一种药物活性功能的人参多糖的分离和表征方法

一种药物活性功能的人参多糖的分离和表征方法
1.原案申请号202010626447.5，名称一种具有免疫调节和抗肿瘤活性的人参多糖的分离和表征方法，申请日2020.07.01。
技术领域
2.本发明涉及药物开发功能性食品领域，具体涉及一种具有药物活性功能的人参多糖的分离和表征方法。


背景技术：

3.对多糖的研究显示，多糖的各种生物活性与其结构和空间构像等方面有着密切的关系。从不同天然来源提取的多糖的免疫活性取决于其单糖组成、分子量、链构象等。例如，有报道称，多糖单糖组成中阿拉伯糖、葡萄糖醛酸和半乳糖的比例与它们的巨噬细胞刺激活性有关[immunostimulatory activity and structure of polysaccharide from streptococcus equi subsp.zooepidemicus[j].international journal of biological macromolecules,2013,57:218-225.]。据文献报道，人参多糖主要由半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖、葡萄糖和半乳糖醛酸组成[structural and anti-inflammatory characterization of a novel neutral polysaccharide from north american ginseng(panax quinquefolius)[j].international journal of biological macromolecules,2015.]。[panax ginseng polysaccharide induces apoptosis by targeting twist/akr1c2/nf-1pathway in human gastric cancer[j].carbohydrate polymers,2014,102(complete):103-109.]分离出人参抗肿瘤多糖(pgp2a)，利用气相色谱法分析由半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖醛酸在摩尔中的含量比3.7:1.6:0.5:5.4。[purification,characterization and anticancer activity of a polysaccharide from panax ginseng[j].international journal of biological macromolecules,2012,51(5):968
‑‑‑
973.]分离出人参均质多糖(pgpw1)，分析得出葡萄糖(glu)、半乳糖(gal)、甘露糖(man)和阿拉伯糖(arab)的摩尔比为3.3:1.2:0.5:1.1。据文献报道，人参多糖的分子量都在1
×
103～1
×
106da之间生物活性较好[人参多糖的系统分析及其免疫活性研究[d].东北师范大学,2009.]。利用核磁共振波谱法，可以检测出多糖的糖苷键，也可以根据一些出现在特殊位置的碳信号确定单糖种类和某些特殊基团。[structural characterization of alkali-soluble polysaccharides from panax ginseng c.a.meyer[j].royal society open science,2018,5(3):171644.]通过核磁共振技术得出，人参多糖(ngp-1a、ngp-2a)的rg-i结构域可能存在高度支化与β-14-galactanα-1,5/1,3,5-arabinan和ii型阿拉伯半乳聚糖侧链。根据相关文献可知，刚果红实验可以探究多糖的三螺旋空间结构，而三螺旋空间结构有利于多糖生物活性的提高[三螺旋多糖的链结构与功能研究进展[j].功能高分子学报(2期):134-152.]，但是有关人参多糖的刚果红实验未见报道。
[0004]
人参多糖具有较好的免疫调节活性。[immunomodulating activities of polysaccharides isolated from panax ginseng[j].journal of medicinal food,
2004,7(1):1-6.]分离得到人参多糖gmp，通过mtt实验得出100mg/ml下的gmp提高了巨噬细胞的活力；通过中性红实验得出gmp在100mg/ml下吞噬作用效果显著；通过no分泌量实验得出gmp在100mg/ml下吞噬作用效果同样显著。[the core structure characterization and of ginseng neutral polysaccharide with the immune-enhancing activity.[j].international journal of biological macromolecules,2018.]分离得到西洋参多糖gpn和gpne-ii，gpn和gpne-ii对淋巴细胞增殖有促进作用显示了具有免疫调节的应用潜力。[antitumor immunostimulatory activity of polysaccharides from panax japonicus c.a.mey:roles of their effects on cd4 t cells and tumor associated macrophages[j].international journal of biological macromolecules structure function&interactions,2018.]分离得到西洋参多糖(pspj)用于小鼠的h22肝癌细胞的抗肿瘤活性的研究，发现pspj抑制h22的肿瘤在体内生长，对小鼠有未检测到的毒性作用。[polysaccharides from ginseng leaves inhibit tumor metastasis via macrophage and nk cell activation[j].international journal of biological macromolecules structure function&interactions,2017.]分离出人参叶多糖馏分(gs-p)在小鼠中，以剂量依赖的方式抑制结肠肿瘤26-m3.1的增值，显著增强对肿瘤细胞的细胞毒性。通过这几种实验方法可以测定和比较人参多糖的免疫和抗肿瘤活性。


