红景天苷在制备抗犬细小病毒制剂或药物中的应用的制作方法

1.本发明属于药物化学领域，尤其涉及一种红景天苷在制备抗犬细小病毒制剂或药物中的应用。


背景技术：

2.犬细小病毒(canine parvovirus，cpv)，属细小病毒科、细小病毒属、猫细小病毒亚群的单链dna病毒，其结构蛋白vp2具有中和抗体的抗原表位。犬细小病主要有两种临床表现型，一种是出血性肠炎型，表现为剧烈呕吐、血便、白细胞大量减少；另一种是非化脓性心肌炎型，病犬会突然死亡。该病传播速度快，发病率高，幼犬死亡率高达70％，成年犬无明显临床症状，但是隐性带毒的现象普遍存在。
3.目前，常用的犬细小病治疗策略以注射疫苗和注射特异性抗体为主。其中，有研究者对cpv疫苗的免疫效果进行检测发现，仅有不到20％的疫苗能产生具有保护力的抗体。而且临床上治疗犬细小病的方法主要针对其急性脱水症状，给病犬输液进行补液，此种注射疫苗的治疗效果有限；市场上常用的抗体是鼠源性igg，病犬反复或者长期使用，lgg中fc片段的鼠源成分会使犬对其免疫应答后产生特异性抗体，从而不利于犬细小病的治疗。另外，大分子抗体不能有效中和细胞内病毒，影响治疗效果。可见，这两种方式的治疗效果均不理想。如何寻求一种新的治疗手段是解决上述问题的关键。
4.红景天苷(salidroside，简称“sal”)是药用植物红景天的主要成分，目前的研究证明红景天苷不仅具有抗衰老、抗辐射、抗氧化、增强注意力、缓解疲劳、提高免疫力效果，还具有抗病毒等药理作用。但是，如何将红景天苷合理的应用在抗犬细小病毒以及抗犬细小病毒药物制备上目前未见相关报道。


