一种裂解液及基于该裂解液的离心柱法病毒核酸提取试剂盒的制作方法

1.本发明涉及核酸提取技术领域，尤其是一种离心柱法病毒核酸提取试剂盒。


背景技术：

2.病毒是具有侵染活性的细胞内寄生物，是感染性疾病重要的病原之一，只有快速准确地实现病毒的诊断，才能有效地治疗和控制病毒的传播。分子诊断是近年来发展很快并受到广泛应用的检测技术，不仅能够快速诊断病因，还能够对病毒性疾病的治疗效果进行评价。现有的分子诊断方法中，病毒dna/rna提取是分子生物学检测的关键环节之一，病毒核酸的提取效率和质量直接影响最终检测结果的准确性。研究表明，从样本中分离高纯度且完整的病毒dna/rna对于cdna文库构建、荧光定量pcr、rt-pcr、northern杂交等下游分子生物学实验来说是至关重要的。目前常见的病毒核酸提取纯化方法有三种，分别为苯酚-氯仿抽提法、磁珠法和离心柱法。
3.苯酚氯仿法提取核酸的原理是，高浓度异硫氰酸胍使蛋白质变性，利用酚和氯仿溶液离心分层，在酸性条件下，rna会处于上层水相中，而dna和蛋白质处于中间层和有机相中，进而通过异丙醇或无水乙醇沉淀rna。此方法的缺点是使用苯酚、氯仿等有毒试剂，长期暴露于有毒环境中对操作人员的健康有较大危害且容易造成环境污染；此外，此方法回收率较低，提取的核酸损失较为严重，重复性较差，不适用于微量样本的提取。
4.磁珠法和离心柱法相对于苯酚-氯仿法采用的试剂都是无毒的，且得到的核酸纯度也相对较高，均适用于少量样本的提取。磁珠法分离核酸的原理是，经过特殊工艺制备的磁珠携带正电荷，易于与带负电荷的核酸结合，经过多次洗涤与磁场捕获，从而将核酸洗脱下来。此方法的缺点是需要特殊配制磁珠缓冲液和特异修饰后的磁珠，成本较高且操作步骤较为繁琐，在大量推广和应用普及上存在一定的限制，不适用于经费有限的实验室。离心柱法是一种较为常用的核酸提取方法，提取纯度较高，且较为安全无毒，价格也较为低廉，比较容易在各种实验室推广使用。
5.尽管离心柱法目前是一种较为常用的病毒核酸提取技术，但是目前国内外相关的离心柱法病毒核酸提取试剂盒都普遍存在核酸提取回收率低、提取核酸的完整性差、操作费时等问题。


