低共熔溶剂应用于DNA提取、DNA提取方法及试剂盒与流程

低共熔溶剂应用于dna提取、dna提取方法及试剂盒
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及低共熔溶剂应用于dna提取、dna提取方法及试剂盒。


背景技术：

2.脱氧核糖核酸(dna)是一种重要的生物分子，包含几乎所有生物体生命所需的遗传物质，是遗传信息的载体，在生命科学领域具有重要的应用价值。从复杂的生物样品中提取dna是生物学中的一个基本过程，也是启动其他下游活动的基本步骤，如测序、扩增、杂交、连接、克隆和生物检测。从全血中提取dna是获得生物基因组遗传信息较为简单的方法，也是进行基因相关性研究的重要手段和技术。然而，从含有蛋白质、多糖及各种代谢物的复杂生物样品中提取高质量的dna是具有很大挑战性，而且提取dna样本的质量和提取量直接影响着后续实验的准确性。
3.目前，用有机溶剂提取dna的传统方法会产生一系列问题，这些问题主要体现在一次提取获得dna的样本量较少且萃取试剂毒性大。因此，寻找更安全、更高效的dna提取纯化方法尤为重要。


技术实现要素：

4.针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了低共熔试剂应用于dna提取、dna提取方法及试剂盒，其目的在于发现低共熔溶剂对全血中dna的特异性富集作用，应用于提取血液中dna，由此解决现有提取方法一次性提取dna量少且提取试剂毒性大的技术问题。
5.为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种低共熔溶剂在提取dna中的应用，其所述低共熔溶剂为氯化胆碱体系低共熔溶剂，用作dna萃取剂。
6.优选地，所述低共熔溶剂在提取dna中的应用，其所述氯化胆碱体系低共熔溶剂为氯化胆碱与氢键供体试剂的摩尔比为1:1～5的低共熔溶剂。
7.优选地，所述低共熔溶剂在提取dna中的应用，其所述氢键供体试剂为六氟异丙醇。
8.按照本发明的另一方面，提供了一种低共熔溶剂提取dna的方法，其包括以下步骤：
9.取获得的含待提取dna的细胞裂解液上清液，加入蛋白质变性剂混匀，使蛋白质充分变性沉淀，离心分层；取上清液，加入te缓冲液、硫酸盐、氯化胆碱体系低共熔溶剂形成双水相萃取体系；混匀，室温静置；待分层后取下层低共熔溶剂相，加水反萃取，离心分层，获取上清液；所述上清液含提取的dna。
10.优选地，所述低共熔溶剂提取dna的方法，其所述双水相萃取体系，其中硫酸盐浓度0.08～0.5g/ml；氯化胆碱体系低共熔溶剂体积占比为60～400μl/ml。
11.优选地，所述低共熔溶剂提取dna的方法，其所述硫酸盐为硫酸铵、硫酸钠、硫酸
镁、或硫酸氢钠的一种或多种组合，其中硫酸铵或硫酸氢钠，浓度为0.12～0.5g/ml；所述硫酸钠或硫酸镁，浓度为0.08～0.5g/ml。
12.优选地，所述低共熔溶剂提取dna的方法，其所述氯化胆碱体系低共熔溶剂，其氢键供体为六氟异丙醇，两者摩尔比为1:1～5。
13.优选地，所述低共熔溶剂提取dna的方法，其所述加水混匀为按照体积比1:1～4加水混匀。
14.优选地，所述低共熔溶剂提取dna的方法，其所述氯化胆碱体系低共熔溶剂，按照以下制备方法获得：
15.将所述氯化胆碱和氢键供体，按摩尔比1:1～10混合后置于封闭的耐压管中，将耐压管置于磁力加热搅拌器中，加热搅拌直至形成透明的液体，即为低共熔溶剂；所述加热搅拌，其条件为60～100℃金属浴或油浴，搅拌速度为150～1000rpm，加热时间为1～12h。
16.按照本发明的另一方面，还提供了一种dna提取试剂盒，其所述dna提取试剂盒，包括本发明所述的氯化胆碱体系低共熔溶剂。
17.总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，由于采用氯化胆碱体系低共熔溶剂萃取dna，能够取得下列有益效果：
