用于组织工程的梯度降温冷冻干燥方法

1.本发明属于冷冻干燥技术领域，具体涉及一种用于组织工程的梯度降温冷冻干燥方法。


背景技术：

2.冷冻干燥技术是目前被广泛应用的一种冻干工艺，在食品、药品、再生医学领域均有良好的应用前景。对于组织工程而言，冷冻干燥也是生物材料多孔支架制备的常用方法之一。目前常用的冷冻干燥技术多为通过对样品进行预冻，将样品转移入预冷的冷冻干燥机中直接抽真空进行冷冻干燥。在这一过程中干燥仓与样品放置板温差可达10-50℃，同时干燥仓温度恒定，难以根据溶剂的具体升华温度需要进行调控。一方面，常规快速降温方法导致的大温差会导致样品底部与表层温差较大，样品在冷冻干燥过程中会反复出现结晶溶解现象，形成不均匀结构，乃至底部结构坍塌萎缩。另一方面，干燥仓与样品放置板温度可控度不够，对不同样品的适配度较低，导致不同样品在采用这种常规快速降温冷冻干燥技术时制得的样品差异性大，质量不稳定，如图1所示。


技术实现要素：

3.针对现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种用于组织工程的梯度降温冷冻干燥方法。
4.为达到上述目的，本发明的解决方案是：
5.一种用于组织工程的梯度降温冷冻干燥方法，该梯度降温冷冻干燥方法在冷冻干燥机中进行，冷冻干燥机包括加热仓和内仓，加热仓活动连接于内仓上，加热仓内设有若干平行的样品放置板，内仓包括一体连接的干燥仓和冷肼，干燥仓位于冷肼上，干燥仓的一侧外接水环泵，冷肼的另一侧外接罗茨泵。具体地；
6.(1)、将待冻干样品或样品溶液置于模具中，然后放入样品放置板；
7.(2)、利用共晶点检测仪通过反复升温及降温测定其共晶点范围，根据需要冻干的溶剂类型测定溶剂共晶点，然后将干燥仓预冷至高于溶剂共晶点的1-2℃，保持0.5-3h，直至样品开始降温预冻，样品的底层及表层温度基本一致；
8.(3)、预冷结束后，对干燥仓整体进行降温，将干燥仓降温至溶剂共晶点以下5-10℃，降温结束后维持1-3h，直至样品完全冻结；
9.(4)、对干燥仓进行二次降温，根据溶剂类型将干燥仓降温至溶剂升华温度，同时利用水环泵和罗茨泵进行抽真空；
10.(5)、将样品放置板逐渐升温至(-50)-0℃，干燥12-72h；
11.(6)、冻干结束后，继续对加热仓内的样品放置板升温至25-30℃，保持1-5h，冻干结束，得到样品。
12.步骤(1)中，待冻干样品或样品溶液为可用于组织工程的样品，目的是保证组织工程支架在制备过程中孔结构稳定，纳米纤维、编织物、相分离支架等都属于组织工程支架类
型。
13.优选地，步骤(2)中，溶剂选自超纯水、乙醇、六氟异丙醇、二甲基亚砜、二氯甲烷和1,4-二氧六环中的一种以上；溶剂共晶点的温度为(-50)-10℃。
14.步骤(2)中，预冷过程中，样品可待干燥仓降温至设定温度后再转入干燥仓内，降温过程为梯度逐步降温，而非常规快速降温预冻。
15.优选地，步骤(3)中，降温的速率为1-10℃/h。降温速率为恒速或变速，具体降温速率依照溶剂共晶点范围确认，如恒速降温速率为5℃/h降温至溶剂共晶点下，或者变速则为降温速率为1-10℃/h降温至溶剂共晶点下。
16.优选地，步骤(4)中，降温的速率为5-20℃/min，溶剂升华温度为(-120)-(-20)℃，真空度为1-100pa。
17.其中，步骤(3)为降温至溶剂共晶点之下，使溶剂开始结晶，步骤(4)为二次降温，降至溶剂升华点使溶剂开始升华，降温过程为梯度逐步降温，两次分开降温的目的是让溶剂在结晶过程中晶格形成更加稳定均一，不会像普通一步冷冻快速降温导致不均匀。