技术实现要素：

5.本发明针对常规的犬细小病毒治疗策略效果不理想的技术问题，提出一种红景天苷在制备抗犬细小病毒制剂或药物中的应用，为红景天苷的应用扩宽了新的领域。
6.为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
7.红景天苷在抗犬细小病毒中的应用。
8.在一实施方式中，所述红景天苷的使用浓度小于等于10mg/ml。
9.在一实施方式中，所述红景天苷的使用浓度通过以下方法得到：
10.向细胞悬液中添加不同浓度的红景天苷溶液，培养一段时间后，加入cck8试剂，通过检测吸光值测定不同浓度的红景天苷对细胞毒性大小，进而确定红景天苷的使用浓度。
11.在一实施方式中，所述红景天苷溶液的浓度分别为6mg/ml、8mg/ml、10mg/ml、12mg/ml、14mg/ml、16mg/ml、18mg/ml、20mg/ml。
12.在一实施方式中，所述培养一段时间具体为培养48h，继续培养所用时间为1-4h。
13.本发明还提供了一种红景天苷在制备抗犬细小病毒制剂或药物中的应用。
14.在一实施方式中，所述抑制犬细小病毒制剂或药物中包含红景天苷。
4h，具体可选1、2、3、4或上述限定范围内的任一数值均落在本发明的保护范围之内。
33.本发明实施例还提供了一种红景天苷在制备抗犬细小病毒制剂或药物中的应用。
34.在一具体实施方式中，所述抑制犬细小病毒制剂或药物中包含红景天苷。
35.在一具体实施方式中，所述抑制犬细小病毒制剂或药物是由红景天苷单独给予或与药学上可接受的辅料共同制备而成的制剂或药物给予犬。
36.在一具体实施方式中，所述抑制犬细小病毒制剂或药物剂型为片剂、胶囊剂、丸剂、口服液体制剂、颗粒剂、散剂、注射剂或糖浆剂中的任意一种或几种的组合。
37.在一具体实施方式中，所述抑制犬细小病毒制剂或药物的给药方式为口服、注射、喷雾或吸入中的任意一种或几种的组合。
38.为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的红景天苷在制备抗犬细小病毒制剂或药物中的应用，下面将结合具体实施例进行描述。
39.实施例1
40.本实施例提供了红景天苷对f81细胞增殖与毒性试验，该试验采用cck-8法进行，具体为：
41.cck 8试验可用于细胞增殖和毒性分析。其基本原理为：该试剂中含有wst-8，在电子载体的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒染料，生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比，因此可直接用于细胞增殖和毒性分析。
42.(1)细胞增殖试验
43.(1-1)接种细胞悬液100μl于96孔板中，预先置于37℃，5％co2饱和湿度的培养箱内培养；向每孔内加入10μl的cck-8试剂，将培养板在培养箱孵育一段时间(注意不要在孔中生成气泡，它们会影响od值读数)；
44.(1-2)用酶标仪测定在450nm处的吸光度；若暂时不测定od值，可向每孔中加入10μl 1m的氯化氢溶液或者1％w/v sds溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。
45.(2)细胞毒性分析试验
46.(2-1)接种100μl细胞悬液(5000个/孔)于96孔板，过夜培养后，向细胞孔中加入10μl不同浓度(6mg/ml、8mg/ml、10mg/ml、12mg/ml、14mg/ml、16mg/ml、18mg/ml、20mg/ml)的红景天苷，培养48h后，向每孔内加入10微升cck8试剂，培养1-4h；
47.(2-2)在450mm波长处测定吸光值，并绘制f81细胞od值与培养时间的关系图(见图1)，参比波长为600m或以上。若暂时不测定od值，可以向每孔中加入10μl 1m的氯化氢溶液或者1％w/v sds溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。
48.(2-3)基于测量得到的吸光值计算细胞活力，计算公式如下：
49.细胞活力(％)＝[a(加药)-a(空白)]/[a(0加药)-a(空白)]*100
[0050]
a(加药)：具有细胞、cck8溶液和药物溶液的孔的吸光度
[0051]
a(空白)：具有培养基和cck8溶液而没有细胞的孔的吸光度
[0052]
a(0加药)：具有细胞、cck8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度细胞活力。
[0053]
实验结果：不同浓度红景天苷对f81细胞存活率的影响结果见图2，从图2可知，当红景天苷的浓度低于14mg/ml时，细胞存活率达到80％以上，当红景天苷的浓度小于等于10mg/ml时，细胞存活率高达90％以上，对细胞没有毒性，由此可得出红景天苷的使用浓度为小于等于10mg/ml。
[0054]
实施例2
[0055]
本实施例提供了红景天苷(浓度为10mg/ml)对犬细小病毒抑制试验，具体为：
[0056]
在12孔板中培养单层细胞24h，将0.1moi犬细小病毒孵育细胞1h后，弃上清，加入10mg/ml红景天苷分别孵育12h、24h、36h收集细胞及上清测定病毒tcid
50
，其中，病毒tcid
50
的测定方法如下：
[0057]
(1)取-80℃保存的犬细小病毒置于冰上融化，取100μl病毒液加入到900μl dmem细胞维持液中，反复吹打混匀，再取第一管病毒稀释液100μl加入到第二管900μl dmem细胞维持液中，反复吹打混匀，依次按照10倍梯度倍比稀释，将病毒稀释到10-10
倍(注意稀释完一个梯度后必须要换枪头)；
[0058]
(2)将f81细胞接种于96孔板，每孔100μl，每孔约2
×
104个细胞。置于37℃，5％co2培养箱中培养过夜。将病毒稀释液按100μl/孔加入96孔板中，每个稀释度8个重复孔，最后两列留作正常细胞对照，对照细胞每孔加入100μl dmem维持液，置于细胞培养箱中3-4d后观察细胞病变程度；
[0059]
(3)在显微镜下观察细胞病变程度，记录各病毒稀释度下病变孔数目和非病变孔数目，计算各病毒稀释度下病变孔占的百分率。使用reed-muench法计算tcid
50
/100μl，计算公式如下：
[0060]
距离比例＝(高于50％的病变率的百分数-50％)/(高于50％的病变率的百分数-低于50％的病变率的百分数)
[0061]
lgtcid
50
＝距离比例
×
稀释度对数 高于50％的病变率的最高稀释倍数的对数
[0062]
实验结果：测定结果如图3所示，对于仅孵育犬细小病毒而未孵育红景天苷的f81细胞而言(即对照组)，随着培养时间的不断延长，病毒滴度显著提高，而在f81细胞上同时孵育犬细小病毒和红景天苷后，病毒滴度相比对照受到显著抑制，这充分表明使用浓度为10mg/ml的红景天苷能够明显抑制病毒的增殖。
[0063]
实施例3
[0064]
本实施例基于实施例2得到的实验结果，进一步对孵育犬细小病毒的f81细胞和同时孵育犬细小病毒和红景天苷的f81细胞进行荧光成像拍照，具体操作如下：
[0065]
孵育犬细小病毒的f81贴壁细胞和同时孵育犬细小病毒和红景天苷的f81贴壁细胞用pbs缓冲液洗涤，4％多聚甲醛固定细胞30min，pbs缓冲液洗涤1次，加入含0.3％triton x-100的pbs缓冲液室温孵育5min，pbs缓冲液洗涤两次加入50μl tunel/孔，37℃避光孵育60min，pbs缓冲液洗涤3次加适量dapi(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)染30min，再用pbs缓冲液洗涤两次转至荧光成像系统观察荧光，荧光拍照结果详见图4。
[0066]
实验结果：从图4可知，在仅孵育犬细小病毒的f81细胞中，可观察到明显的绿色荧光，这表明细胞因感染病毒发生凋亡，而在细胞上同时孵育犬细小病毒和红景天苷后，并未观察到明显的细胞凋亡，这充分表明浓度为10mg/ml的红景天苷可抑制病毒诱导的细胞凋亡。