18.低共熔溶剂是一种绿色化学试剂，常用于有机物的分离，而氯化胆碱体系低共熔溶剂对dna具有特异性富集作用，其对dna的萃取率可达80％及以上，可应用于dna提取，尤其是氯化胆碱与氢键供体摩尔比为1:1～5，特别是氢键供体为六氟异丙醇，这种低共熔溶剂对血液中dna提取回收率可达95％及以上，可用于制备dna提取试剂盒。
19.另外，本发明提供的低共熔溶剂提取dna的方法，其采用无毒的氯化胆碱体系低共熔溶剂作为萃取剂，而且其提取的dna浓度在50μg/ml以上，且一次提取dna的样本量，可满足多次实验或大量扩增的需求，可见，本方法更安全、更高效。
附图说明
20.图1为实施例1中pcr扩增结果；
21.图2为实施例2中pcr扩增结果；
22.图3为实施例3中pcr扩增结果；
23.图4为实施例4中pcr扩增结果；
24.图5为低共熔溶剂对dna、bsa、rna的萃取率。
具体实施方式
25.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
26.现有全血dna提取方法，200μl全血样本经提取、洗脱后样品体积在50～80μl，且传统的dna提取方法通常采用有机溶剂如氯仿，由于有机溶剂的毒性，导致现有提取方法存在安全隐患，随着人们对绿色化学的重视，寻找一种更安全有效的dna提取试剂意义重大。
27.而实验表明dna在氯化胆碱类低共熔溶剂中，具有恰当的分配比，而血液中其他成
分在这些低共熔溶剂中的分配比较低，由实验结果可知，rna萃取率低于20％，蛋白质萃取率低于50％，dan萃取率可达80％及以上；可见，在这类低共熔溶剂中dna与血液中其他成分的分配比明显不同，其对dna具有特异性富集效果，可用于提取血液中的dna。
28.尤其是采用氯化胆碱与氢键供体试剂的摩尔比为1:1～5的低共熔溶剂，氢键供体含量过高，低共熔溶剂有一定挥发性，不利于分离提取，氯化胆碱与氢键供体比例适当，一是分离提取效果好，二是成本较低；其中氢键供体，优选六氟异丙醇，这种氯化胆碱体系低共熔溶剂对dna的富集效果更佳。
29.单纯的低共熔溶剂形成稳定均一相，在适当的离子种类和浓度条件下形成双水相体系，即两相体系。而在采用所述氯化胆碱体系低共熔溶剂提取dna的实验中显示，与磷酸盐和碳酸盐相比，硫酸盐对低共熔溶剂提取dna的效果有着较大影响，其中硫酸盐，包括硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、或硫酸氢钠的一种或多种组合；进一步实验显示，优选氯化胆碱体系低共熔溶剂体积占比为60～400μl/ml，硫酸盐的质量浓度为0.08～0.5g/ml，过低的离子浓度条件下，低共熔溶剂难以形成两相；尤其需要注意的是，过高的例子浓度条件下，下相体积更大且含水量高，dna的萃取率降低，不利于dna的提取。
30.而不同硫酸盐适宜浓度存在差异，其中硫酸铵或硫酸氢钠，优选浓度为0.12～0.5g/ml；硫酸钠或硫酸镁，优选浓度为0.08～0.5g/ml；采用这种提取方法对dna提取的回收率可以达到95％以上，可实现高纯度、高效率、强富集且安全环保的提取dna。
31.本方法提取的dna，其浓度在50μg/ml以上；实验还显示，200μl全血样本最终洗脱得到350至2000μl的浓度均可直接用于后续的pcr反应；而且还可以采用洗脱的方法回收全血dna用于下游分析，也能够取得很好的效果。可见，本发明提供的低共熔溶剂提取dna的方法，其一次提取dna的样本量，可满足多次实验或大量扩增的需求，且提取的dna纯度高。
32.本发明提供了一种低共熔溶剂在提取dna中的应用，所述低共熔溶剂为氯化胆碱体系低共熔溶剂，优选氯化胆碱与氢键供体摩尔比为1:1～5，所述氢键供体，包括六氟异丙醇。
33.另外，本发明还提供了一种低共熔溶剂提取dna的方法，包括以下步骤：
34.(1)细胞裂解：取全血样品，采用表面活性剂处理充分裂解，并采用蛋白酶处理充分释放dna，获得全血裂解样本；
35.(2)除杂：将全血裂解样本在ph缓冲液保护下，加入足量醇类使蛋白质变性沉淀，取含有dna的上清液；核酸分子在5＜ph＜9的溶液中稳定性较好，优选ph值在7～9之间的te缓冲液，在弱碱性环境下除杂对dna的碱基有保护作用，利于保护dna分子的完整性。
