一种丝素蛋白透明质酸复合水凝胶、制备方法和应用

1.本发明属于生物医学技术领域，涉及水凝胶，具体涉及一种丝素蛋白/透明质酸复合水凝胶、制备方法和应用。


背景技术：

2.丝素蛋白/再生丝素蛋白是一种从蚕丝中提取的天然蛋白，是制备丝基材料的主要来源，具有良好的生物相容性、机械性能，透氧性和药物渗透性，并且可被生物降解。再生丝素蛋白在保留了蚕丝众多性能的基础上，还克服了很多聚合物处理和可操作性差的缺点，可被加工成多种形式的材料，如凝胶、纤维、膜、微球、海绵和微管等。但是生物医学应用（如组织工程支架）通常要求材料具有生物活性，尽管丝素蛋白具备一些生物活性，然而自身却缺乏细胞黏附肽序列。
3.透明质酸是一类由 d-葡萄糖醛酸和 n-乙酰葡糖胺结构单元组成的天然糖胺多糖，通常以阴离子形式存在，广泛分布在结缔组织、上皮组织和神经组织中，是天然细胞外基质的成分之一，存在着黏附肽序列，可改善细胞附着、扩散和增殖。透明质酸拥有极强的亲水性能，可以通过与水分子间的非共价键作用而调节生物流体的粘弹性，在细胞迁移、增殖、分化以及血管再生中有很重要的作用，因此被广泛的应用于生物医学研究中。
4.水凝胶是通过物理或化学方式交联的亲水性聚合物网络，其能够吸收大量水分，具有固体和液体的双重性质，这些水不溶性的 3d 网络结构一方面能够实现对活性分子的高效固定和释放，另一方面能够模拟细胞外基质特性为细胞活动提供稳定的微环境。此外，水凝胶通常具有良好的生物相容性和对氧和营养物质等水溶性代谢物的高渗透性等，这些能力使它们成为生物医学应用如药物释放和组织工程的理想支架材料。将丝素蛋白与透明质酸进行复配，既可以避免单一材料的性能不足，同时可实现两种材料的优势互补，在生物医学材料中具有更好地应用前景。
5.申请号为cn202010481125.6的发明专利公开了一种机械强度高且可拉伸的丝素蛋白/透明质酸水凝胶，该水凝胶表现出了较高的机械强度并具有高延展性，解决了在大部分水凝胶中存在的机械性能差的问题，但在这种水凝胶形成过程中由于丝素蛋白的空间效应阻碍了甲基丙烯酸化的透明质酸的交联反应，因此，需要加入n，n-二甲基丙烯酰胺单体协同反应，使形成的水凝胶生物相容性下降。申请号为cn201910096059.8的中国专利中公开了一种可实现细胞三维装载的丝素蛋白/透明质酸双网络水凝胶的制备方法，该方法通过对透明质酸进行甲基丙烯酸酐改性，赋予了透明质酸光交联的能力，并通过超声处理诱导丝素蛋白向β折叠结构转变，水凝胶能够实现细胞在高强、高韧的双网络水凝胶中的三维培养，虽然该水凝胶具有良好的生物相容性，但其制作过程中需要用到两种交联方式，制作工序复杂，丝素蛋白最终以物理交联的方式参与水凝胶的形成。“facile preparation of bioactive silk fibroin/hyaluronic acid hydrogels”[int j biol macromol. 2018, 118，775-782]一文中利用化学交联剂edc-nhs制备了丝素蛋白/透明质酸复合水凝胶，该水凝胶具有良好的力学性能及可调节的吸水率和孔隙率，但其凝胶时间相对较长，并且化学
交联剂的残留将影响其生物相容性。
[0006]
综上，现有制备丝素蛋白/透明质酸复合水凝胶的方式存在着生物相容性差、制作工序复杂、化学残留等问题，同时存在不能[张1] 交联反应效率和生物相容性的缺陷，为了解决现有技术存在的上述缺陷，本发明研发了一种机械性能良好，生物相容性好，制作工艺简化的光交联丝素蛋白/透明质酸复合水凝胶。


技术实现要素：

[0007]
本发明目的是提供一种丝素蛋白/透明质酸复合水凝胶。
[0008]
本发明的另一个目的是提供上述丝素蛋白/透明质酸复合水凝胶的制备方法。
[0009]
本发明的再一个目的是提供上述丝素蛋白/透明质酸复合水凝胶的应用。
