克林沙星或其衍生物在制备HSV抑制剂中的应用的制作方法

克林沙星或其衍生物在制备hsv抑制剂中的应用
技术领域
1.本发明属于医药技术领域，尤其涉及克林沙星或其衍生物在制备hsv抑制剂中的应用。


背景技术：

2.单纯疱疹病毒i型(hsv-1)是引起黏膜感染的主要病原之一，hsv-1角膜炎可以导致患者视力受损或失明。在免疫缺陷病人、接受移植者，以及新生儿患者中，这种hsv-1感染往往具有致残或致死性。该病毒经过初次感染后容易潜伏于神经元，在不确定因素的刺激性下，至少会有30％的病毒潜伏病例病毒会激活。第一个被用于角膜疱疹病毒感染治疗的药物是核苷类似物碘苷(idoxuridine，又名疱疹净)和三氟尿苷(trifluridine)，后来因为安全性而被停用。在20世纪70年代末，阿糖腺苷(vidarabine)被用来系统性治疗致死性疱疹脑炎和带状疱疹。核苷类似物阿昔洛韦(acyclovir，acv)以其优异的安全性在抗病毒治疗领域有着里程碑式的意义，并从20世纪80年代开始成为了单纯疱疹病毒和带状疱疹病毒感染治疗的金标准。20世纪90年代引入的阿昔洛韦的前体药物伐昔洛韦(valacyclovir，vacv)、泛昔洛韦(famciclovir,fcv)以及阿昔洛韦同种类的喷昔洛韦(penciclovir，pcv)提高了药物的口服利用度及药物系统性暴露，且长效性使给药更方便。但这些药物对潜伏感染的病毒无效，也不能阻止潜伏感染的复发。21世纪初，螺旋酶-引发酶抑制剂开始进入临床试验。然而直到现在，没有一款该类药物获批准治疗hsv感染。
3.克林沙星(clinafloxacin)是第四代喹诺酮类(quinolones)广谱抗生素。喹诺酮类抗生素以细菌的基因组dna合成为靶，抑制dna螺旋酶，造成细菌染色体的不可逆性损伤，从而使细菌停止分裂。克林沙星对革兰氏阴性菌有较强的抑制作用，同时对大部分厌氧菌，革兰氏阳性菌的金黄色葡萄球菌也有较强的抑制作用。