36.(3)dna萃取：取(2)中含有dna的上清液，加入te缓冲液、硫酸盐、氯化胆碱体系低共熔溶剂，形成双水相萃取体系，并使得双水相萃取体系中氯化胆碱体系低共熔溶剂体积占比为60～400μl/ml，硫酸盐质量浓度为0.08～0.5g/ml；静置分层；取下层低共熔溶剂相，加水混匀，恒温静置，反萃取，离心分层，获取上清液，所述上清液含提取的dna。
37.所述硫酸盐，包括硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、或硫酸氢钠的一种或多种组合，其中所述硫酸铵或硫酸氢钠，优选浓度为0.12～0.5g/ml；所述硫酸钠或硫酸镁，优选浓度为0.08～0.5g/ml；
38.所述氯化胆碱体系低共熔溶剂，优选氯化胆碱与六氟异丙醇的摩尔比为1:1～5；
39.所述加入te缓冲液，优选按照体积比1:1～6加入te缓冲液；
40.所述加水混匀，优选按照下层低共熔溶剂相与水体积比1:1～4加水混匀。
41.所述氯化胆碱体系低共熔溶剂，按照以下制备方法获得：
42.氯化胆碱和氢键供体，按摩尔比1:1～10混合后置于封闭的耐压管中，将耐压管置于磁力加热搅拌器中，加热搅拌直至形成透明的液体，即为低共熔溶剂；所述加热搅拌，其条件为60～100℃金属浴或油浴，搅拌速度为150～1000rpm，加热时间为1～12h。
43.另外，本发明还提供了一种dna提取试剂盒，所述dna提取试剂盒，包括本发明所述的氯化胆碱体系低共熔溶剂。
44.以下为实施例：
45.实施例1提取全血样本中dna，具体步骤如下：
46.(1)细胞裂解：取200μl全血加入20μl tritonx～100和20μl 100mg/ml蛋白酶k，70℃放置10min；
47.(2)除蛋白质等杂质：在处理好的全血样本中加入0.76ml te缓冲液(ph 8.0，10mm tris～hcl，1mm edta)，12000rpm离心2min离心分层；取离心后900μl上清液，加入900μl甲醇，混合均匀，12000rpm离心2min离心分层；
48.(3)萃取dna：取离心后1ml上清液，加入4ml te缓冲液(ph 8.0，10mm tris～hcl，1mm edta)，加入1.4g硫酸铵，加入0.7ml低共熔溶剂(氯化胆碱：六氟异丙醇＝1:2.5，mol/mol)混匀，静置2min；取下层200μl加入400μl水反萃取，90℃放置5min，12000rpm离心1min，取上清液，此上清液含提取的dna，可作为dna模板进行pcr，下同。
49.实施例2提取全血样本中dna，具体步骤如下：
50.(1)细胞裂解：取200μl全血加入20μl tritonx～100和20μl 100mg/ml蛋白酶k，70℃放置10min；
51.(2)除蛋白质等杂质：在处理好的全血样本中加入0.76ml te缓冲液(ph 8.0，10mm tris～hcl，1mm edta)，12000rpm离心2min离心分层；取离心后900μl上清液，加入900μl甲醇，混合均匀，12000rpm离心2min离心分层；
52.(3)萃取dna：取离心后1ml上清液，加入4ml te缓冲液(ph 8.0，10mm tris～hcl，1mm edta)，加入0.6g硫酸钠，加入0.7ml低共熔溶剂(氯化胆碱：六氟异丙醇＝1:2.5，mol/mol)混匀，静置2min；取下层200μl加入400μl水反萃取，90℃放置5min，12000rpm离心1min，取上清液，此上清液含提取的dna。
53.实施例3提取全血样本中dna，具体步骤如下：
54.(1)细胞裂解：取200μl全血加入20μl tritonx～100和20μl 100mg/ml蛋白酶k，56℃放置10min；
55.(2)除蛋白质等杂质：在处理好的全血样本中加入0.76ml te缓冲液(ph 8.0，10mm tris～hcl，1mm edta)，12000rpm离心5min；取离心后900μl上清液，加入900μl甲醇，混合均匀，12000rpm离心5min；
