基于生乳的冷冻干燥羊乳清粉真实性检测方法

1.本发明属于食品安全检测技术领域，具体涉及一种从生乳中提取分离的羊乳清粉的真实性检测方法。


背景技术：

2.牛乳清粉保留了牛乳中约55％的营养成分，近年来成为了一种流行的膳食蛋白质补充剂，它可以调节蛋白质比例以减轻婴幼儿肾脏的负担，其次，一些过敏成分可以通过酶水解减少到最低限度。因此，牛乳清粉常被添加在婴幼儿配方奶粉和医疗营养配方奶粉中，占40％～50％，已经成为婴幼儿配方奶粉中的主要成分之一。羊乳清粉的价格虽然相对低于羊奶粉，然而由于奶山羊养殖规模小、产量低，羊乳清粉的价格远高于牛乳清粉，其次牛乳清粉的价格比牛奶便宜90％。在利益的驱使下，这使得牛乳清粉成为纯山羊奶制品中掺假的主要目标。这不但会给羊奶粉行业带来不公平竞争，欺骗广大消费者，甚至对于牛乳过敏的人群来说，如果食用了掺有牛乳清粉的纯山羊奶制品，可能存在健康风险。因此，尽快研究出准确检测牛乳清粉成分含量，准确评定羊乳粉纯正性的方法，成为消费者、羊乳制品生产企业和食品安全监管部门的迫切需要。
3.目前关于牛乳清粉检测的方法包括光谱技术、质谱和免疫学方法，从原理来看，它们是通过判别维生素、脂肪和蛋白质之间的差异，从而达到鉴别牛乳清粉的目的，但这些方法却各有不足，光谱技术检测成本高且仪器操作复杂，质谱在结构分析中存在一定的难度，免疫学技术中的单克隆抗体制备的难度相对较大。其次，乳清粉在生产加工过程中由于受到热处理，这些成分不仅会发生变化，而且也会降低检测灵敏度。
4.基于dna分子生物学的pcr技术由于具有极高的灵敏度、稳定性和可重复性，在掺假检测中已经成为主流的检测技术。然而，目前国内外在牛乳清粉的定性定量检测研究方面鲜有涉及。