技术实现要素：

[0005]
本发明采用微波提取法提取人参多糖，首次通过deae-52纤维素进行分离纯化得到人参单体多糖，之后进行紫外、红外、单糖组成、分子量、螺旋结构和免疫调节活性的测定，为进一步开发人参资源奠定理论基础。
[0006]
本发明是通过如下技术方案实现上述目的的，一种具有免疫和抗肿瘤活性的人参单体多糖的分离方法，包括如下步骤：
[0007]
(1)取人参多糖，以水为提取剂，采用微波提取法进行提取得人参粗多糖，提取后采用苯酚-硫酸法测定人参粗多糖的含量，提取率。
[0008]
(2)采用预处理后的deae纤维素，对人参粗多糖进行纯化得纯化后的人参多糖；
[0009]
具体步骤为：通过逐步增加上样量的方法确定deae-纤维素对人参多糖的吸附能力，保证多糖的分级效果。deae-纤维素离子交换层析不仅可以根据离子强度对多糖进行分级，同时可以达到脱色的目的。deae纤维素预处理为：先将deae纤维素干粉浸泡于蒸馏水中，在0.5mol/l的hcl水溶液中浸泡1～2h，再用蒸馏水洗至滤液ph值为中性，将抽干后的deae纤维素在0.5mol/l的naoh溶液中1～2h，再用蒸馏水将滤液ph值洗至中性，然后装柱。
[0010]
所述采用棉状deae纤维素对人参多糖进行纯化为：上样浓度为10.0mg/ml，上样体积为50ml，流速为1.0ml/min，洗脱液为蒸馏水和0.3mol/l的nacl水溶液。蒸馏水洗脱得到中性糖级分,0.3mol/l nacl水溶液洗脱得到酸性糖级分；收集过柱后的洗脱液，分别旋转蒸发浓缩；然后将多糖溶液装入透析袋用蒸馏水透析24h，期间多次换水，将多糖溶液进行浓缩、冷冻干燥，得纯化后人参多糖。
[0011]
(3)采用deae-52纤维素对纯化后的人参多糖进行分离，依次用蒸馏水、0.1mol/l、0.2mol/l、0.3mol/l nacl水溶液相继洗脱，流速为1ml/min，得人参单体多糖。
[0012]
优选的，所述微波提取法进行提取的具体方法为：取人参粗多糖粉末5g经微波提
取，温度为70℃，料液比为1：30(mg/ml)，功率550w的条件下，提取时间为6min，然后浓缩、干燥即得人参粗多糖。
[0013]
优选的，所述deae-52纤维素对纯化后的人参多糖进行分离的具体步骤为：称取纯化后的人参多糖，用5ml蒸馏水将其溶解，上样时沿deae-52纤维素柱壁缓慢加入，防止填料飞起导致上样不均匀。用蒸馏水洗脱中性糖级分；酸性糖级分依次用0.1mol/l、0.2mol/l、0.3mol/l nacl水溶液相继洗脱，流速为1ml/min，分瓶收集；蒸馏水洗脱收集得单体多糖gsp-0、0.1mol/l的nacl水溶液洗脱收集得单体多糖gsp-1、0.2mol/l的nacl水溶液洗脱收集得单体多糖gsp-2、0.3mol/l的nacl水溶液洗脱收集得单体多糖gsp-3。
[0014]
优选的，收集0.2mol/l nacl水溶液得人参单体多糖，定义为gsp-2；所述gsp-2的平均分子量1.76
×
105da，按照摩尔比计算，gsp-2中甘露糖：核糖：鼠李糖：葡糖糖糠醛酸：半乳糖醛酸：葡萄糖：半乳糖：阿拉伯糖＝0.56:0.62：1:1.45:0.67:2.31:2.46:3.30。gsp-2可以有效的促进巨噬细胞的增值能力、吞噬作用，可以促进no的分泌量；也可以有效的促进对5种结直肠癌细胞(hct-116、hct-8、ht-29、sw48或caco2)增殖的抑制作用，具有较好的免疫和抗肿瘤活性，可用于制备治疗抗肿瘤药物。
[0015]
根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种具有免疫和抗肿瘤活性的人参单体多糖的表征方法，包括如下步骤：
[0016]
(1)紫外吸收光谱检测：取2.00mg的分离后人参多糖溶解在2ml蒸馏水中，然后在200～800nm范围内用紫外分光光度计进行扫描，记录紫外吸收光谱，目的是检测人参单体多糖是否有蛋白质和核酸。
[0017]
(2)红外光谱检测：
[0018]
精密称取纯化分离后人参单体多糖2mg和干燥后的溴化钾100mg混匀，用玛瑙研钵研磨后压片，在红外光谱分析仪中4000cm-1
～400cm-1
扫描，连续扫描32次，测定样品吸收峰，扫描样品前扫除空气峰多糖，目的是测量人参单体多糖的官能团和糖苷键链接方式。
[0019]
(3)采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生化法对人参单体多糖进行高效液相色谱分析：
[0020]
准确称取2～3mg分离后的人参单体多糖样品，置于反应釜中，加入2ml 2mol/l的三氟乙酸水溶液，封口放入110℃烘箱中水解5h，取上清液蒸干，用甲醇重复洗涤3次，蒸干得水解产物；取水解产物，加入0.2ml 0.5mol/l的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液和0.2ml 0.3mol/l的naoh水溶液于70℃水浴加热60min，冷却后加入0.2ml 0.3mol/l的hcl水溶液中和，再加入1ml氯仿萃取，离心去除上清液，重复3次，通过0.45μl滤膜过滤，即为衍生化后溶液，再过滤，进行高效液相色谱分析，计算各单糖的量。