18.优选地，步骤(5)中，升温的速率为1-25℃/h，进一步优选为5-25℃/h。由于加热仓和干燥仓分开设置，二者具有独立的温度设置与监控系统，可以实现二者温度独立设置，互不干扰。抽真空则是二者共同进行抽真空。
19.优选地，步骤(6)中，升温的速率为0.1-10℃/min，进一步优选为0.1-5℃/min；升温过程中真空度为1-100pa。
20.其中，干燥仓的温度调控区间为(-120)-30℃，对应整个冷冻干燥过程；样品放置板的温度调控区间为(-120)-30℃，样品放置板的温度在步骤(1)至步骤(4)中与干燥仓维持一致。在未进行抽真空处理前的降温过程中，样品放置板与干燥仓一起降温，即样品放置板在未启动升温状态下，冷冻干燥机机器内温度与干燥仓一致，都处于降温状态。
21.综上，本发明的梯度降温冷冻干燥：样品冻干过程中通过控制干燥仓和样品放置板温度，精准控制，逐渐降温，而非一步式降温，不会出现温差过大，样品反复冻融。避免了现有冷冻干燥方式中将干燥仓降温至固定温度，如-50℃之后，放入样品然后进行抽真空冷冻干燥，温度及真空度基本恒定，冷冻过程中温差过大，容易出现冻融现象，不利于样品冻干及样品结构保持。
22.由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
23.本发明通过梯度冷冻干燥方法对样品进行前期预冻，使干燥仓温度高于样品溶剂共晶点的1-2℃后，根据样品量维持温度0.5-3h，直至样品的底层及表层温度基本一致；预冷结束后以较慢速率对干燥仓整体进行降温，直至整体温度低于样品溶剂共晶点，维持1-3h，直至样品完全冻结，确保样品在冷冻过程中，冷冻温度均匀，降低样品底层与表层温度差异；对干燥仓进行二次降温过程中加快降温速率，直至温度达到溶剂升华温度，进行抽真空；同时开始对样品放置板进行逐步升温，保证样品底层与表层溶剂升华速率相近，不会出现反复冻融导致结构坍塌，冻干结束后将整体温度逐渐升高至室温得最终样品。
24.本发明通过在冷冻干燥环节中进行控制，预冻物结晶高效，冷冻效率高，样品孔结构均一，可用于制备具有稳定性结构的组织工程支架，且其制备方法简单高效，价格低廉，具有很好的应用前景。
附图说明
25.图1为现有技术中快速冷冻干燥制备的组织工程支架sem示意图。
26.图2为本发明实施例1经由梯度冷冻干燥方法制备的组织工程支架sem示意图。
27.图3为本发明实施例1中冷冻干燥机的结构示意图。
28.附图标记：1-样品放置板、2-仓门、3-加热仓、4-干燥仓、5-冷阱、6-内仓、7-水环泵、8-罗茨泵。
具体实施方式
29.本发明提供了一种用于组织工程的梯度降温冷冻干燥方法。
30.以下结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。
31.实施例1：
32.将样品溶液浇筑于方形模具中，然后转移至样品放置板1；检查内仓6有无异常，关闭仓门2，打开冷阱5对冷冻干燥机的干燥仓4进行降温预冷，降温速率为5℃/min，降至4℃后维持0.5h；采用1℃/min降温速率将干燥仓4及样品放置板1温度降至-30℃，保持3h，调节冷冻干燥机干燥仓4的温度，将温度降至-50℃，保持2h，打开水环泵7及罗茨泵8进行抽真空，至真空度达到30pa以下。对加热仓3进行升温，以20℃/h速率将样品放置板1升温至-20℃，保持72h冻干结束后继续对加热仓3进行升温，以1℃/min速率将样品放置板1升温至-10℃，保持2h后依照同样速率将样品放置板1升温至0℃，保持2h；同样速率升温至10℃，保持2h；以10℃/h速率将样品放置板1升温至25℃，维持2h，关闭水环泵7及罗茨泵8，关闭干燥仓4和样品放置板1，完成整个冷冻干燥过程，最终成品率高达90％以上，组织工程支架的形貌如图2所示。
33.实施例2：