技术实现要素：

5.针对现有技术中鉴别牛乳清粉的缺陷和不足，本发明的目的在于提供一种基于生乳的冷冻干燥羊乳清粉真实性检测方法，可适用于热处理后的牛乳清粉鉴别。
6.为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案由以下步骤组成：
7.1.将新鲜牛乳和羊乳在0～4℃下以5000～8000r/min离心20～30min，去除上层脂肪保留下层脱脂乳，在75～90℃下进行热灭菌15～16s，然后将所得脱脂牛奶和羊奶的ph值分别调节至4.6和4.1以去除酪蛋白，经室温静置1h后，在3000～5000r/min下离心15～20min收集上清液，将上清液通过0.45μm过滤器过滤脂肪球，并通过5000da超滤膜去除乳糖，所得乳清浸入62～65℃水浴中灭菌30min，最后通过真空冷冻干燥分别得到牛乳清粉和羊乳清粉。
8.2.将步骤1得到的牛乳清粉和羊乳清粉混合，配制不同牛乳清粉质量百分含量的标准样品；提取标准样品的dna，并用te缓冲溶液将提取的标准样品dna浓度标准化为50～
100ng/μl。
9.3.以步骤2标准化的标准样品dna为模板，利用牛线粒体dna的bos-cytb基因的特异性引物进行荧光定量pcr扩增，并获得不同牛乳清粉质量百分含量对应的ct值，建立定量标准曲线，得到ct值与牛乳清粉质量百分含量的对数值间的关系式。其中所述牛线粒体dna的bos-cytb基因的特异性引物的序列如下：
10.上游引物：5’—gccatatactctccttggtgaca—3’；
11.下游引物：5’—gtaggcttgggaatagtacga—3’。
12.4.提取待检测样品的dna，并用te缓冲溶液将提取的待检测样品dna浓度标准化为与标准样品dna相同的浓度；然后将标准化的待检测样品dna采用步骤3所述牛线粒体dna的bos-cytb基因的特异性引物进行普通pcr扩增，获得的电泳图对待测样品进行初步定性；若未检测出牛乳清粉，结束操作；若检测出有牛乳清粉，则按照步骤3的方法进行荧光定量pcr扩增，得到待测样品对应的ct值，代入步骤3的关系式中，即得到待测样品中牛乳清粉含量。
13.上述步骤1中，采用食品级naoh和hcl将所得脱脂牛奶和羊奶的ph值分别调节至4.6和4.1。
14.上述步骤2中，优选按照牛乳清粉质量百分含量为0.1％、0.5％、1％、5％、10％和30％，将步骤1得到的牛乳清粉和羊乳清粉混合，配制标准样品。
15.上述步骤3中，优选所述荧光定量pcr扩增的条件为：95℃预变性10min；95℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环。
16.上述步骤4中，优选所述普通pcr扩增的条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃总延伸10min。
17.与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
18.1.本发明在从生牛、羊乳中提取分离并冷冻干燥获得的牛、羊乳清粉基础上建立的羊乳清粉中牛乳清粉的掺假鉴定，具有低成本、高灵敏度、稳定性高和可重复性的特点。
19.2.本发明可操作性强，检测过程相对较快。
20.3.本发明所检测的目标物质与蛋白质无关，即使乳清粉经过热处理加工后，仍然能够实现定量检测。
21.4.本发明有利于打击市场中纯羊奶制品中牛乳清粉的掺假的行为，为食品监管部门提供有力的理论武器，保障消费者经济及健康安全。
附图说明
22.图1是标准样品荧光定量pcr标准曲线示意图。
23.图2是待测样品的电泳图。其中，m为dna marker，泳道1代表牛乳清粉，泳道2代表羊乳清粉。
具体实施方式
24.以下结合具体实验和实施例对本发明作更详细的描述，但是本发明不仅限于下述的实施情形。
25.1、新鲜牛乳、羊乳采集于陕西省西安市某养殖户的奶牛与山羊，牛乳、羊乳样品分别被采集装入50ml的离心管中，在-20℃下保存。分别将200ml生鲜牛乳和羊乳在4℃下以
5000r/min离心30min，去除上层脂肪保留下层脱脂乳，在72℃下进行热灭菌15s，获得脱脂牛奶和羊奶。分别取100ml脱脂牛奶和羊奶用食品级naoh和hcl将ph值分别调节至4.6和4.1以去除酪蛋白，经室温静置1h后，在3000r/min下离心15min收集上清液。将上清液通过0.45μm过滤器过滤脂肪球，并通过5000da超滤膜去除乳糖，将所得乳清浸入63℃水浴中灭菌30min，最后通过真空冷冻干燥分别得到牛乳清粉和羊乳清粉。
26.2、按照牛羊乳清粉的质量百分含量分别为0.1％、0.5％、1％、5％、10％和30％，将步骤1得到的牛乳清粉和羊乳清粉混合后作为6个标准样品，并分别提取6个标准样品dna，并用te缓冲溶液将提取的标准样品dna浓度标准化为50ng/μl。所述标准样品dna的提取方法为：称取1g标准样品加入9ml蒸馏水溶解，在5000r/min下离心10min，弃去上层清液，加入600μl pbs缓冲液充分混合，在12000r/min下离心10min，弃去上层清液，保留底部沉淀。向所得沉淀物中加入350μl dna提取缓冲液(nacl 1mol/l、tris-hcl 0.5mol/l、edta-na 0.5mol/l、ph调至8.0)、50μl sds溶液(将20g十二烷基硫酸钠(sds)加入80ml双蒸水中，于68℃加热溶解后，ph调至7.2，用双蒸水定容至100ml)和20μl蛋白酶k，混匀后置于56℃水浴4h。水浴结束后，加入500μl dna提取酚试剂充分混匀，在4℃下12000r/min离心10min，取上清液加入等体积dna提取酚与氯仿、异戊醇体积比为25:24:1的混合液萃取一次，在4℃下12000r/min离心10min，再取上清液加入等体积氯仿与异戊醇体积比为24:1的混合液萃取两次，在4℃下12000r/min离心10min，然后取上清液加入2倍体积无水乙醇，在4℃下12000r/min离心10min，于-20℃冰箱中放置30min后倾去上层液，加入体积浓度为75％的乙醇水溶液沉淀dna，在4℃下12000r/min离心5min后小心吸去上层乙醇水溶液，最后加入25μl te缓冲溶液溶解dna。
27.3.以步骤2标准化的标准样品dna为模板，利用步骤3所述的牛线粒体dna的bos-cytb基因的特异性引物进行荧光定量pcr扩增，所述牛线粒体dna的bos-cytb基因的特异性引物的序列如下：
28.上游引物：5’—gccatatactctccttggtgaca—3’29.下游引物：5’—gtaggcttgggaatagtacga—3’30.所述荧光定量pcr扩增的条件为：95℃预变性10min；95℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环。获得不同牛乳清粉质量百分含量对应的ct值，建立定量标准曲线，得到ct值与牛乳清粉质量百分含量的对数值间的关系式。如图1所示，牛乳清粉质量百分含量在0.1％至30％范围内的关系式为y＝-3.2681x 27.547，线性相关系数为r2＝0.9858，可用该标准曲线进行定量检测。
31.4、取待检测样品，按照步骤2的方法提取待测样品的dna并用te缓冲溶液将提取的待检测样品dna浓度标准化为50ng/μl；然后将标准化的待测样品dna进行普通pcr扩增，普通pcr扩增的条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃总延伸10min。根据普通pcr扩增获得的电泳图对待测样品进行初步定性，若未检测出牛乳清粉，结束操作。如图2所示，若待测样品中含有牛乳清粉，则电泳结果出现目标条带，再按照步骤3的方法进行荧光定量pcr扩增，得到待测样品对应的ct值，代入步骤3的关系式中，即得到待测样品中牛乳清粉含量。