技术实现要素：

6.针对现有技术存在的上述技术问题，本发明提供了一种裂解液及基于该裂解液的离心柱法病毒核酸提取试剂盒，使得病毒裂解更充分，提取出的病毒核酸含量更高。
7.本发明保护一种用于核酸提取的裂解液，包含1～4m异硫氰酸胍、10～40mm尿素、60～90mm tris-hcl、20～40mm edta、0.5～2％(v/v)tween 20、20～40％(v/v)peg 200，ph为4～7；优选的，包含3m异硫氰酸胍、20mm尿素、80mm tris-hcl、32mm edta、1.3％(v/v)tween 20、35％(v/v)peg 200，ph为5.5。
8.经分析，加入的peg 200与异硫氰酸胍组合作用，促使样本中病毒完全裂解；尿素
200，ph为4～7；优选的，包含3m异硫氰酸胍、20mm尿素、80mm tris-hcl、32mm edta、1.3％(v/v)tween 20、35％(v/v)peg 200，ph为5.5。
22.下面通过对比试验论证本实施例提供的裂解液对核酸提取的正向影响。
23.1、取1
×
105copies/ml假病毒(20μl)分别与4份不同来源的血浆样本(380μl)混合，作为2019-ncov假病毒血浆待测样本a1-a2，并均分两份，另一份作为对照组，利用国内q公司对照试剂盒进行核酸提取。
24.2、向样本a1中加入裂解液1，向样本a24中加入裂解液2，然后向样本a1、a2中分别加入5.6μl 1μg/μl carrier rna、20μl蛋白酶k，56℃，20min，期间颠倒混匀2次；
25.其中，裂解液1参照本实施例提供的裂解液组分和用量进行配置，裂解液2与裂解液1的区别在于，未添加peg 200，裂解液1包含3m异硫氰酸胍、20mm尿素、80mm tris-hcl、32mm edta、1.3％tween 20、35％peg 200，ph为5.5；
26.3、将步骤2得到的溶液12000rpm离心5min；
27.4、将步骤3得到的上清液转移到另一离心管中，加入400μl结合液、800μl无水乙醇(总体积占比50％)，颠倒混匀，静置3min；
28.5、将步骤4得到的溶液12000rpm，1min过柱；
29.6、向步骤5得到的溶液加入600μl洗涤液，12000rpm离心1min，重复2次；
30.7、将步骤6得到的溶液12000rpm离心2min，空干3min；
31.8、向步骤7得到的溶液加入50μl洗脱液，静置2min，然后12000rpm离心1min，得到病毒核酸。
32.荧光pcr检测所用的rt-qpcr试剂盒购买自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，测试的目的基因为n基因。rt-qpcr体系的试剂组成：2
×
buffer 10μl、enzyme mix 1μl、上游引物n-f1(10um)0.4μl、下游引物n-r1(10um)0.4μl、探针n-p(10um)0.2μl，加双蒸水补足至20μl。rt-qpcr程序：50℃逆转录15min，将rna逆转录为dna；95℃预变性30s；95℃变性30s，60℃退火延伸30s；45个循环，荧光检测通道为rox通道。
33.从图1可知，加入裂解液1组较裂解液2组扩增ct靠前，表明提取出的病毒核酸含量更高，裂解更为充分，即裂解液中peg 200和异硫氰酸胍配合使用可对病毒的裂解效果更为充分。
34.实施例2
35.本实施例提供一种离心柱法病毒核酸提取试剂盒，包含实施例1所述裂解液、结合液、漂洗液、洗脱液、蛋白酶k、carrierrna和离心柱。
36.结合液包含1～5m异硫氰酸胍、0.1％～1％(v/v)brij 58、60～90mm tris-hcl、20～40mm edta、0.5～2m nacl，ph为4～7；优选的，结合液包含4m异硫氰酸胍、0.5％(v/v)brij 58、75mm tris-hcl、32mm edta、1mnacl，ph为5.9。
37.漂洗液包含40～60mm tris-hcl、70％(v/v)无水乙醇，ph为7-9；漂洗液包含50mm tris-hcl、70％(v/v)无水乙醇，ph为7.2。
38.洗脱液包含10mm tris-hcl，ph为8.0；carrierrna浓度为1μg/μl；离心柱为硅胶膜离心柱。
39.在回收率方面均优于市售试剂盒，下面通过对比试验进行验证。
40.1、取1
×
105copies/ml假病毒(20μl)分别与5份不同来源的血浆样本(380μl)混
合，作为2019-ncov假病毒血浆待测样本b1-b5，并均分两份，另一份作为对照组，利用国内q公司对照试剂盒进行核酸提取；
41.2、向样本b1-b5样本中分别加入5.6μl 1μg/μl carrier rna、200μl裂解液、20μl蛋白酶k，56℃，20min，期间颠倒混匀2次，其中裂解液包含1m异硫氰酸胍、20mm尿素、80mm tris-hcl、40mm edta、0.5％(v/v)tween 20、20％(v/v)peg 200，ph为4；
42.3、将步骤2得到的溶液12000rp离心5min；
43.4、将步骤3得到的上清液转移到另一离心管中，加入400μl结合液、800μl无水乙醇(总体积占比50％)，颠倒混匀，静置3min；
44.5、将步骤4得到的溶液12000rpm，1min过柱；
45.6、向步骤5得到的溶液加入600μl洗涤液，12000rpm离心1min，重复2次；
46.7、将步骤6得到的溶液12000rpm离心2min，空干3min；
47.8、向步骤7得到的溶液加入50μl洗脱液，静置2min，然后12000rpm离心1min，得到病毒核酸。
48.将利用国内q公司病毒dna/rna提取试剂盒提取出对照组的病毒核酸，与本实施例步骤8得到的核酸进行实时荧光pcr检测，所用的qrt-pcr试剂及反应程序同实施例1，计算提取核酸的回收率，具体数据见表1。
49.从表1中可以看出，本实施例提供的离心柱法病毒核酸提取试剂盒对5个血浆假病毒样本回收率均高于国内q公司，均在88％以上，回收率高。
50.样本编号本实施例回收率对照试剂盒回收率b189.2％86.1％b290.1％87.3％b388.3％83.5％b489.6％83.7％b588.4％83.2％
51.表1
52.实施例3
53.随机抽取实施例1中的一份样本，以实施例1的方法对进行10次重复提取，考察实施例2提供的离心柱法病毒核酸提取试剂盒的重复性。
54.对提取后的病毒核酸进行qrt-pcr检测，qrt-pcr体系中试剂的组成及程序参见实施例1，统计得到的ct值见表2，实时荧光扩增曲线见图2。
55.样本编号ctc110.72c210.71c311.09c411.07c511.22c611.32c711.13c811.31
c911.16c1011.18
56.表2
57.从表2和图2可以看出，同一样本10个重复提取出的核酸qrt-pcr检测ct值均较小，表明提取出来的样本浓度较高，且cv值为1.9％，由此可见本发明提供的试剂盒提取病毒核酸样本重复性高、稳定性高。
58.实施例4
59.随机抽取实施例1中的一份样本，使用国内q公司的病毒dna/rna提取试剂盒进行病毒核酸提取，与使用实施例2提供的离心柱法病毒核酸提取试剂盒提取的核酸样本进行qrt-pcr检测，qrt-pcr体系各试剂组成及程序参见实施例1，ct值统计见表3，扩增曲线见图3。
60.样本ct实施例210.69国内q公司病毒dna/rna提取试剂盒12.86
61.表3
62.从表3和图3可以看出，针对同一份样本进行提取，本发明提供的试剂盒提取出的核酸浓度显著高于市场中同类产品的提取效果。
63.显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域及相关领域的普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应属于本发明保护的范围。