[0021]
(4)采用高效液相体积排阻法结合示差折光检测器在以下条件下测定人参单体多糖的分子量；
[0022]
取20μl 2.0mg/ml分离后人参单体多糖样品水溶液，通过0.45μm过滤器，注入shodex sugar ks-804(8.0mm
×
300mm2)柱中，在色谱条件下进样并进行分析，记录峰面积，代入回归方程求各组分的相对分子质量。标准曲线线性回归方为：
[0023]
log(mw)＝13.87440-5.01843x 0.96087x
2-0.07993x3[0024]
mw:重均分子量x：保留时间
[0025]
(5)采用刚果红实验对人参多糖进行分析：
[0026]
将人参单体多糖样品水溶液1mg/ml与2ml 80μmol/l刚果红溶液混合，然后将混合物逐渐加入1mol/l的naoh水溶液，形成最终浓度为0mol/l、0.1mol/l、0.2mol/l、0.3mol/l、0.4mol/l和0.5mol/l的naoh混合液；将混合物在暗室温度下保持5min；在200～800nm范围内进行紫外-可见吸收光谱全波长扫描，记录最大吸收波长。
[0027]
优选的，所述高效液相色谱分析的条件为：
[0028]
分离柱为ods2 c18柱(250
×
4.6mm2，5mm)，流动相为乙腈与0.05mol/ml ph＝6.8磷酸盐缓冲，其中乙腈与磷酸盐缓冲液的体积比为18:82，流速：0.8ml/min，柱温：30℃，紫外检测器，检测波长为245nm，进样量为20μl。
[0029]
本发明对分离出的具有免疫活性的人参单体多糖进行了活性测试，方法如下：
[0030]
(a)人参单体多糖对raw264.7细胞增殖能力的影响通过mtt分析实验进行评估。使用酶标仪在490nm处测定其吸光度吸光度。细胞存活率公式计算如下：
[0031][0032]
利用中性红的方法测定了raw264.7细胞的吞噬活性。用酶标仪在490nm处测量其吸光度。吞噬指数的计算公式如下：
[0033][0034]
利用griess反应通过测定培养的raw264.7细胞培养基上清液中的亚硝酸盐浓度测定一氧化氮(no)的产生。用酶标仪测量490nm处的吸光度，计算亚硝酸盐浓度。通过与no标准品比较。
[0035]
(b)通过部分表征，比较体外的免疫活性，获得最有效的部分gsp-2，进一步进行抗肿瘤活性测试。采用cck-8法检测细胞存活率，使用酶标仪检测450nm处的吸光度。计算药物作用下的细胞生存率和抑制率：
[0036]
生存率＝(od(加药组)/od(空白组))
×
100％；
[0037]
抑制率＝(1-od(加药组)/od(空白组))
×
100％。
[0038]
计算药物作用的ic
50
值并作图根据药物，抑制率和药物作用浓度，使用graphpad prism作图。
[0039]
(c)通过部分表征，比较体外的免疫和抗肿瘤活性，获得最有效的部分gsp-2，进一步表征其结构。核磁共振(nmr)谱记录在bruker drx-500nmr光谱仪(bruker biospin,rheinstetten,germany)上，使用d2o作为溶剂。分别在128k和32k下进行了1h-nmr和
13
c-nmr谱图。
[0040]
本发明将人参多糖提纯、分离，对不同组分进行uv、ir、hplc、nmr、刚果红实验等表征分析，提供一套系统的表征方法。以raw264.7巨噬细胞作为免疫学实验对象，采用cck-8法检测5种结直肠癌细胞增殖的抑制作用，全面综合地阐明人参多糖的免疫调节与抗肿瘤作用。对深入探讨人参多糖的构效关系，为人参多糖的开发与利用提供理论基础。
[0041]
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
[0042]
1)本发明首次对具有免疫和抗肿瘤活性的人参多糖提供一套系统的表征方法。
[0043]
2)本发明首次采用棉状deae纤维素进行人参多糖的纯化，得到具有免疫和抗肿瘤
活性的人参多糖gsp-2。gsp-2可以有效的促进巨噬细胞的增值能力、吞噬作用，可以促进no的分泌量，也可以有效的促进对5种结直肠癌细胞增殖的抑制作用，具有较好的免疫和抗肿瘤活性。
[0044]
3)本发明首次对人参多糖进行刚果红实验，且证明具有三螺旋空间结构。
附图说明
[0045]
图1为deae-52层析柱分离洗脱曲线；
[0046]
图2为gsp-0、gsp-1、gsp-2、gsp-3的紫外全波长扫描图；
[0047]
图3为gsp-0、gsp-1、gsp-2及gsp-3的红外扫描谱图；
[0048]
图4为gsp-0、gsp-1、gsp-2及gsp-3的红外二阶导数谱图；
[0049]
图5为gsp-0、gsp-1、gsp-2、gsp-3的三重螺旋构象图；
[0050]
图6gsp-0、gsp-1、gsp-2及gsp-3对raw264.7细胞增殖能力的影响图；
[0051]
图7gsp-0、gsp-1、gsp-2及gsp-3对raw264.7细胞吞噬能力的影响图；
[0052]
图8为gsp-0、gsp-1、gsp-2及gsp-3对raw264.7细胞分泌量的影响图；
[0053]
图9为gsp-2对5种结直肠癌细胞增殖的抑制作用谱图；
[0054]
图10为gsp-2的1h-nmr谱图；
[0055]
图11为gsp-2的
13
c-nmr谱图。
具体实施方式
[0056]
实施例1人参粗多糖的提取纯化及含量测定
[0057]
