测口，从而增加了荧光强度，提高了荧光信号检测的灵敏度。
[0053]
使用光电倍增管(pmt)接收弱荧光信号。pmt通过光电转换将光信号准换成电流信号，再通过集成运算放大器电路转换为模拟电压信号，然后该模拟信号通过aduc834芯片进行模数转换得到数字电压信号，最后由单片机对数字信号进行处理。本实施例使用日本滨松光子公司的h5773-2 pmt，其峰值波长为500nm至600nm，覆盖了荧光基团的发射波长。在模数转换中使用参考电压，选用adi公司的ref192作为电压基准芯片，提高了测量电路性能以及信号检测的可靠性。考虑到输入信号非常微弱，容易受到系统噪声的严重干扰，因此，在信号处理模块中增加了滤波电路，以降低噪声干扰。
[0054]
由于扩增反应是在溶液中进行的，因此荧光探针的发射波长会被溶液吸收，从而降低检测结果的准确性。因而设计了一个内部校准模块作为光补偿，具体为，在反应管两侧安装两个发光波长与dna荧光探针发光波长一致的发光二极管(led)；同时要求检测到的发
光强度与荧光基团的发光强度相同。为了提高led的发光稳定性，使用稳定电流源对二极管供电。
[0055]
加热和温控单元中设计了加热及温控系统实现对dna分子扩增过程的恒温加热。通过在检测管外壁上螺旋缠绕镍铬合金加热丝对检测管进行均匀加热，并采用铂电阻温度传感器pt100实现对加热温度的高精度的测量。测温原理是基于铂电阻的热效应，即其电阻随温度变化而呈线性变化。在0℃-650℃温度范围内，pt100电阻值与温度值的关系式为:
[0056]rt
＝r0[1 at bt2]#(1)
[0057]
式中a、b均为常数值，其中a的值为3.90802
×
10-3
/℃，b的值为-5.802
×
10-7
/(℃)2，rt、r0分别为温度为t℃、0℃时铂电阻的阻值。采用铂电阻不平衡电桥测温法，电路图如图4所示，并用最小二乘法来降低电桥的非线性误差，提高测温系统的精度。镍铬线加热开关由继电器控制，温度保持在37
±
0.1℃。根据测温电桥的电路图，u0与r
t
的关系可表示为:
[0058][0059]
铂电阻温度传感器输出的弱电压信号直接传送到ad7714转换器中，经模数转换后产生的数字信号依旧由单片机aduc834进行处理。当加热温度比37℃高0.1℃或低0.1℃时，由aduc834控制的继电器自动关闭或启动，从而实现对加热温度的精确控制。
[0060]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。