CaM2基因作为调控因子在提高植物对虫害胁迫抗性中的应用

cam2基因作为调控因子在提高植物对虫害胁迫抗性中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及cam2基因作为调控因子在提高植物对虫害胁迫抗性中的应用。


背景技术：

2.专业化、规模化、集约化生产是蔬菜产业的发展方向，然而随着复种指数不断增加，土壤连作障碍愈发严重，土传病虫害是导致连作障碍的主要因素，尤以根结线虫危害为甚，对设施蔬菜产业造成巨大经济损失。
3.根结线虫病是一种常见的植物寄生性线虫病害，因可导致植物根部形成根结而得名(jones等，“top 10 plant-parasitic nematodes in molecular plant pathology.”mol plant pathol，2013，14(9)，946-61)。根结线虫寄主范围广泛，能够危害蔬菜和粮食作物等3000多种植物，严重危害农业生产。据统计，世界范围内已报道的根结线虫有90多种，在我国危害作物生产的主要是以下四种：南方根结线虫(meloidogyne incognita)、爪哇根结线虫(meloidogyne javanica)、花生根结线虫(meloidogyne arenaria)和北方根结线虫(meloidogyne hapla)，其中南方根结线虫为主要危害设施蔬菜的线虫类型。
4.番茄(solanum lycopersicum l)是世界范围内消费量最大的蔬菜作物，也是我国设施栽培面积最大、经济效应最佳的蔬菜作物。番茄对根结线虫高度敏感，目前生产上常用的防御措施是使用各种熏蒸剂和杀线虫剂，但是存在低效性、环境污染和影响农产品品质等问题。因此，明确植物对根结线虫的信号转导途径，剖析植物根结线虫的防御机制，发掘植物的根结线虫抗性基因，对于开发经济有效和环境友好的高效防治线虫新措施具有十分重要的科学和现实意义。
5.作为固着生物，植物的一生会面临环境的各种变化甚至胁迫，当植物的局部组织受到胁迫时，会快速诱导ca
2
和活性氧等第二信使，将环境变化的信息传递到远端未受胁迫的组织和器官(kollist等，“rapid responses to abiotic stress:priming the landscape for the signal transduction network.”trends in plant science，2018)。这些信号分子本身并没有提高植物抗逆性的作用，但可与激素信号相耦合，触发逆境应答基因，激活抗逆响应。目前已知，植物在应对包括线虫在内的病虫害侵染时，主要通过茉莉酸(ja)来提高免疫能力，ja是一种由脂质化合物衍生而来的激素，它的合成需经过多步酶促反应(wasternack和song，“jasmonates:biosynthesis,metabolism,and signaling by proteins activating and repressing transcription.”journal of experimental botany，2016，1303)，但诱导和调控ja合成的分子机制尚未明晰。
6.钙调素(cam)是细胞中主要的ca
2
结合蛋白，存在于所有真核生物中，并且高度保守(yang和poovaiah，“calcium/calmodulin-mediated signal network in plants.”trends in plant science，2003，8(10)，505-512)。cam本身没有生物学活性，与ca
2
结合后其空间结构发生改变，露出疏水表面，结合目标蛋白，激活下游抗逆基因。研究表明，cam在增强植物抗逆性中发挥重要作用：大豆cam4通过激活r2r3型myb2转录因子，提高了植株的
耐盐性(yoo等，“direct interaction of a divergent cam isoform and the transcription factor,myb2,enhances salt tolerance in arabidopsis.”j biol chem，2005，280(5)，3697-706)；拟南芥cam3通过调节热激转录因子hsf1的转录活性，调控植株耐热性(zhang等，“molecular and genetic evidence for the key role of atcam3 in heat-shock signal transduction in arabidopsis.”plant physiol，2009，149(4)，1773-84)；番茄cam6通过与类cor47蛋白互作，负调控番茄的抗冷性(李卉梓，“slglrs和slcams在调控番茄低温抗性中的机制研究.”浙江大学，2019)。然而，cam基因在虫害领域的功能尚未有研究报道。因此，利用相关突变体材料，结合分子遗传技术，研究cam2基因在抗植物根结线虫中的作用，对研发蔬菜根结线虫的绿色高效防控技术具有重要的理论和生产价值。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于发掘植物中参与抵御虫害胁迫尤其是根结线虫的抗性基因，为研发蔬菜根结线虫的绿色高效防控技术提供理论依据。
8.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
9.本发明提供了cam2基因作为调控因子在提高植物对虫害胁迫抗性中的应用，所述cam2基因的蛋白编码区的核苷酸序列如seq id no.1所示或与seq id no.1所示序列具有至少70％同源性且编码的蛋白在功能上等价。
10.cam2基因的cds区长度为450bp，其编码的蛋白质由149个氨基酸残基组成，其氨基酸序列如seq id no.2所示。
11.进一步的，所述应用包括：利用生物技术手段，使植物体中的cam2基因上调表达，提高其对虫害胁迫的抗性。