[0010]
本发明是通过以下技术方案实现的：一种光交联的丝素蛋白/透明质酸复合水凝胶，以丝素蛋白和透明质酸为原料，将丝素蛋白通过甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰，将透明质酸通过甲基丙烯酸酐修饰，将修饰的产物按照丝素蛋白和透明质酸以质量浓度比为1%-10%：0.5%-3%溶于去离子水，利用紫外光驱动交联得到。
[0011]
进一步地，上述光交联的丝素蛋白/透明质酸复合水凝胶的制备方法，步骤为：（1） 制备甲基丙烯酸酰化丝素蛋白：将蚕丝脱胶、溶解后滴加甲基丙烯酸缩水甘油酯，在50-70℃搅拌条件下反应2-4h，透析过滤得到再生丝素溶液，冷冻干燥得到白色粉末状的甲基丙烯酸酰化丝素蛋白；（2）制备 meha白色海绵 ：将透明质酸加入去离子水持续搅拌至完全溶解，加入甲基丙烯酸酐进行修饰，滴加碱性溶液保持ph在8.2-8.8，冰浴条件下反应20-30h，透析过滤后冷冻干燥得到meha白色海绵；（3）将甲基丙烯酸酰化丝素蛋白与meha白色海绵按照丝素蛋白与透明质酸的质量浓度比为1%-10%：0.5%-3%溶解在去离子水中，搅拌均匀，按照质量浓度为0.2%-1%加入光引发剂，共混液经超声震荡均匀，置于365nm紫外灯下照射成胶，即得。
[0012]
更进一步地，所述的透明质酸分子量为7000-50000da。
[0013]
所述的光引发剂为2-羟基-4
′‑
(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮。
[0014]
所述的碱性溶液为氢氧化钠溶液。
[0015]
所述的甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰丝素蛋白的摩尔质量为424mm，甲基丙烯酸酐修饰透明质酸的质量浓度为3%。
[0016]
所述的紫外灯照射时间为5-10min。
[0017]
本发明还提供了丝素蛋白/透明质酸复合水凝胶在制备组织工程支架、或/和其他生物材料负载细胞、药物及生物活性物质中的应用。
[0018]
本发明利用甲基丙烯酸缩水甘油酯能够和氨基、羟基或者羧基发生反应，从而在聚合物分子上成功修饰乙烯基的原理，在修饰丝素蛋白分子时甲基丙烯酸缩水甘油酯分子发生开环，并和丝素蛋白分子上赖氨酸的氨基反应，通过这种方式可以在一个氨基上修饰两个乙烯基，因此在一定程度上增加了乙烯基修饰的程度；透明质酸重复单元上的羟基可以和酸酐反应来生成酯键，从而将双键接枝在透明质酸的结构上，经过乙烯基修饰的丝素蛋白和透明质酸能保持其各自的优良性能，通过将两者复合可以分别发挥各自的优势。
[0019]
2-羟基-4
′‑
(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮由于具有较好的生物相容性，已成为常用的自由基紫外光引发剂，因此本发明中选择它作为光引发剂，修饰在丝素蛋白和透明质酸上的碳碳双键经过紫外光照射发生自由基聚合反应进行交联，在反应过程中生成的氧自由基优先与材料上接枝的乙烯基反应，能够很好的保护细胞膜免受自由基的攻击，因此能够作为组织工程支架负载细胞、药物及生物活性物质。同时选择合适波长的紫外光，通过控制紫外光照射的照射时间，最小化紫外光和自由基带来的负面影响，因此能够以温和友好的方式形成水凝胶。
[0020]
与现有技术相比，本发明具有以下优点：（1）本发明复合水凝胶细胞相容性较好，能够提供细胞粘附位点，有利于细胞的粘附、扩散和增殖，特别适于用作组织修复的支架材料，同时具有促血管生成的特性，更适合用于软组织再生；（2）本发明复合水凝胶的机械性能优良，（3）本发明制备方法简便，采用光交联的方式，形成水凝胶的速度快，效率高，可以控制在几分钟甚至几十秒内，同时可通过控制光源的开关，控制聚合反应的开始和终止；（4）光交联可以精确调节光照的强度或时间，实现对水凝胶众多性能如力学性能等的调控，光驱动聚合能够在体内以一种非入侵的方式进行，具有良好的生物医学应用前景。