技术实现要素：

4.本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的第一个方面，提出克林沙星或其衍生物在制备hsv(单纯疱疹病毒)抑制剂中的应用，克林沙星及其衍生物对hsv具有优异的抑制效果。
5.根据本发明的第一个方面，提出了克林沙星或其衍生物在制备hsv抑制剂中的应用。
6.根据本发明的第二个方面，提出了克林沙星或其衍生物在制备hsv的dna复制抑制剂中的应用。
7.在本发明的一些实施方式中，所述hsv包括hsv-1型、hsv-2型的至少一种。
8.在本发明的一些优选的实施方式中，所述衍生物为其药学上可接受的盐、酯、水合物、溶剂化物、结晶形式、对映异构体、立体异构体、醚、代谢物或前药。
9.在本发明的一些更优选的实施方式中，所述药学上可接受的盐包括但不仅限于无机酸盐、有机酸盐、烷基磺酸盐或芳基磺酸盐中的至少一种；优选地，所述无机酸盐包括但
591为覆盖层培养基，在经过固定、染色等步骤得到空斑后进行空斑计数，具体过程为：
25.s1：将猴肾vero细胞以5
×
105/孔接种于平底96孔板中，以完全培养基：dmem 10％胎牛血清 1％双抗培养；
26.s2：当孔底细胞刚长成单层时，将病毒液(实施例1冻存的细胞上清液)用dmem梯度稀释，然后每孔60μl接种于孔中，5％co2、37℃条件孵育，让病毒吸附1h；
27.s3：病毒吸附完成后，直接添向孔中加含1.2％rc-591的覆盖培养基，5％co2、37℃条件培养96h；
28.s4：将96孔板从培养箱拿出，直接往每孔中加入160μl8％中性甲醛溶液(甲醛溶于pbs，ph7.0)室温固定1h；
29.s5：将96孔板用自来水轻轻洗涤2～3遍，将肉眼可见的孔内固体颗粒彻底洗脱；
30.s6：加入0.3％中性红溶液(中性红粉末溶于去离子水)染色30min。将孔中的中性红染料弃去，用自来水将96孔板洗1～2遍，将残留水分用吸水纸彻底吸干；
31.s7：计数每孔中的空斑数。
32.每个样品做3个生物学重复，并将结果进行统计分析。结果如图1所示。
33.从图1可看出，盐酸克林沙星在10μm浓度即对病毒滴度有明显抑制作用，抑制率达到了约66.7％。
34.实施例3
35.本实施例采用添加不同浓度盐酸克林沙星后荧光定量pcr测病毒dna相对量，具体过程为：
36.s1：用病毒dna提取试剂盒按操作说明提取实施例1中细胞冻存液200μl每份上清液样品中的dna，作为荧光定量pcr的模板；
37.s2：取2μl dna模板，安装荧光定量pcr试剂盒的操作说明加入反应体系。以pl 5
’‑
atcaacttcgactggcccttc-3’(seq id no:1)和pr,5
’‑
ccgtacatgtcgatgttcacc-3’(seq id no:2)作为上下游引物，sybr green为荧光染料；
38.s3：将反应板放进荧光定量pcr仪，设置程序：95℃预变性3min，95℃20s变性、55℃20s退火、72℃30s延伸共40个循环；
39.s4：读取每个样品的ct值。
40.每个样品做3个生物学重复，结果如图2所示。
41.从图2可看出，盐酸克林沙星在5μm浓度下能显著抑制病毒dna的相对拷贝数，抑制率达到约73.8％。
42.实施例4
43.本实施例对药物进行病毒耐药株抑制试验，具体过程为：
44.将实施例1、实施例3中的毒株换成阿昔洛韦耐药株，其他实验步骤不变。每个样品做3个生物学重复，结果如图3所示。
45.从图3可看出，盐酸克林沙星在5μm浓度下能显著抑制hsv-1耐阿昔洛韦病毒株病毒dna的相对拷贝数，抑制率达到约77.2％。
46.实施例5
47.本实施例对药物进行细胞毒性试验，具体过程为：
48.s1：在96孔板中加入100μl的sk-n-sh细胞悬液，每孔中细胞数量2.5
×
104个。将培
养板放在培养箱中培养24小时(37℃，5％co2)；
49.s2：向培养板每孔加入100μl含有不同浓度(50μm、100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm)盐酸克林沙星的完全培养基(dmem 10％胎牛血清 1％双抗)；对照组采用100μl含dmso的完全培养基(dmem 10％胎牛血清 1％双抗)进行培养；
50.s3：将培养板在培养箱(37℃，5％co2)孵育48h；
51.s4：吸弃每孔中的培养基，再向每孔加入100μl含有10μlcck8溶液的上述新鲜完全培养基；
52.s5：将培养板在培养箱(37℃，5％co2)内孵育1.5h；
53.s6：用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
54.每个浓度梯度做6个生物学重复，并做统计分析，结果如图4所示。
55.从图4可看出，盐酸克林沙星抗hsv-1感染sk-n-sh的ic
50
为3.9μm，在小于150μm浓度下，盐酸克林沙星对sk-n-sh细胞存活率影响较小，cc
50
等于200μm，则故选择指数si等于51.3。
56.上面对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

技术特征：
1.克林沙星或其衍生物在制备hsv抑制剂中的应用。2.克林沙星或其衍生物在制备hsv的dna复制抑制剂中的应用。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述hsv包括hsv-1型、hsv-2型的至少一种。4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述衍生物为其药学上可接受的盐、酯、水合物、溶剂化物、结晶形式、对映异构体、立体异构体、醚、代谢物或前药。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述药学上可接受的盐包括无机酸盐、有机酸盐、烷基磺酸盐或芳基磺酸盐中的至少一种。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述无机酸盐包括盐酸盐、氢溴酸盐、硝酸盐、硫酸盐或磷酸盐中的至少一种。7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述有机酸盐包括甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐、苯甲酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐或柠檬酸盐中的至少一种。8.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述克林沙星或其衍生物的治疗有效量为2μm～200μm。9.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述克林沙星或其衍生物的治疗有效量为5μm～100μm。10.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述克林沙星或其衍生物的治疗有效量为10μm～50μm。

技术总结
本发明提供克林沙星或其衍生物在制备HSV抑制剂中的应用，盐酸克林沙星在10μM浓度即对HSV-1感染SK-N-SH细胞有明显抑制作用，CC


技术研发人员：尹应先 徐翼 欧志英 苏玲 李嘉慧 杨峰霞
受保护的技术使用者：广州市妇女儿童医疗中心
技术研发日：2022.03.25
技术公布日：2022/5/25