大麻中大麻二酚和四氢大麻酚的检测方法

1.本发明涉及检测技术领域，具体涉及一种大麻中大麻二酚和四氢大麻酚的含量的测定方法。


背景技术：

2.大麻酚是大麻叶所含的大麻酚类化合物的一种，是大麻在贮存过程中，其所含的四氢衍生物被空气氧化而产生的。大麻酚是一种麻醉药，在止咳、镇痉、止痛、镇静、安眠等作用。大麻叶中含有多种大麻酚类衍生物，已分离到15种以上,较重要的有:大麻酚、大麻二酚、四氢大麻酚、大麻酚酸、大麻二酚酸、四氢大麻酚酸。对于这些成分的测定对于临床医学研究具有重要意义。
3.目前，对于大麻中大麻二酚和四氢大麻酚的含量的测定方法中，存在测定测(成)本较高，测定结果误差较大，操作复杂的问题。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种大麻中大麻二酚和四氢大麻酚的含量的测定方法，以解决现有技术中测定测本较高，测定结果误差较大，操作复杂的问题。
5.为实现上述目的，本发明提出大麻中大麻二酚和四氢大麻酚含量的测定方法，包括：
6.标准溶液的制备：称取1.0mg大麻二酚(cbd)标准品，用2ml甲醇溶解，制成0.5mg/ml标准储备液；吸取1mg/ml的四氢大麻酚标准溶液0.5ml于5ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，制成0.1mg/ml的标准储备液；
7.标准工作液的制备：吸取大麻二酚标准储备液，用甲醇逐级稀释，配制成0.01mg/ml、0.02mg/ml、0.04mg/ml、0.05mg/ml、0.06mg/ml、0.08mg/ml、0.10mg/ml、0.15mg/ml、0.20mg/ml、0.25mg/ml的标准工作液，以绘制大麻二酚的标准曲线；吸取四氢大麻酚标准储备液，用甲醇逐级稀释，配制成0.002mg/ml、0.004mg/ml、0.006mg/ml、0.008mg/ml、0.010mg/ml、0.020mg/ml、0.040mg/ml、0.060mg/ml、0.080mg/ml、0.10mg/ml的标准工作液，以绘制四氢大麻酚的标准曲线；
8.待测样品溶液的制备：称取试样1g-1.5g(精确至0.01g)于回流瓶中，加入20ml-30ml的95％乙醇回流60min-90min，重复一次，合并两次提取液，过滤，减压回收乙醇，用甲醇溶解转移至25ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀，过0.45μm滤膜，得到待测溶液；
9.待测溶液的测定：将所述大麻二酚的标准工作液和所述四氢大麻酚的标准工作液按照已确立的液相色谱条件进行分析，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对试样进行定量，保证大麻二酚和四氢大麻酚的响应值在测定线性范围内。
10.优选地，所述液相色谱条件包括：色谱柱：c18柱，柱长150mm，内径4.6mm，粒度3.5μ
m；柱温：35℃；流动相：乙腈-水(68:32，v/v)；流动相流速：1.0ml/min；进样体积：10μl。
11.优选地，所述待测样品溶液的制备包括：称取试样1g于回流瓶中，加入20ml 95％乙醇回流60min，重复一次，合并两次提取液，过滤，减压回收乙醇。
12.优选地，所述液相色谱条件中的设定波长为220nm。
13.优选地，所述样品为大麻。
14.优选地，所述大麻为大麻叶和大麻茎。
15.优选地，所述样品为大麻，1g()
16.本发明的有益效果是：
17.根据本发明实施例的大麻中大麻二酚和四氢大麻酚的含量的测定方法，方法简单、便于操作，且采用的仪器价格合理，检测成本低。测定结果准确可靠，为大麻中大麻二酚和四氢大麻酚的含量进行评价，提供了可靠的数据。
附图说明
18.图1为本发明实施例的大麻二酚标准品(0.04mg/ml)图谱；
19.图2为本发明实施例的四氢大麻酚标准品(0.04mg/ml)图谱；
20.图3为本发明实施例的大麻中大麻二酚图谱；
21.图4为本发明实施例的大麻中四氢大麻酚图谱；
22.图5为本发明实施例的大麻二酚标准曲线图谱；
23.图6为本发明实施例的四氢大麻酚标准曲线图谱。
具体实施方式
24.下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