附图说明
[0021]
图1是本发明实施例1提供的丝素蛋白/透明质酸复合水凝胶。
[0022]
图2是本发明实施例2提供的丝素蛋白/透明质酸复合水凝胶冻干后的横截面电子显微镜照片。
[0023]
图3是本发明实施例5提供的cck-8增殖实验的结果图。
[0024]
图4是本发明实施例6提供的细胞活死染色的激光共聚焦图片。
具体实施方式
[0025]
下面结合实施例和附图对本发明做进一步描述。
[0026]
实施例1取5g脱胶后的丝素纤维，将其溶解在三元溶液中（由cacl2/水/乙醇摩尔比为1:8:2配成）,在72
ꢀ°
c搅拌溶解成丝素蛋白混合溶液。在溶液中滴加甲基丙烯酸缩水甘油酯3ml，在60℃下，以300rpm的速度搅拌2h，使甲基丙烯酸缩水甘油酯和丝素蛋白之间充分反应。将所得到的丝素混合溶液装入透析袋中，用去离子水透析4天得到再生丝素溶液。冷冻干燥得到乙烯基修饰的再生丝素白色粉末。称取1g透明质酸，加入100ml去离子水持续搅拌至完全溶解，加入3ml的甲基丙烯酸酐进行修饰，不断滴加5mol/l的氢氧化钠溶液保持ph在8.5左右，在冰浴条件下反应30h（反应过程保持避光），透析过滤后于冷冻干燥机冷冻干燥得到meha白色海绵。
[0027]
将冻干后的产物按照丝素蛋白与透明质酸的质量浓度比为3%：1%溶解在去离子水中，拌均匀后得到混合溶液。光引发剂2-羟基-4
′‑
(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮质量浓度为0.2%，共混液经超声震荡均匀，置于365nm紫外灯下照射5min,得到丝素蛋白/透明质酸复合
水凝胶。
[0028]
所制得的丝素蛋白/透明质酸复合水凝胶的图片如图1所示。
[0029]
实施例2取5g脱胶后的丝素纤维，将其溶解在三元溶液中（由cacl2/水/乙醇摩尔比为1:8:2配成）,在70
ꢀ°
c搅拌溶解成丝素蛋白混合溶液。在溶液中滴加甲基丙烯酸缩水甘油酯3ml，在50℃下，以300rpm的速度搅拌4h，使甲基丙烯酸缩水甘油酯和丝素蛋白之间充分反应。将所得到的丝素混合溶液装入透析袋中，用去离子水透析4天得到再生丝素溶液。冷冻干燥得到乙烯基修饰的再生丝素白色粉末。称取1g透明质酸，加入100ml去离子水持续搅拌至完全溶解，加入3ml的甲基丙烯酸酐进行修饰，不断滴加5mol/l的氢氧化钠溶液保持ph在8.3左右，在冰浴条件下反应20h（反应过程保持避光），透析过滤后于冷冻干燥机冷冻干燥得到meha白色海绵。
[0030]
将冻干后的产物按照丝素蛋白与透明质酸的质量浓度比为10%：2%溶解在去离子水中，拌均匀后得到混合溶液。光引发剂2-羟基-4
′‑
(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮质量浓度为0.5%，共混液经超声震荡均匀，置于365nm紫外灯下照射6min,得到丝素蛋白/透明质酸复合水凝胶。
[0031]
所制得的丝素蛋白/透明质酸复合水凝胶冻干后的横截面电子显微镜照片如图2所示。
[0032]
实施例3取5g脱胶后的丝素纤维，将其溶解在三元溶液中（由cacl2/水/乙醇摩尔比为1:8:2配成）,在72
ꢀ°
c搅拌溶解成丝素蛋白混合溶液。在溶液中滴加甲基丙烯酸缩水甘油酯3ml，在70℃下，以300rpm的速度搅拌3h，使甲基丙烯酸缩水甘油酯和丝素蛋白之间充分反应。将所得到的丝素混合溶液装入透析袋中，用去离子水透析4天得到再生丝素溶液。冷冻干燥得到乙烯基修饰的再生丝素白色粉末。称取1g透明质酸，加入100ml去离子水持续搅拌至完全溶解，加入3ml的甲基丙烯酸酐进行修饰，不断滴加5mol/l的氢氧化钠溶液保持ph在8.8，在冰浴条件下反应24h（反应过程保持避光），透析过滤后于冷冻干燥机冷冻干燥得到meha白色海绵。