原料为吉林省长白山人参根茎，洗净、烘干、用粉碎机粉碎成粉末备用。取5g人参粉末，以水为提取剂，采用微波提取法进行提取；微波提取时间为6min，温度为70℃，料液比为1：30(mg/ml)，功率550w的条件下提取，浓缩、干燥即得人参粗多糖，命名gsp。
[0058]
deae-纤维素的预处理：先将deae-纤维素干粉浸泡于蒸馏水中，在0.5mol/l的hcl溶液中浸泡1～2h,再用蒸馏水洗至滤液ph值为中性，将抽干后的deae-纤维素浸泡在0.5mol/l的naoh溶液中1～2h，再用蒸馏水将其洗至滤液ph值为中性，然后装柱。
[0059]
棉状deae上样及洗脱：具体的是量取预处理后的棉状deae-纤维素，湿法装入层析柱中，上样浓度为10.0mg/ml，上样体积为50ml，流速为1.0ml/min，洗脱液为蒸馏水和0.3mol/l的nacl水溶液。蒸馏水洗脱得到中性糖级分,0.3mol/l nacl水溶液洗脱得到酸性糖级分；收集过柱后的洗脱液，分别旋转蒸发浓缩。然后将多糖溶液装入透析袋用蒸馏水透析24h，期间多次换水，将多糖溶液进行浓缩、冷冻干燥，得纯化后人参多糖。
[0060]
采用苯酚-硫酸法测定人参粗多糖的含量。采用间羟基联苯法，以半乳糖醛酸为标准品测定糖醛酸含量。采用考马斯亮蓝g-250染色法，以小牛血清为标准品测定蛋白质的含量。
[0061]
表1纯化前后人参粗多糖的提取率、多糖、糖醛酸及蛋白含量
[0062][0063]
注：此处纯化多糖是中性糖级分和酸性糖级分混合后所测得结果
[0064]
经微波提取的人参粗多糖，采用苯酚-硫酸法测得人参多糖得率为69.34％
±
0.07。采用棉状deae纤维素对人参粗多糖进行纯化，以此来提高人参多糖的分离效果。纯化前后人参多糖的纯度、蛋白质及糖醛酸的含量见表1。多糖纯度及糖醛酸含量明显提高，说明棉状deae纤维素能够有效的对人参多糖进行纯化。蛋白质含量增高，推测可能存在糖蛋白。
[0065]
实施例2人参多糖的分离
[0066]
deae-52上样及洗脱。具体的是称取纯化后的人参多糖，用5ml蒸馏水将其溶解，上样时沿柱壁缓慢加入，防止填料飞起，导致上样不均匀。先用蒸馏水洗脱中性糖级分；酸性糖级分依次用0.1mol/l、0.2mol/l、0.3mol/l nacl水溶液相继洗脱，流速为1ml/min，分瓶收集，每5min收集一瓶，每瓶为5ml。用苯酚-硫酸法测定每瓶液体的吸光度，以小瓶序号为横坐标，以吸光度a为纵坐标绘制洗脱曲线，结果如图1所示。
[0067]
如图1所示，经棉状deae纯化之后又经deae-52纤维素分离得到洗脱曲线，从洗脱曲线可以看出有4个存在，它们从剖面上来看被洗脱为单一的和对称的锐峰，这表明了样品的均匀性和高纯度。分别命名为gsp-0、gsp-1、gsp-2、gsp-3，经过浓缩、透析、冷冻干燥，备用；其中gsp-0是蒸馏水溶液洗脱获得的，gsp-1是0.1mol/l的nacl水溶液洗脱获得的，gsp-2是0.2mol/l的nacl水溶液洗脱获得的，gsp-3是0.3mol/l的nacl水溶液洗脱获得的。
[0068]
实施例3人参多糖的结构表征
[0069]
1.紫外光谱测定及分析
[0070]
取2.00mg的分离后人参多糖溶解在2ml蒸馏水中，然后在200～800nm范围内用紫外分光光度计进行扫描，记录紫外吸收光谱。
[0071]
紫外分析：扫描范围在200-800nm范围内。从图2中可以看出，gsp-0、gsp-1检测到蛋白质的吸收峰，说明这两种多糖可能存在糖蛋白，与纯化阶段的理化性质推测一致。从图2中可以看出，gsp-2和gsp-3，光谱曲线比较平滑，表明gsp-2和gsp-3中蛋白质和核酸杂质已降至最低量或不存在。
[0072]
2.红外光谱及二阶导数的测定及分析
[0073]
精密称取纯化分离后人参多糖2mg和干燥后的溴化钾100mg混匀，用玛瑙研钵研磨后压片，在红外光谱分析仪中4000cm-1
～400cm-1
扫描，连续扫描32次，测定样品吸收峰，扫描样品前扫除空气峰多糖。采用omnic软件对获得的光谱进行吸光度归一化、基线校正和平滑处理，再通过origin8.0软件处理。
[0074]
根据红外光谱中各种特征峰的位置和形状可以推断出多糖结构的某些特征。如图3所示，gsp-0、gsp-1、gsp-2、gsp-3四个组分的oh伸缩振动在3370～3450cm-1
处显示出宽而强的振动峰，表明多糖中存在分子内和分子间氢键。在2927cm-1
处显示出的吸收峰，是多糖
中的亚甲基c-h的吸收峰。1414cm-1
、1632cm-1
左右显示的峰为c＝o的对称与不对称振动吸收峰。在1000到1200cm-1
之间的区域为骨骼c-o和c-c振动吸收峰，对比来看gsp-0、gsp-1在1150cm-1
处左右有糖醛酸的特征吸收峰。gsp-0、gsp-1、gsp-2在855cm
–1、1026cm
–1的峰表示这一级分由α-吡喃糖苷键连接而成。由此推测gsp-0、gsp-1、gsp-2、gsp-3是由α-糖苷键连接而成的，含有不同功能基团的吡喃杂多糖结构。
[0075]
二阶导数光谱可以提高一维光谱的分辨率，一些红外光谱上的重叠峰在二阶导数红外光谱上分离开来，吸收峰的位置更加准确，可进行更细致的比较，如图4所示，在二阶导数的处理下，许多被掩盖的吸收峰显现出来。一维图谱中gsp-1，gsp-2、gsp-3在1740cm
–1的峰比较微弱，而在二维图谱中可以清楚的看到有1740cm
–1的吸收峰，证明含有酯羰基。在1200～1000cm
–1之间，各样品中出现吸收、1081是多糖的特征吸收峰，归属于吡喃糖环特征构，此外，gsp-0、gsp-1，gsp-2、在762cm
–1和左右的典型吸收表明d-吡喃糖基环的c-o-c对称振动峰，从图中可看出gsp-3不含有c-o-c对称振动峰，gsp-0、gsp-1在923cm