25.本发明的仪器和设备：
26.高效液相色谱仪，型号为1260ii。
27.对照品大麻二酚和四氢大麻酚。
28.原料为：大麻叶和大麻茎。
29.本发明所用试剂和原料均市售可得。
30.本发明制备方法中未提及的方法均为常规的方法。
31.下面结合具体实施例描述本发明中关于参数及技术指标的选择以及各实验例的效果。
32.实施例1
33.称样量选择：准确称取样品0.5g、1.0g、1.5g，通过测定大麻二酚(cbd)和四氢大麻酚(thc)含量，确定最适称样量。
34.样品混匀粉碎过18目筛后，分别称取0.5g、1.0g、1.5g(精确至0.01g)于回流瓶中，加入20ml 95％乙醇回流60min，重复一次，合并两次提取液，过滤，减压回收乙醇，用甲醇溶解转移至25ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀，过0.45μm滤膜，上机测定，结果见表1。
35.表1不同称样量对样品中大麻二酚和四氢大麻酚提取效果的影响位：g/100g；n＝3
[0036][0037][0038]
由表1可知，当称样量为1.0g和1.5g时，对样品中大麻二酚和四氢大麻酚提取效果均较好，从经济和计算方便分析，选择称样量为1.0g较适宜。
[0039]
实施例2
[0040]
粒度选择：将样品过18目、20目和60目筛，称取样品1.0g(精确至0.01g)，加入20ml 95％乙醇回流60min，重复一次，合并两次提取液，过滤，减压回收乙醇，用甲醇溶解转移至25ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀，过0.45μm滤膜，上机测定。通过测定大麻二酚和四氢大麻酚含量，确定最适粒度，结果见表2。
[0041]
表2不同粒度对样品中大麻二酚和四氢大麻酚提取效果的影响单位：g/100g；n＝3
[0042][0043]
由表2可知，粒度对样品中大麻二酚和四氢大麻酚提取效果影响不大，选择18目即可。
[0044]
实施例3
[0045]
提取剂的选择：样品混匀粉碎过18目筛后，称取1.0g(精确至0.01g)于回流瓶中，分别加入20ml 75％乙醇、95％乙醇和无水乙醇回流60min，重复一次，合并两次提取液，过滤，减压回收乙醇，用甲醇溶解转移至25ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀，过0.45μm滤膜，上机测定。通过测定大麻二酚和四氢大麻酚含量，确定最适提取剂，结果见表3。
[0046]
表3不同提取剂对样品中大麻二酚和四氢大麻酚提取效果的影响单位：g/100g；n＝3
[0047][0048]
由表3可知，95％乙醇对样品中大麻二酚和四氢大麻酚提取效果较好。
[0049]
实施例4
[0050]
提取剂体积的选择：样品混匀粉碎过18目筛后，称取1.0g(精确至0.01g)于回流瓶
中，经过大量实验后，采用分别加入95％乙醇10ml、20ml、30ml回流，回流60min，重复一次，合并两次提取液，过滤，减压回收乙醇，用甲醇溶解转移至25ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀，过0.45μm滤膜，上机测定。通过测定大麻二酚和四氢大麻酚含量，确定最适提取剂体积，结果见表4。
[0051]
表4不同提取剂体积对样品中大麻二酚和四氢大麻酚提取效果的影响单位：g/100g；n＝3
[0052][0053]
由表4可知，提取剂加入20ml和30ml对样品中大麻二酚和四氢大麻酚提取效果均较好。从经济和时间角度考虑，提取剂加入20ml较适宜。
[0054]
实施例5
[0055]
提取时间的选择：样品混匀粉碎过18目筛后，称取1.0g(精确至0.01g)于回流瓶中，经过大量实验后，采用分别加入95％乙醇20ml，分别回流30min、60min、90min重复一次，合并两次提取液，过滤，减压回收乙醇，用甲醇溶解转移至25ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀，过0.45μm滤膜，上机测定。通过测定大麻二酚和四氢大麻酚含量，确定最适提取时间，结果见表5。
[0056]
表5不同提取时间对样品中大麻二酚和四氢大麻酚提取效果的影响单位：g/100g；n＝3