技术特征：
1.红景天苷在抗犬细小病毒中的应用。2.根据权利要求1所述的红景天苷在抗犬细小病毒中的应用，其特征在于，所述红景天苷的使用浓度小于等于10mg/ml。3.根据权利要求1所述的红景天苷在抗犬细小病毒中的应用，其特征在于，所述红景天苷的使用浓度通过以下方法得到：向细胞悬液中添加不同浓度的红景天苷溶液，培养一段时间后，加入cck8试剂继续培养，通过检测吸光值测定不同浓度的红景天苷对细胞毒性大小，进而确定红景天苷的使用浓度。4.根据权利要求3所述的红景天苷在抗犬细小病毒中的应用，其特征在于，所述红景天苷溶液的浓度分别为6mg/ml、8mg/ml、10mg/ml、12mg/ml、14mg/ml、16mg/ml、18mg/ml、20mg/ml。5.根据权利要求3所述的红景天苷在抗犬细小病毒中的应用，其特征在于，所述培养一段时间具体为培养48h，继续培养所用时间为1-4h。6.红景天苷在制备抗犬细小病毒制剂或药物中的应用。7.根据权利要求6所述的红景天苷在制备抗犬细小病毒制剂或药物中的应用，其特征在于，所述抑制犬细小病毒制剂或药物中包含红景天苷。8.根据权利要求6所述的红景天苷在制备抗犬细小病毒制剂或药物中的应用，其特征在于，所述抑制犬细小病毒制剂或药物是由红景天苷单独给予或与药学上可接受的辅料共同制备而成的制剂或药物给予犬。9.根据权利要求6所述的红景天苷在制备抗犬细小病毒制剂或药物中的应用，其特征在于，所述抑制犬细小病毒制剂或药物剂型为片剂、胶囊剂、丸剂、口服液体制剂、颗粒剂、散剂、注射剂或糖浆剂中的任意一种或几种的组合。10.根据权利要求6所述的红景天苷在制备抗犬细小病毒制剂或药物中的应用，其特征在于，所述抑制犬细小病毒制剂或药物的给药方式为口服、注射、喷雾或吸入中的任意一种或几种的组合。

技术总结
本发明提出一种红景天苷在制备抗犬细小病毒制剂或药物中的应用，属于药物化学领域，能够解决常规的犬细小病毒治疗策略效果不理想的技术问题。该技术方案包括：红景天苷在抗犬细小病毒中的应用，通过向细胞悬液中添加不同浓度的红景天苷，测定不同浓度的红景天苷对细胞毒性大小，进而确定了红景天苷的使用浓度小于等于10mg/mL，试验结果表明其浓度小于等于10mg/mL时，细胞存活率高达90％以上，对细胞没有毒性；红景天苷在制备抗犬细小病毒制剂或药物中的应用。本发明能够应用于抗犬细小病毒以及抗犬细小病毒制剂或药物制备方面。以及抗犬细小病毒制剂或药物制备方面。以及抗犬细小病毒制剂或药物制备方面。


技术研发人员：朱记平 李毅 王小梅 李么明 谢立兰
受保护的技术使用者：武汉佳牧生物科技有限公司
技术研发日：2022.03.21
技术公布日：2022/5/25