34.将待冻干样品置于方形模具中，然后转移至样品放置板1；检查内仓6有无异常，关闭仓门2，打开冷阱5对冷冻干燥机的干燥仓4进行降温预冷，降温速率为10℃/min，降至-10℃后维持2h；采用5℃/h降温速率将干燥仓4及样品放置板1温度降至-40℃，保持3h，调节冷冻干燥机中干燥仓4的温度，以5℃/min速率将温度降至-98℃，保持5h，打开水环泵7及罗茨泵8进行抽真空，至真空度达到30pa。对加热仓3进行升温，以5℃/h速率将样品放置板1升温至-50℃，保持72h；冻干结束后继续对加热仓3进行升温，以1℃/min速率将样品放置板1升温至-20℃，保持1h后，依照同样速率将样品放置板1升温至0℃，保持1h；同样速率升温至10℃，保持1h；以10℃/h速率将样品放置板1升温至30℃，维持1h，关闭冷冻干燥机，完成整个冷冻干燥过程，最终成品率高达90％以上。
35.上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种用于组织工程的梯度降温冷冻干燥方法，其特征在于：所述梯度降温冷冻干燥方法在冷冻干燥机中进行，所述冷冻干燥机包括加热仓和内仓，所述加热仓活动连接于内仓上，所述加热仓内设有若干平行的样品放置板，所述内仓包括一体连接的干燥仓和冷肼，所述干燥仓位于冷肼上；具体地，(1)、将待冻干样品或样品溶液置于模具中，放入所述样品放置板；(2)、根据需要冻干的溶剂类型测定溶剂共晶点，然后将干燥仓预冷至高于溶剂共晶点的1-2℃，保持0.5-3h，直至样品开始预冻；(3)、预冷结束后，将所述干燥仓降温至溶剂共晶点以下5-10℃，降温结束后维持1-3h；(4)、根据溶剂类型将所述干燥仓降温至溶剂升华温度，同时进行抽真空；(5)、将所述样品放置板升温至(-50)-0℃，干燥12-72h；(6)、冻干结束后，继续对所述加热仓内的样品放置板升温至25-30℃，保持1-5h，冻干结束。2.根据权利要求1所述的用于组织工程的梯度降温冷冻干燥方法，其特征在于：步骤(2)中，所述溶剂选自超纯水、乙醇、六氟异丙醇、二甲基亚砜、二氯甲烷和1,4-二氧六环中的一种以上；所述溶剂共晶点的温度为(-50)-10℃。3.根据权利要求1所述的用于组织工程的梯度降温冷冻干燥方法，其特征在于：步骤(3)中，所述降温的速率为1-10℃/h。4.根据权利要求1所述的用于组织工程的梯度降温冷冻干燥方法，其特征在于：步骤(4)中，所述降温的速率为5-20℃/min，溶剂升华温度为(-120)-(-20)℃，真空度为1-100pa。5.根据权利要求1所述的用于组织工程的梯度降温冷冻干燥方法，其特征在于：步骤(5)中，所述升温的速率为1-25℃/h。6.根据权利要求1所述的用于组织工程的梯度降温冷冻干燥方法，其特征在于：步骤(6)中，所述升温的速率为0.1-10℃/min，升温过程中真空度为1-100pa。

技术总结
本发明提供了一种用于组织工程的梯度降温冷冻干燥方法，该方法包括将待冻干样品放入冷冻干燥机中冷冻，冷冻过程中对干燥仓进行逐步梯度降温；对干燥仓进行二次降温过程中加快降温速率，直至温度达到溶剂升华温度，进行抽真空；同时开始对样品放置板进行逐步升温，保证样品底层与表层溶剂升华速率相近，不会出现反复冻融导致结构坍塌，冻干结束后将整体温度逐渐升高至室温得最终样品；本发明通过在冷冻干燥环节中进行控制，预冻物结晶高效，冷冻效率高，样品孔结构均一，可用于制备具有稳定性结构的组织工程支架，且其制备方法简单高效，价格低廉，具有很好的应用前景。具有很好的应用前景。具有很好的应用前景。


技术研发人员：朱同贺 杜娟 陈思浩 包一鸣 陈晨 邢晨晨
受保护的技术使用者：上海工程技术大学
技术研发日：2022.03.25
技术公布日：2022/5/25