技术特征：
1.一种基于生乳的冷冻干燥羊乳清粉真实性检测方法，其特征在于它由以下步骤组成：(1)将新鲜牛乳和羊乳在0～4℃下以5000～8000r/min离心20～30min，去除上层脂肪保留下层脱脂乳，在75～90℃下进行热灭菌15～16s，然后将所得脱脂牛奶和羊奶的ph值分别调节至4.6和4.1以去除酪蛋白，经室温静置1h后，在3000～5000r/min下离心15～20min收集上清液，将上清液通过0.45μm过滤器过滤脂肪球，并通过5000da超滤膜去除乳糖，所得乳清浸入62～65℃水浴中灭菌30min，最后通过真空冷冻干燥分别得到牛乳清粉和羊乳清粉；(2)将步骤(1)得到的牛乳清粉和羊乳清粉混合，配制不同牛乳清粉质量百分含量的标准样品；提取标准样品的dna，并用te缓冲溶液将提取的标准样品dna浓度标准化为50～100ng/μl；(3)以步骤(2)标准化的标准样品dna为模板，利用牛线粒体dna的bos-cytb基因的特异性引物进行荧光定量pcr扩增，并获得不同牛乳清粉质量百分含量对应的ct值，建立定量标准曲线，得到ct值与牛乳清粉质量百分含量的对数值间的关系式；上述牛线粒体dna的bos-cytb基因的特异性引物的序列如下：上游引物：5’—gccatatactctccttggtgaca—3’下游引物：5’—gtaggcttgggaatagtacga—3’(4)提取待检测样品的dna，并用te缓冲溶液将提取的待检测样品dna浓度标准化为与标准样品dna相同的浓度；然后将标准化的待检测样品dna采用步骤(3)所述牛线粒体dna的bos-cytb基因的特异性引物进行普通pcr扩增，获得的电泳图对待测样品进行初步定性；若未检测出牛乳清粉，结束操作；若检测出有牛乳清粉，则按照步骤(3)的方法进行荧光定量pcr扩增，得到待测样品对应的ct值，代入步骤(3)的关系式中，即得到待测样品中牛乳清粉含量。2.根据权利要求1所述的基于生乳的冷冻干燥羊乳清粉真实性检测方法，其特征在于：步骤(1)中，用食品级naoh和hcl将所得脱脂牛奶和羊奶的ph值分别调节至4.6和4.1。3.根据权利要求1所述的基于生乳的冷冻干燥羊乳清粉真实性检测方法，其特征在于：步骤(2)中，按照牛乳清粉质量百分含量为0.1％、0.5％、1％、5％、10％和30％，将步骤(1)得到的牛乳清粉和羊乳清粉混合，配制标准样品。4.根据权利要求1所述的基于生乳的冷冻干燥羊乳清粉真实性检测方法，其特征在于：步骤(3)中，所述荧光定量pcr扩增的条件为：95℃预变性10min；95℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环。5.根据权利要求1所述的基于生乳的冷冻干燥羊乳清粉真实性检测方法，其特征在于：步骤(4)中，所述普通pcr扩增的条件为：95℃预变性10min；95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；72℃总延伸10min。

技术总结
本发明公开了一种基于生乳的冷冻干燥羊乳清粉真实性检测方法，该方法首先从牛、羊乳中分别提取分离并冷冻干燥获取牛、羊乳清粉，然后对两者按比例混合后的标准样品分别提取DNA，再利用实时荧光定量PCR技术对含有牛乳清粉的标准样品扩增牛基因组DNA，建立定量标准曲线，得到Ct值与牛乳清粉质量百分含量的对数值间的关系式；接着对待测样品提取DNA后利用普通PCR进行初步定性，然后利用实时荧光定量PCR技术扩增牛基因组DNA获得的Ct值代入标准曲线的关系式中可确定牛乳清粉的含量。本发明为羊乳清粉掺入牛乳清粉成分的检测提供了一种方法，对于羊乳制品的安全品质检测具有重要的意义。的意义。的意义。


技术研发人员：刘永峰 张雪茹 郝果 乔春艳
受保护的技术使用者：陕西师范大学
技术研发日：2022.03.23
技术公布日：2022/5/25