技术特征：
1.一种用于核酸提取的裂解液，其特征在于，包含1～4m异硫氰酸胍、10～40mm尿素、60～90mm tris-hcl、20～40mm edta、0.5～2％(v/v)tween 20、20～40％(v/v)peg 200，ph为4～7。2.根据权利要求1所述的用于核酸提取的裂解液，其特征在于，包含3m异硫氰酸胍、20mm尿素、80mm tris-hcl、32mm edta、1.3％(v/v)tween20、35％(v/v)peg 200，ph为5.5。3.一种离心柱法病毒核酸提取试剂盒，包含裂解液、结合液、漂洗液、洗脱液、蛋白酶k、carrier rna和离心柱，其特征在于，裂解液采用权利要求1或2所述的裂解液。4.根据权利要求3所述的离心柱法病毒核酸提取试剂盒，其特征在于，结合液包含1～5m异硫氰酸胍、0.1％～1％(v/v)brij 58、60～90mm tris-hcl、20～40mm edta、0.5～2mnacl，ph为4～7。5.根据权利要求4所述的离心柱法病毒核酸提取试剂盒，其特征在于，结合液包含4m异硫氰酸胍、0.5％(v/v)brij 58、75mm tris-hcl、32mm edta、1m nacl，ph为5.9。6.根据权利要求3所述的离心柱法病毒核酸提取试剂盒，其特征在于，漂洗液包含40～60mm tris-hcl、70％(v/v)无水乙醇，ph为7-9。7.根据权利要求6所述的离心柱法病毒核酸提取试剂盒，其特征在于，漂洗液包含50mm tris-hcl、70％(v/v)无水乙醇，ph为7.2。8.根据权利要求3所述的离心柱法病毒核酸提取试剂盒，其特征在于，洗脱液包含10mm tris-hcl，ph为8.0。9.根据权利要求3所述的离心柱法病毒核酸提取试剂盒，其特征在于，carrier rna浓度为1μg/μl。10.根据权利要求3所述的离心柱法病毒核酸提取试剂盒，其特征在于，离心柱为硅胶膜离心柱。

技术总结
本发明公开了一种裂解液及基于该裂解液的离心柱法病毒核酸提取试剂盒，裂解液包含1～4M异硫氰酸胍、10～40mM尿素、60～90mMTris-HCl、20～40mMEDTA、0.5～2％(V/V)Tween20、20～40％(V/V)PEG200，PH为4～7；基于该裂解液的离心柱法病毒核酸提取试剂盒，包含上述裂解液、结合液、漂洗液、洗脱液、蛋白酶K、carrierRNA和离心柱。本发明对试剂盒中裂解液、结合液、漂洗液、洗脱液、无水乙醇、蛋白酶K、carrierRNA的试剂成分及其用量进行优化，极大地提高了病毒核酸提取的回收率及纯度。地提高了病毒核酸提取的回收率及纯度。地提高了病毒核酸提取的回收率及纯度。


技术研发人员：王美玲 夏梦凡 卢德景 周艳雷 杨芳梅 修朝阳 高强 郑宝富
受保护的技术使用者：合肥欧创基因生物科技有限公司
技术研发日：2022.03.22
技术公布日：2022/5/25