[0033]
将冻干后的产物按照丝素蛋白与透明质酸的质量浓度比为1%：3%溶解在去离子水中，拌均匀后得到混合溶液。光引发剂2-羟基-4
′‑
(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮质量浓度为0.5%，共混液经超声震荡均匀，置于365nm紫外灯下照射8min,得到丝素蛋白/透明质酸复合水凝胶。
[0034]
实施例4取5g脱胶后的丝素纤维，将其溶解在三元溶液中（由cacl2/水/乙醇摩尔比为1:8:2配成）,在72
ꢀ°
c搅拌溶解成丝素蛋白混合溶液。在溶液中滴加甲基丙烯酸缩水甘油酯3ml，在70℃下，以300rpm的速度搅拌3h，使甲基丙烯酸缩水甘油酯和丝素蛋白之间充分反应。将所得到的丝素混合溶液装入透析袋中，用去离子水透析4天得到再生丝素溶液。冷冻干燥得到乙烯基修饰的再生丝素白色粉末。称取1g透明质酸，加入100ml去离子水持续搅拌至完全溶解，加入3ml的甲基丙烯酸酐进行修饰，不断滴加5mol/l的氢氧化钠溶液保持ph在8.5，在冰浴条件下反应24h（反应过程保持避光），透析过滤后于冷冻干燥机冷冻干燥得到meha白色海绵。
[0035]
将冻干后的产物按照丝素蛋白与透明质酸的质量浓度比为3%：0.5%溶解在去离子水中，拌均匀后得到混合溶液。光引发剂2-羟基-4
′‑
(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮质量浓度为0.5%，共混液经超声震荡均匀，置于365nm紫外灯下照射8min,得到丝素蛋白/透明质酸复合水凝胶。
[0036]
实施例5将实施例1制成的乙烯基修饰的丝素蛋白和透明质酸按照质量浓度比为（0%、3%-5%）：1%溶解于去离子水中，光引发剂2-羟基-4
′‑
(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮质量浓度为0.5%，共混液经超声震荡均匀。将混合溶液经0.2μm无菌滤膜过滤，然后按照1
×
106cells/ml的比例加入人牙髓干细胞悬浮液混匀，注入24孔板中，置于365nm紫外灯下照射5min，得到负载细胞的丝素蛋白/透明质酸复合水凝胶。放入培养箱中在37℃、5％的co2的条件下培养，培养期间定期每隔48小时更换一次培养基，得到组织工程三维细胞支架。培养1、4、7天后，使用cck-8测试支架中细胞的增殖情况。结果如图3所示，可以看出随着时间的增加，细胞增殖情况明显。
[0037]
实施例6将实施例一制成的水凝胶前体液经0.22μm无菌滤膜过滤，然后按照1
×
106cells/ml的比例加入人牙髓干细胞悬浮液混匀，注入24孔板中，置于365nm紫外灯下照射5min，得到负载细胞的丝素蛋白/透明质酸复合水凝胶。放入培养箱中在37℃、5％的co2的条件下培养，培养期间定期每隔48小时更换一次培养基，得到组织工程三维细胞支架。培养3、7天后，取出三维细胞支架用pbs缓冲液清洗2遍，将清洗后的三维细胞支架浸没于含有fda和pi的pbs溶液中染色，通过激光共聚焦扫描显微镜(lscm)观察三维支架中的细胞的生长状态和分布情况。结果如附图4所示。结果显示，随时间的增加，细胞增殖且无明显的死细胞。
[0038]