56.(3)萃取dna：取离心后1ml上清液，加入4ml te缓冲液(ph 8.0，10mm tris～hcl，1mm edta)，加入1.2g硫酸镁，加入1.0ml低共熔溶剂(氯化胆碱：六氟异丙醇＝1:3，mol/mol)混匀，静置5min；取下层200μl加入400μl水反萃取，90℃放置5min，12000rpm离心5min，取上清液，此上清液含有提取的dna。
57.实施例4提取全血样本中dna，具体步骤如下：
58.(1)细胞裂解：取200μl全血加入20μl tritonx～100和20μl 100mg/ml蛋白酶k，56℃放置10min；
59.(2)除蛋白质等杂质：在处理好的全血样本中加入0.76ml te缓冲液(ph 8.0，10mm tris～hcl，1mm edta)，12000rpm离心5min；取离心后900μl上清液，加入900μl乙醇，混合均匀，12000rpm离心5min；
60.(3)萃取dna：取离心后1ml上清液，加入4ml te缓冲液(ph 8.0，10mm tris～hcl，1mm edta)，加入1.0g硫酸氢钠，加入1.0ml低共熔溶剂(氯化胆碱：六氟异丙醇＝1:4，mol/mol)混匀，静置5min；取下层200μl加入400μl水反萃取，90℃放置5min，12000rpm离心5min，取上清液，此上清液含提取的dna。
61.实验1检测实施例1提取的dna
62.以实施例1获取的含dna的上清液作为dna模板，进行pcr，具体如下：
63.(1)pcr引物p53序列
[0064][0065]
(2)pcr反应体系
[0066]
组分体积2
×
pcrmix12.5μlf/r各0.5μldna1μl灭菌注射用水10.5μl总体积25μl
[0067]
(3)pcr反应程序
[0068][0069]
上述pcr扩增结果如图1所示。
[0070]
实验2检测实施例2提取dna
[0071]
以实施例2获取的含dna的上清液作为dna模板进行pcr，pcr引物序列、pcr反应体系和pcr反应程序同实验1，pcr扩增结果如图2所示。
[0072]
实验3检测实施例3提取dna
[0073]
以实施例3获取的含dna的上清液作为dna模板进行pcr，具体如下：
[0074]
(1)pcr引物序列
[0075][0076]
(2)pcr反应体系同实验1；
[0077]
(3)pcr反应程序同实验1，pcr扩增结果如图3所示。
[0078]
实验4检测实施例4提取dna
[0079]
以实施例4获取的含dna的上清液作为dna模板进行pcr，具体如下：
[0080]
(1)pcr引物序列
[0081][0082]
(2)pcr反应体系同实验1；
[0083]
(3)pcr反应程序同实验1，pcr扩增结果如图4所示。
[0084]
上述实施例中，经检测其提取获得的dna浓度大于等于50μg/ml，可供多次实验或大量扩增所需。
[0085]
实验5氯化胆碱体系低共熔溶剂对dna、rna和bsa的萃取率
[0086]
实验5-1
[0087]
5ml te缓冲液(ph为dna、rna或牛血清蛋白常规适宜ph值，10mm tris～hcl，1mm edta)，加入0.6g硫酸钠，加入0.7ml低共熔溶剂(氯化胆碱：六氟异丙醇＝1:3，mol/mol)，加入10μg/ml dna或者10μg/ml rna或者0.2mg/ml牛血清白蛋白(bsa)，混匀，静置2min；取下层200μl，分别放入紫外检测器检测260nm波长处测dna和rna吸光度，280nm处测牛血清白蛋白吸光度，按照如下公式分别计算dna、rna、bsa的萃取率，结果见图5(上)。
[0088][0089]
实验5-2
[0090]
5ml te缓冲液(ph为dna、rna或牛血清蛋白常规适宜ph值，10mm tris～hcl，1mm edta)，加入1.4g硫酸铵，加入0.7ml低共熔溶剂(氯化胆碱：六氟异丙醇＝1:3，mol/mol)混匀，静置2min；取下层200μl，取下层200μl，分别放入紫外检测器检测260nm波长处测dna和rna吸光度，280nm处测牛血清白蛋白吸光度，按照如下公式分别计算dna、rna、bsa的萃取率，结果见图5(中)。