–1为β-型糖苷键连接。通过一阶导数和二阶导数结合推测，gsp-0，gsp-1既存在β-型糖苷键，又存在α-糖苷键。
[0076]
在多处波长下，一阶导数与二阶导数图谱结合可以更好的出体现4种多糖的差异性，可以推导出更加准确的数据和结果。
[0077]
3.单糖组成分析
[0078]
准确称取2～3mg分离后的人参单体多糖样品，置于反应釜中，加入2ml 2mol/l的三氟乙酸水溶液，封口放入110℃烘箱中水解5h，取上清液蒸干，用甲醇重复洗涤3次，蒸干得水解产物；取水解产物，加入0.2ml 0.5mol/l的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液和0.2ml 0.3mol/l的naoh水溶液于70℃水浴加热60min，冷却后加入0.2ml 0.3mol/l的hcl水溶液中和，再加入1ml氯仿萃取，离心去除上清液，重复3次，通过0.45μl滤膜过滤，即为衍生化后溶液，再过滤，进行高效液相色谱分析，计算各单糖的量。hplc条件：分离hplc条件：分离柱：ods2 c18柱(250
×
4.6mm2，5mm)，流动相：乙腈-0.05mol/ml磷酸盐缓冲ph＝6.8(体积比为18:82)，流速：0.8ml/min，柱温：30℃，紫外检测器，检测波长为245nm，进样量为20μl。甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖作为标准品。如表2得单糖及其摩尔比。
[0079]
表2 gsp-0、gsp-1、gsp-2、gsp-3的单糖组成及摩尔比
[0080][0081]
从表2显示四种多糖的单糖组成及摩尔比，采用高效液相色谱法测定单糖组成，gsp-0、gsp-1、gsp-2、gsp-3主要由核糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖组成，从结构上看，它们的单糖组成相似，且都含有葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸，这与红外的结果一致。在前人对人参多糖成分的研究主要集中在提取和纯化等方面，与其他种类的人参多糖相比，它们具有较丰富的单糖组合，尤其是具有较高比例的葡萄糖和阿拉伯糖。
[0082]
4.分子量分析
[0083]
采用高效凝胶渗透色谱测定相对分子量，示差检测器检测其纯度。标准曲线线性回归方为：
[0084]
log(mw)＝13.87440-5.01843x 0.96087x
2-0.07993x3[0085]
mw:重均分子量x：保留时间
[0086]
表3 gsp-0、gsp-1、gsp-2、gsp-3分子量
[0087][0088]
通常情况下，具有生物活性的多糖其分子量分布呈一定的规律性，具有不同活性功能其分子量也在不同的范围内,分子量过高或者过低都会对其结构和生物活性有一定的影响。如表3所示gsp-0、gsp-1、gsp-2和gsp-3的重均分子量分布范围在1.76～9.24
×
105da。多分散指数是指重均/数均的的比值，指数越接近1，分子量分布较窄且成均一对称。gsp-2的多分散指数为0.357，由于分子量大，表观粘度或水溶性差或结构复杂的构象，这些高分子量多糖的生物学活性受到限制。所以探索低分子量生物活性多糖是对于探索新的开
发产品的需求。
[0089]
5.人参多糖螺旋构型的测定
[0090]
用紫外-可见分光光度法分析刚果红与多糖的相互作用确定三螺旋构型。将各组分的样品水溶液1mg/ml与2ml刚果红溶液(80μmol/l)混合，然后将混合物逐渐加入1mol/l的naoh溶液，形成最终浓度为0mol/l、0.1mol/l、0.2mol/l、0.3mol/l、0.4mol/l和0.5mol/l的naoh混合液。将混合物在暗室温度下保持5min。在200～800nm范围内进行紫外-可见吸收光谱全波长扫描，记录最大吸收波长。
[0091]
采用刚果红-多糖配合物比色光度法测定了不同氢氧化钠浓度下多糖的构象转变，据文献报道，具有三重螺旋结构的多糖将经历螺旋-螺旋的转变，随着碱浓度的增加,和λmax顺序显示红移和蓝移，并且三螺旋结构可以赋予多糖更高的生物活性。在本研究中，人参多糖与刚果红的复合物在不同naoh浓度显示如图5显示，可以看到naoh浓度从0mol/l上升到0.5mol/l，4个组分的人参多糖与刚果红复合物最大吸收波长红移，与单独使用刚果红时的蓝移趋势相反，因此，4个组分的人参多糖存在三重螺旋构象，说明规则的空间构像与多糖的生物学活性密切相关。
[0092]
实施例4人参多糖免疫调节活性
[0093]
1.细胞培养
[0094]
raw264.7细胞系是从中国科学院(上海)的类型培养标本中获得的小鼠巨噬细胞系。将细胞培养在完全培养基(添加10％fetal bovine serum(fbs)、1mmol/l丙酮酸钠、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素的dulbecco's modification of eagle's medium dulbecco(dmem))中，并将其保持在37℃的湿润5％co2培养箱中。将细胞培养36-48h，达到对数相，然后用于实验。
[0095]
1.1人参多糖对raw264.7细胞增殖能力的影响
[0096]
人参多糖对raw264.7细胞增殖能力的影响通过mtt分析进行评估。将细胞悬浮于培养基中，以1
×