[0057][0058]
由表5可知，提取时间60min和90min对样品中大麻二酚和四氢大麻酚提取效果均较好。从经济和时间角度考虑，提取时间为60mi n较适宜。
[0059]
实施例6
[0060]
流动相比例选择：流动相选择乙腈：水＝60:40、68:32、75:25通过测定标准品，根据峰型和保留时间选择适宜流动相比例，结果流动相，乙腈：水＝68:32时效果较好(见图1～4)。
[0061]
实施例7
[0062]
检测波长的选择：选择波长200nm、220nm、250nm，通过测定同一浓度标准溶液，选择具有最大吸收峰的检测波长。结果表明，检测波长为220nm较好。
[0063]
实施例8
[0064]
柱温的选择：同一浓度标准溶液分别在25℃、35℃、45℃柱温下，通过峰型，选择适
宜的柱温，结果表明，当柱温为35℃时较好。
[0065]
实施例9
[0066]
进样量的选择：进样量按照1260ii高效液相色谱仪(紫外检测器)常用进样量10μl设定。
[0067]
实施例10
[0068]
线性关系：用上述仪器条件，大麻二酚依次测定0.02、0.04、0.05、0.06、0.08、0.10mg/ml 5个浓度梯度的标准溶液，流出曲线如图5。
[0069]
四氢大麻酚依次测定0.002、0.004、0.006、0.008、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg/ml 10个浓度梯度的标准溶液，流出曲线如图6。
[0070]
从图5中可以看出，大麻二酚标准曲线相关系数为0.99839，线性方程为y＝51661.5072x-1.4124，其保留时间及峰的面积信息参见表6。
[0071]
从图6中可以看出，四氢大麻酚标准曲线相关系数为0.99962，线性方程为y＝40834.0486x-10.0911，具体参见图6，其保留时间及峰的面积信息参见表6。
[0072]
表6保留时间及峰面积信息表
[0073][0074][0075]
下面通过化学分析方法对方法进行评估。
[0076]
检出限：依据gb 27417-2017《合格评定化学分析方法确认和验证指南》，采用信噪比法评估lod和目视评价法评估lod。参见表7。
[0077]
以信噪比法评估lod，大麻二酚的检出限是0.002g/100g，但此时流出的色谱峰高。在此基础上采用目视评价法评估lod，当大麻二酚含量达到0.0001g/100g时，阳性检出次数6次，出现检测结果不可靠时拐点。因此，大麻二酚检出限为0.0001g/100g。
[0078]
以信噪比法评估lod，四氢大麻酚的检出限是0.001g/100g，但此时流出的色谱峰高。在此基础上采用目视评价法评估lod，当四氢大麻酚含量达到0.0006g/100g时，阳性检出次数5次，出现检测结果不可靠时拐点。因此，四氢大麻酚检出限为0.0006g/100g。
[0079]
定量限：为了增加数据的可信性，依据gb 27417-2017《合格评定化学分析方法确认和验证指南》，采用5.4.3.2中规定，以3倍的检出限lod来表示定量限loq。参见表7。
[0080]
表7检出限与定量限考察结果
[0081][0082]
精密度(重复性)：同一检验员、同一台仪器、同一样品连续测定7次，计算各组含量的相对标准偏差(rsd)。参见表8。
[0083]
表8重复性考察结果
[0084][0085]
依据gb 27417-2017《合格评定化学分析方法确认和验证指南》采用变异系数cv值对重复性进行判定，当被测组分含量在1000mg/kg时，cv值≤3.8％，符合要求。
[0086]
再现性：将同一样品平行制成8份样品溶液，按上述样品制备方法制备和上机条件测定。间隔24h再次上机测定同一样品，计算rsd。参见表9。
[0087]
表9再现性考察结果
[0088][0089]
依据gb 27417-2017《合格评定化学分析方法确认和验证指南》采用变异系数cv值对再现性进行判定，当被测组分含量在1000mg/kg时，cv值≤3.8％，符合要求。
[0090]
稳定性：同一份样品溶液分别在0h、4h、8h、12h、18h、24h时上机测定，测定结果计算rsd。参见表10。
[0091]
表10稳定性考察结果
[0092][0093]