[0091][0092]
实验5-3
[0093]
5ml te缓冲液(ph为dna、rna或牛血清蛋白常规适宜ph值，10mm tris～hcl，1mm edta)，加入1.2g硫酸镁，加入1ml低共熔溶剂(氯化胆碱：六氟异丙醇＝1:3，mol/mol)混匀，静置2min；取下层200μl，分别放入紫外检测器检测260nm波长处测dna和rna吸光度，280nm处测牛血清白蛋白吸光度，按照如下公式分别计算dna、rna、bsa的萃取率，结果见图5(下)。
[0094][0095]
上述3次试验中低共熔溶剂对dna、rna和bsa的萃取率，结果如图5所示。
[0096]
由图5可知，本发明所述的氯化胆碱体系低共熔溶剂对dna、rna、bsa的萃取率，有着显著差异，其对dna具有富集作用，dna的萃取率可高达95％以上，可作为dna萃取剂，用于提取血液中的dna。
[0097]
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种低共熔溶剂在提取dna中的应用，其特征在于，所述低共熔溶剂为氯化胆碱体系低共熔溶剂，其用作dna萃取剂。2.如权利要求1所述的低共熔溶剂在提取dna中的应用，其特征在于，所述氯化胆碱体系低共熔溶剂为氯化胆碱与氢键供体试剂的摩尔比为1:1～5的低共熔溶剂。3.如权利要求2所述的低共熔溶剂在提取dna中的应用，其特征在于，所述氢键供体试剂为六氟异丙醇。4.一种低共熔溶剂提取dna的方法，其特征在于，包括以下步骤：取获得的含待提取dna的细胞裂解液上清液，加入蛋白质变性剂混匀，使蛋白质充分变性沉淀，离心分层；取上清液，加入te缓冲液、硫酸盐、氯化胆碱体系低共熔溶剂形成双水相萃取体系；混匀，室温静置；待分层后取下层低共熔溶剂相，加水反萃取，分离上清液；所述上清液含提取的dna。5.如权利要求4所述的低共熔溶剂提取dna的方法，其特征在于，所述双水相萃取体系，其中硫酸盐浓度0.08～0.5g/ml；氯化胆碱体系低共熔溶剂体积占比为60～400μl/ml。6.如权利要求4或5所述的低共熔溶剂提取dna的方法，其特征在于，所述硫酸盐为硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、或硫酸氢钠的一种或多种组合，其中硫酸铵或硫酸氢钠，浓度为0.12～0.5g/ml；所述硫酸钠或硫酸镁，浓度为0.08～0.5g/ml。7.如权利要求5所述的低共熔溶剂提取dna的方法，其特征在于，所述氯化胆碱体系低共熔溶剂，其氢键供体为六氟异丙醇，两者摩尔比为1:1～5。8.如权利要求4所述的低共熔溶剂提取dna的方法，其特征在于，所述加水混匀为按照体积比1:1～4加水混匀。9.如权利要求4所述的低共熔溶剂提取dna的方法，其特征在于，所述氯化胆碱体系低共熔溶剂，按照以下制备方法获得：将氯化胆碱和氢键供体，按摩尔比1:1～10混合后置于封闭的耐压管中，将耐压管置于磁力加热搅拌器中，加热搅拌直至形成透明的液体，即为氯化胆碱体系低共熔溶剂；所述加热搅拌，其条件为60～100℃金属浴或油浴，搅拌速度为150～1000rpm，加热时间为1～12h。10.一种dna提取试剂盒，其特征在于，所述dna提取试剂盒，包括氯化胆碱体系低共熔溶剂。

技术总结
本发明公开了一种低共熔溶剂在DNA提取中的应用，所述低共熔溶剂为氯化胆碱体系低共熔溶剂，尤其是氯化胆碱与氢键供体摩尔比为1:1～5，所述氢键供体包括六氟异丙醇；本发明还公开了一种低共熔试剂提取DNA的方法，采用所述的氯化胆碱体系低共熔溶剂提取全血中DNA，本方法对DNA提取回收率可达95％以上，且提取的DNA浓度在50μg/mL以上，本方法一次性提取获得DNA样本量大，而且高效、安全环保，能够满足大批量实验需求，另外，本发明还公开了一种DNA提取试剂盒，所述DNA提取试剂盒，包括本发明所述的氯化胆碱体系低共熔溶剂。述的氯化胆碱体系低共熔溶剂。述的氯化胆碱体系低共熔溶剂。


技术研发人员：徐佳 杨渊 肖晗
受保护的技术使用者：武汉儿童医院
技术研发日：2022.03.22
技术公布日：2022/5/25