105cell/孔的密度接种于96孔板中，并孵育(37℃，5％co2)12h。将多糖样品以不同浓度(25、50、100、200、400、800μg/ml)溶解于培养基中并施加到细胞上。脂多糖(lps，25μg/ml)和不添加多糖的完整培养基分别为阳性和空白对照。培养24h后，向每个孔中添加10μl mtt溶液(5mg/ml)。在37℃下用5％的co2继续培养4h。随后，丢弃上清液，通过向每个孔中添加100μl二甲基亚砜，将平板摇晃并放置在黑暗中10min，以确保产生的紫色晶体完全溶解。最后，使用酶标仪在490nm处测定其吸光度吸光度。细胞存活率公式计算如下：
[0097][0098]
采用mtt法检测gsp促进raw264.7细胞的增殖能力，结果如图6所示。从图中可以看出在25～400μg/ml范围内，gsp-0、gsp-1、gsp-2的细胞活力均大于空白对照，表明了3个组分对raw264.7细胞的增殖有一定的促进作用。gsp-0、gsp-1、gsp-2、gsp-3的增殖指数在浓度为25～50mg/ml时达到最高值，与空白对照组相比有显著性的差异。gsp-3在200mg/ml～800mg/ml处均没有作用，推测浓度高时候会对细胞有轻微的毒性作用。
[0099]
1.2人参多糖对raw264.7细胞吞噬能力的影响
[0100]
用中性红方法测定了raw264.7细胞的吞噬活性。将96孔板中对数生长期的
raw264.7细胞悬浮于培养基中培养24h，然后将上清液转移到新的96孔板中，以测定一氧化氮含量。raw264.7细胞吞噬能力的中性红吞噬试验。去除上清液后，用pbs洗涤两次，去除非黏附细胞，每孔加入100μl中性红溶液(0.075％，g/g)。培养1h，然后弃去上清液。为了去除多余的中性红溶液，用pbs洗涤细胞两次。此后，添加100μl细胞裂解液(乙醇：1.0mol/l乙酸＝1：1，v/v)，并将板置于室温下过夜。用酶标仪在490nm处测量其吸光度。吞噬指数的计算公式如下：
[0101][0102]
中性红实验是检验其吞噬能力的手段之一，中性红实验结果如图7，与空白对照相比，四个组分多糖在25～400μg/ml的浓度范围内都对raw264.7细胞的吞噬能力有促进作用，在100～400μg/ml浓度范围内吞噬作用显著。由图7可以看出gsp-2组分促进作用呈上升趋势,相对来说活性较好，吞噬作用显著。
[0103]
1.3人参多糖对raw264.7细胞分泌no的影响
[0104]
利用griess反应通过测定培养的raw264.7细胞培养基上清液中的亚硝酸盐浓度测定一氧化氮(no)的产生。吞噬试验中在96孔板中收集的上清液，与等体积的griess试剂(5％磷酸中的0.1％n-1-萘基乙二胺二盐酸盐)混合，在黑暗中保持室温10min，用酶标仪测量490nm处的吸光度，计算亚硝酸盐浓度。通过与no标准品比较。
[0105]
已有研究证实，巨噬细胞产生的一氧化氮(no)参与了各种细胞内的病原体以及肿瘤细胞的破坏，并将细胞置于细胞停滞状态。no分泌量结果如图8，与空白对照相比，gsp-0、gsp-1、gsp-2、gsp-3在25～800μg/ml浓度范围内都能刺激raw264.7巨噬细胞分泌no，且gsp-1、gsp-2、gsp-3组分在50～400μg/ml浓度范围刺激作用有随浓度增加而增大的趋势。
[0106]
图6-8中gsp-0、gsp-1、gsp-2、gsp-3的测试结果中柱形图的排列顺序为空白(blank)、lps、浓度25-800μg/ml依次增加的顺序。
[0107]
实施例5人参多糖gsp-2的抗肿瘤活性
[0108]
1.1细胞培养
[0109]
人结直肠癌细胞hct-116、hct-8、sw48，培养条件：以rpmi-1640培养液、10％胎牛血清，于37℃、5％co2培养箱恒温培养。人结直肠癌细胞caco2，培养条件：以dmem培养液、10％胎牛血清，于37℃、5％co2培养箱恒温培养。人结直肠癌细胞ht-29，培养条件：以mccoy's 5a培养液、10％胎牛血清，于37℃、5％co2培养箱恒温培养。
[0110]
1.2药物配置
[0111]
药物配置：称取适量阳性药lps及受试药物人参多糖gsp-2，用pbs溶液进行溶解，药物终浓度为2mg/ml，分装后4℃储存。lps和人参多糖进行实验中，稀释到要求药物浓度进行相关实验。
[0112]
1.3 cck-8法检测细胞存活率。
[0113]
将生长良好的各细胞用含10％胎牛血清的培养液重悬，调整细胞浓度为4
×
104个/ml，每孔加入100μl细胞悬液，在37℃、5％co2培养箱中培养24h。更换各孔中完全培养液为100μl含不同人参多糖浓度的培养液(0μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml)。将加入人参多糖的细胞在细胞培养箱中孵育48h。48h后，通过排枪向每个孔中加入10μl cck-8溶液。加入cck-8后，在培养箱中孵育4h。读取前，摇动1min以均匀摇动液体的颜色，以
防止气泡影响酶标仪的读数。使用酶标仪检测450nm处的吸光度。计算药物作用下的细胞生存率和抑制率：
[0114]
生存率＝(od(加药组)/od(空白组))
×
100％；
[0115]
抑制率＝(1-od(加药组)/od(空白组))
×
100％。计算药物作用的ic
50
值并作图根据药物，抑制率和药物作用浓度，使用graphpad prism作图。
[0116]
考察人参多糖gsp-2对hct-116、hct-8、ht-29、sw48及caco2细胞的细胞毒作用，人参多糖gsp-2作用时间为48h。结果显示，人参多糖gsp-2对caco2和hct-8几乎无细胞毒作用，对hct-116、ht-29和sw48则表现出生长抑制作用，其中hct-116细胞最敏感，hct-116在400mg/ml最大浓度下的细胞毒性最大。最大药物浓度对细胞的毒杀作用约为40％，并随用药浓度的增加其细胞毒性，各个细胞在不同药物浓度作用下的生存率如图9所示。
[0117]