本发明以上实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制本发明仅为以上所述实施例。本领域普通技术人员在不脱离本发明原理和宗旨的情况下，针对这些实施例进行的各种变化、修改、替换和变型，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种丝素蛋白/透明质酸复合水凝胶，其特征在于，以丝素蛋白和透明质酸为原料，将丝素蛋白通过甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰，将透明质酸通过甲基丙烯酸酐修饰，将修饰的产物按照丝素蛋白和透明质酸以质量浓度比为1%-10%：0.5%-3%溶于去离子水，利用紫外光驱动交联得到。2.权利要求1所述的丝素蛋白/透明质酸复合水凝胶的制备方法，步骤为：（1） 制备甲基丙烯酸酰化丝素蛋白：将蚕丝脱胶、溶解后滴加甲基丙烯酸缩水甘油酯，在50-70℃搅拌条件下反应2-4h，透析过滤得到再生丝素溶液，冷冻干燥得到白色粉末状的甲基丙烯酸酰化丝素蛋白；（2）制备 meha白色海绵 ：将透明质酸加入去离子水持续搅拌至完全溶解，加入甲基丙烯酸酐进行修饰，滴加碱性溶液保持ph在8.2-8.8，冰浴条件下反应20-30h，透析过滤后冷冻干燥得到meha白色海绵；（3）将甲基丙烯酸酰化丝素蛋白与meha白色海绵按照丝素蛋白与透明质酸的质量浓度比为1%-10%：0.5%-3%溶解在去离子水中，搅拌均匀，按照质量浓度为0.2%-1%加入光引发剂，共混液经超声震荡均匀，置于365nm紫外灯下照射成胶，即得。3.根据权利要求2所述的丝素蛋白/透明质酸复合水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述的制备甲基丙烯酸酰化丝素蛋白，是在60℃，300rpm的速度搅拌下反应3h。4.根据权利要求2所述的丝素蛋白/透明质酸复合水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的透明质酸分子量为7000-50000da。5.根据权利要求2所述的丝素蛋白/透明质酸复合水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的光引发剂为2-羟基-4
′‑
(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮。6.根据权利要求2所述的丝素蛋白/透明质酸复合水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的碱性溶液为氢氧化钠溶液。7.根据权利要求2所述的丝素蛋白/透明质酸复合水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰丝素蛋白的摩尔质量为424mm，甲基丙烯酸酐修饰透明质酸的质量浓度为3%。8.根据权利要求2所述的丝素蛋白/透明质酸复合水凝胶的制备方法，其特征在于，所述的紫外灯照射时间为5-10min。9.权利要求1所述的丝素蛋白/透明质酸复合水凝胶在制备组织工程支架、或/和其他生物材料负载细胞、药物及生物活性物质中的应用。

技术总结
本发明公开了一种丝素蛋白/透明质酸复合水凝胶、制备方法和应用，属于生物医学材料技术领域。以丝素蛋白和透明质酸为原料，将丝素蛋白通过甲基丙烯酸缩水甘油酯修饰，将透明质酸通过甲基丙烯酸酐修饰，将修饰的产物按照丝素蛋白和透明质酸以质量浓度比为1%-10%：0.5%-3%溶于去离子水，利用紫外光驱动交联得到。本发明复合水凝胶细胞相容性较好，机械性能优良，制备方法简便，形成水凝胶的速度快，效率高，这种光交联丝素蛋白和透明质酸复合水凝胶可以作为组织工程支架负载细胞、药物及生物活性物质。活性物质。活性物质。


技术研发人员：赵彬 张郁芳 王璐
受保护的技术使用者：山西医科大学
技术研发日：2022.03.20
技术公布日：2022/5/25