依据gb 27417-2017《合格评定化学分析方法确认和验证指南》采用变异系数cv值对稳定性进行判定，当被测组分含量在1000mg/kg时，cv值≤3.8％，符合要求。
[0094]
加标回收：为了降低不同批次之间的变化，采用覆盖整个浓度测试范围的不用试样评估偏倚。依据gb 27417-2017《合格评定化学分析方法确认和验证指南》，分别在已知且稳定的样品中添加浓度水平为0.5mg/kg、50mg/kg、200mg/kg标准溶液。根据添加浓度对照标准中规定回收率范围，若在范围表明该方法准确可行。结果见表11。
[0095]
表11回收率考察结果
[0096][0097]
从表11中可以看出，该方法加标回收率满足gb 27417-2017《合格评定化学分析方法确认和验证指南》中规定值，表明该检测方法可行。
[0098]
根据本发明实施例的大麻中大麻二酚和四氢大麻酚的测定方法，方法简单、便于操作，且采用的仪器价格合理，检测成本低。
[0099]
本发明的技术内容及技术特征已揭示如上，然而熟悉本领域的技术人员仍可能基于本发明的教示及揭示而作种种不背离本发明精神的替换及修饰，因此，本发明保护范围应不限于实施例所揭示的内容，而应包括各种不背离本发明的替换及修饰，并为本专利申请权利要求所涵盖。

技术特征：
1.一种大麻中大麻二酚和四氢大麻酚的检测方法，其特征在于，包括：标准溶液的制备：称取1.0mg大麻二酚(cbd)标准品，用2ml甲醇溶解，制成0.5mg/ml标准储备液；吸取1mg/ml的四氢大麻酚标准溶液0.5ml于5ml容量瓶中，用甲醇定容至刻度，制成0.1mg/ml的标准储备液；标准工作液的制备：吸取大麻二酚标准储备液，用甲醇逐级稀释，配制成0.01mg/ml、0.02mg/ml、0.04mg/ml、0.05mg/ml、0.06mg/ml、0.08mg/ml、0.10mg/ml、0.15mg/ml、0.20mg/ml、0.25mg/ml的标准工作液，以绘制大麻二酚的标准曲线；吸取四氢大麻酚标准储备液，用甲醇逐级稀释，配制成0.002mg/ml、0.004mg/ml、0.006mg/ml、0.008mg/ml、0.010mg/ml、0.020mg/ml、0.040mg/ml、0.060mg/ml、0.080mg/ml、0.10mg/ml的标准工作液，以绘制四氢大麻酚的标准曲线；待测样品溶液的制备：称取试样1g-1.5g于回流瓶中，加入20ml-30ml的95％乙醇回流60min-90min，重复一次，合并两次提取液，过滤，减压回收乙醇，用甲醇溶解转移至25ml容量瓶中，定容至刻度，摇匀，过0.45μm滤膜，得到待测溶液；待测溶液的测定：将所述大麻二酚的标准工作液和所述四氢大麻酚的标准工作液按照已确立的液相色谱条件进行分析，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对试样进行定量，保证大麻二酚和四氢大麻酚的响应值在测定线性范围内。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述液相色谱条件包括：色谱柱：c18柱，柱长150mm，内径4.6mm，粒度3.5μm；柱温：35℃；流动相：乙腈-水(68:32，v/v)；流动相流速：1.0ml/min；进样体积：10μl。3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述待测样品溶液的制备包括：称取试样1g于回流瓶中，加入20ml 95％乙醇回流60min，重复一次，合并两次提取液，过滤，减压回收乙醇。4.根据权利要求1-3任一项所述的检测方法，其特征在于，所述液相色谱条件中的设定波长为220nm。5.根据权利要求1-3任一项所述的检测方法，其特征在于，所述样品为大麻。6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，所述大麻为大麻叶和大麻茎。

技术总结
本发明揭示了一种大麻中大麻二酚和四氢大麻酚的检测方法，包括，采用大麻二酚和四氢大麻酚标准品配置不同浓度的标准溶液；用乙醇提取样品，以C


技术研发人员：刘笑笑 杨舸 张惠峰 李盛钰 宋志峰 郝丽珊 王莹 魏春雁
受保护的技术使用者：吉林省农业科学院
技术研发日：2021.09.01
技术公布日：2022/5/25