图9为gsp-2对5种结直肠癌细胞48h细胞增殖抑制作用。图图a、b、c、d、e、分别为hct-116、ht-29、sw48、caco2及hct-8细胞有lps(50μg/ml)处理的存活率柱状图，与blank组对比，ns，no significance，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001。
[0118]
实施例6人参多糖gsp-2的核磁表征
[0119]
核磁共振(nmr)谱记录在bruker drx-500nmr光谱仪(bruker biospin,rheinstetten,germany)上，使用d2o作为溶剂。分别在128k和32k下进行了1h-nmr和
13
c-nmr谱图。
[0120]
如图10所示，在δ5.27ppm、δ5.18ppm、δ5.02ppm、δ4.91ppm、δ4.79ppm.、δ4.71ppm、δ4.62.ppm、δ4.61ppm处有8个信号，代表gsp-2有8个单糖种类，这与单糖组成结果一致；5.0ppm是区分化喃糖构型的质子信号的临界值，若样品首氢上的质子位移大于5.0ppm为α-型糖苷，小于为β-型糖苷，所以推测gsp-2为α-型糖苷构型。在4.70ppm时的1h信号属于d2o。在1h质子区，化学物质从3.30ppm转移到4.41ppm，分配给糖环碳-2的质子到碳-6的质子，这些信号是典型的峰值多糖，1.98ppm左右的信号表明gsp-2已被乙酰化，信号在1.07和1.20ppm表示鼠李糖的甲基群，这与红外结果一致。
[0121]
如图11所示，在核磁
13
c谱中，可以根据一些出现在特殊位置的碳信号确定单糖种类和某些特殊基团。在
13
c nmr异场区，107.0-109.3ppm的信号分配给araf，而102.7-104.5ppm的信号分配给galp和glcp。16.10ppm
→
2,4)-α-rhap-(1
→
连接；76.15ppm表示c-4取代，为
→
4)-α-galpa-(1
→
连接；78.69ppm表示c3取代，为
→
5)-α-araf-(1
→
连接。结果表明，gsp-2为
→
4)-α-galpa-(1
→
和
→
5)-α-araf-(1
→
连接和
→
2,4)-α-rhap-(1
→
连接，与单糖组成结果一致。
[0122]
结果表明，gsp-0、gsp-1、gsp-2、gsp-3在一定的浓度范围内，对raw264.7细胞都具有免疫刺激作用。据报道，多糖具有免疫活性，这与它们的单糖组成、分子量、三螺旋结构或糖醛酸含量有关，gsp-0、gsp-1、gsp-2、gsp-3中gsp-2的glua的摩尔比例为2.59:0.39：1.45:1.30,糖醛酸、葡萄糖、甘露糖受体、丰富的单糖成分、对巨噬细胞的活化起着关键的重要作用。据文献报道显示，分子量相对较低或中等、糖醛酸含量较高的多糖具有较高的免疫调节活性。通过三个实验的对比，其中gsp-2的免疫活性是最好的。gsp-2在四个组分中分子量最低1.76
×
105da，这可能归因于它的分子量较小。gsp-2具有三螺旋结构，三螺旋结构有利于生物活性的提高。推测gsp免疫活性好，原因之一可能是具有三螺旋结构。人参多糖gsp-2对hct-116、ht-29和sw48则表现出生长抑制作用，对这三种抗肿瘤细胞有效，其中
hct-116细胞最敏感，推测与三螺旋结构，糖醛酸，分子量有关。此外，多糖的单糖链接方式和高级构型也影响多糖的免疫调节和抗肿瘤活性，gsp-2为α糖苷键连接的多糖，由
→
4)-α-galpa-(1
→
和
→
5)-α-araf-(1
→
连接和
→
2,4)-α-rhap-(1
→
连接。因此，其结构-功能关系有待于进一步研究。
[0123]
总结：
[0124]
本发明中，经微波提取、棉状deae纤维素纯化、deae-52柱层析分离得到了四个组分多糖gsp-0、gsp-1、gsp-2、gsp-3。在研究人参多糖结构与免疫和抗肿瘤活性的构效关系时，综合考率到单糖组成、分子量、官能团，糖苷键的连接方式等因素对免疫和抗肿瘤活性的影响，并首次证明了人参多糖具有三股螺旋结构的空间构像，极大的提高了人参多糖的免疫和抗肿瘤活性。接下来将对各糖苷键的连接顺序，以及支链的构型等进行研究，并进一步深入研究人参多糖的结构、生物活性以及构效关系,为推动人参多糖类新药的发现与研究提供理论支持。
[0125]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明的构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种具有免疫活性和抗肿瘤的人参单体多糖的分离方法，包括如下步骤：(1)取人参多糖，以水为提取剂，采用微波提取法进行提取得人参粗多糖，提取后采用苯酚-硫酸法测定人参粗多糖的含量，提取率；(2)采用预处理后的棉状deae纤维素，对人参粗多糖进行纯化得纯化后的人参多糖；(3)采用deae-52纤维素对纯化后的人参多糖进行分离，依次用蒸馏水、0.1mol/l、0.2mol/l、0.3mol/l nacl水溶液相继洗脱，流速为1ml/min，得人参单体多糖gsp-2。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述微波提取法进行提取的具体方法为：取人参粗多糖粉末5g经微波提取，温度为70℃，料液比为1：30mg/ml，提取功率为550w，提取时间为6min，提取后浓缩、干燥即得人参粗多糖。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：deae纤维素预处理为：先将deae纤维素干粉浸泡于蒸馏水中，在0.5mol/l的hcl水溶液中浸泡1～2h，再用蒸馏水洗至滤液ph值为中性，将抽干后的deae纤维素在0.5mol/l的naoh溶液中1～2h，再用蒸馏水将滤液ph值洗至中性，然后装柱；所述采用棉状deae纤维素对人参多糖进行纯化为：上样浓度为10.0mg/ml，上样体积为50ml，流速为1.0ml/min，洗脱液为蒸馏水和0.3mol/l的nacl水溶液；蒸馏水洗脱得到中性糖级分,0.3mol/l nacl水溶液洗脱得到酸性糖级分；收集过柱后的洗脱液，分别旋转蒸发浓缩；然后将多糖溶液装入透析袋用蒸馏水透析24h，期间换水，将多糖溶液进行浓缩、冷冻干燥，得纯化后人参多糖。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述deae-52纤维素对纯化后的人参多糖进行分离的具体步骤为：分别称取纯化后的中性糖级分和酸性糖级分的人参多糖，用5ml蒸馏水将其溶解，上样时沿deae-52纤维素柱壁缓慢加入，防止填料飞起导致上样不均匀；先用蒸馏水洗脱中性糖级分；酸性糖级分依次用0.1mol/l、0.2mol/l、0.3mol/l nacl水溶液相继洗脱，流速为1ml/min，分瓶收集；0.2mol/l的nacl水溶液洗脱收集得单体多糖gsp-2。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述gsp-2的平均分子量1.76
×
105da，按照摩尔比计算，gsp-2中甘露糖：核糖：鼠李糖：葡萄糖糖醛酸：半乳糖醛酸：葡萄糖：半乳糖：阿拉伯糖＝0.56:0.62：1:1.45:0.67:2.31:2.46:3.30。6.一种权利要求4所述的方法得到的gsp-2的用途，其特征在于：用于制备治疗人结直肠癌的药物，所述人结直肠癌为hct-116、ht-29、sw48细胞对应的癌症中的任意一种或多种。7.一种权利要求6所述的方法得到的gsp-2的用途，其特征在于：用于制备治疗人结直肠癌的药物，所述人结直肠癌为hct-116、ht-29和sw48三种细胞对应的癌症。8.根据权利要求6所述的用途，其特征在于：所述癌症为hct-116细胞对应的结肠癌。9.一种具有免疫和抗肿瘤活性的人参单体多糖的表征方法，所述具有免疫和抗肿瘤活性的人参单体多糖由权利要求1-6任一方法所得，包括如下步骤：(1)紫外吸收光谱检测：取分离后人参单体多糖溶解在蒸馏水中，然后在200～800nm范围内用紫外分光光度计进行扫描，记录紫外吸收光谱，目的是检测人参单体多糖是否有蛋白质和核酸；(2)红外光谱检测：
精密称取纯化分离后人参单体多糖和干燥后的溴化钾混匀，用玛瑙研钵研磨后压片，在红外光谱分析仪中4000cm-1
～400cm-1
扫描，测定样品吸收峰，扫描样品前扫除空气峰多糖，目的是测量人参单体多糖的官能团和糖苷键方式；(3)采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮衍生化法对人参单体多糖进行高效液相色谱分析：准确称取2～3mg分离后的人参单体多糖样品，置于反应釜中，加入2ml 2mol/l的三氟乙酸水溶液，封口放入110℃烘箱中水解5h，取上清液蒸干，用甲醇重复洗涤3次，蒸干得水解产物；取水解产物，加入0.2ml 0.5mol/l的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮的甲醇溶液和0.2ml 0.3mol/l的naoh水溶液于70℃水浴加热60min，冷却后加入0.2ml 0.3mol/l的hcl水溶液中和，再加入1ml氯仿萃取，离心去除上清液，重复3次，通过0.45μl滤膜过滤，即为衍生化后溶液，再过滤，进行高效液相色谱分析，计算各单糖的量；(4)采用高效液体积排阻法结合示差折光检测器在以下条件下测定人参单体多糖的分子量；取20μl 2.0mg/ml分离后人参单体多糖样品水溶液，通过孔径为0.45μm过滤器，注入规格为8.0mm
×
300mm2的shodex sugar ks-804柱中，在色谱条件下进样并进行分析，记录峰面积，代入回归方程求各组分的相对分子质量；标准曲线线性回归方为：log(mw)＝13.87440-5.01843x 0.96087x
2-0.07993x3mw:重均分子量x：保留时间(5)采用刚果红实验对人参多糖进行分析：将人参单体多糖样品水溶液1mg/ml与2ml 80μmol/l刚果红溶液混合，然后将混合物逐渐加入1mol/l的naoh水溶液，形成最终浓度为0mol/l、0.1mol/l、0.2mol/l、0.3mol/l、0.4mol/l和0.5mol/l的naoh混合液；将混合物在暗室温度下保持5min；在200～800nm范围内进行紫外-可见吸收光谱全波长扫描，记录最大吸收波长。10.根据权利要求9所述的表征方法，其特征在于：所述高效液相色谱分析的条件为：分离柱为ods2 c18柱，流动相为乙腈与0.05mol/ml ph＝6.8磷酸盐缓冲，其中乙腈与磷酸盐缓冲液的体积比为18:82，流速：0.8ml/min，柱温：30℃，紫外检测器，检测波长为245nm，进样量为20μl。

技术总结
本发明涉及药物开发功能性食品领域，具体涉及一种具有免疫调节和抗肿瘤活性的人参多糖的表征方法。本发明通过微波提取法进行人参多糖GSP的提取，采用棉状DEAE进行纯化，DEAE-52柱层析进一步分离，得到人参单体多糖。采用UV、IR、HPLC、NMR等仪器对人参多糖不同组分进行表征。刚果红实验首次证明四个组分均具有三螺旋结构。红外显示，GSP-2含有α-型的特征吸收峰；二阶导数分析多糖由α-型和β-型糖苷键连接。在体外研究了这些组分的免疫调节和抗肿瘤作用，得出GSP-2组分免疫活性较好，有望作为潜在的免疫调节剂，用于功能性食品或药物的开发。发。发。


技术研发人员：周鸿立 曹冬雪 赵晶丽
受保护的技术使用者：吉林化工学院
技术研发日：2020.07.01
技术公布日：2022/5/25