12.进一步的，所述植物为番茄。
13.进一步的，所述虫害为根结线虫。
14.本发明构建了番茄cam2基因过表达和突变体转基因植株，通过根结线虫接种实验，发现cam2基因在番茄抗线虫胁迫中起到正向调控的作用。
15.进一步的，所述cam2基因作为调控因子通过提高植株抗性激素的含量，进而提高植物对虫害胁迫的抗性。
16.本发明研究表明，cam2基因在植物中的表达量越低，接种根结线虫后，植株的根结数目越多，抗性激素含量越低，对根结线虫越敏感；cam2基因在植物中的表达量越高，接种根结线虫后，植株的根结数目越少，抗性激素含量越高，植株对根结线虫的抗性越强。
17.进一步的，所述抗性激素为茉莉酸(ja)。
18.进一步的，cam2基因通过促进茉莉酸合成相关基因的表达，提高茉莉酸含量，进而提高植株对根结线虫的抗性。
19.具体地，所述茉莉酸合成相关基因包括aoc基因(allene oxide cyclase，solyc02g085730)、aos2基因(allene oxide synthase 2，solyc11g069800)和loxf基因(lipoxygenase f，solyc01g006560)，其蛋白编码区的核苷酸序列分别如seq id no.3，seq id no.4和seq id no.5所示；上述三个基因分别编码的丙二烯氧化物环化酶、丙二烯氧化物合酶和脂氧合酶为ja合成的关键酶。
20.本发明还提供了一种提高植物根结线虫抗性的方法，所述方法包括：将核苷酸序列如seq id no.1所示的cam2基因片段插入过表达载体中构建重组质粒，再通过农杆菌介导技术将目标基因片段导入受体，培育筛选获得功能性获得的转基因植株。
21.优选的，所述过表达载体pfgc1008-ha。
22.优选的，所述受体为番茄子叶。
23.本发明具备的有益效果：
24.本发明首次公开cam2基因在提高植物对虫害尤其是根结线虫抗性中的调控作用，cam2基因通过诱导茉莉酸合成相关基因的表达，提高茉莉酸的含量，进而提高植株对根结线虫的抗性。番茄cam2基因上调表达能够显著提高其对根结线虫的抗性。本发明为培育抗线虫番茄新品种提供了基因资源，具有一定的潜在应用价值，为剖析植物防御根结线虫的响应机制提供更完善的理论依据，具有重要的实践价值。
附图说明
25.图1为cam2基因过表达番茄植株的植物蛋白western blot检测结果。
26.图2为cam2基因crispr/cas9敲除番茄植株t2代(纯合，不含外源cas9片段)的测序结果示意图。其中，与野生番茄比较，可知番茄cam2突变体在sgrna的位置发生了4个碱基的缺失突变，导致蛋白翻译提前终止；wt代表野生型番茄，cam2代表突变体植株，
“‑‑‑‑‑‑‑‑”
表示缺失4bp序列。
27.图3为cam2突变体和过表达植株接种根结线虫4周后的根结表型观察。其中，a为植株根部酸性品红染色结果；b为根结数目统计结果；wt代表野生型番茄，cam2代表突变体植株，oe-cam2代表过表达植株；通过方差分析(anova)对数据进行统计分析，使用tukey检验分析了数据差异的显著性，图中相同字母表示平均值在p《0.05时无显著差异。
28.图4为cam2突变体和过表达植株接种根结线虫24h后的ja和茉莉酸异亮氨酸(ja-ile)含量变化。其中，a为ja含量，b为ja-ile含量；wt代表野生型番茄，cam2代表突变体植株，oe-cam2代表过表达植株；通过方差分析(anova)对数据进行统计分析，使用tukey检验分析了数据差异的显著性，图中相同字母表示平均值在p《0.05时无显著差异。
29.图5为cam2突变体和过表达植株接种根结线虫24h后的ja合成相关基因表达水平分析。其中ja合成相关基因为aoc、aos2和loxf；a为aoc基因表达量，b为aos2基因表达量，c为loxf基因表达量；wt代表野生型番茄，cam2代表突变体植株，oe-cam2代表过表达植株；通过方差分析(anova)对数据进行统计分析，使用tukey检验分析了数据差异的显著性，图中相同字母表示平均值在p《0.05时无显著差异。
具体实施方式
30.下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，以下列举的仅是本发明的具体实施例，本发明的保护范围不仅限于此。
31.若未特别指明，下述实施例中所用实验方法均为常规方法，所用实验材料、试剂等，均可从商业途径得到。
32.下述实施例中采用的番茄品种为番茄常规品种ailsa craig。
33.实施例1：cam2基因过表达载体的构建
34.根据cam2基因的cds序列分析，设计特异性引物cam2-f和cam2-r，并在引物的5’端分别添加限制性酶切位点ascⅰ和kpnⅰ，序列为：cam2-f：5
’‑
ttacaattaccatggggcgcgccatggcggatcagctgacgg-3’(seq id no.6)；cam2-r：5
’‑
aacatcgtatgggtaggtaccttacttggccatc atgaccttaac-3’(seq id no.7)；
35.使用植物总rna提取试剂盒(rna simple total rna kit，tiangen，china)提取番茄总rna，方法参照试剂盒说明书。使用反转录试剂盒(hiscriptii q rt supermix for qpcr， gdna wiper，vazyme，china)反转录样品总rna，方法参照试剂盒说明书。
36.以所得cdna为模板，cam2-f和cam2-r为引物，特异性pcr扩增cam2基因，得到番茄cam2基因的cds全长450bp。
37.用限制性内切酶ascⅰ和kpnⅰ酶切35s启动子驱动的植物表达载体pfgc1008-ha，使其线性化，然后进行pcr片段和载体的同源重组，得到过表达载体pfgc1008-cam2-ha。
38.由浙江尚亚生物技术有限公司上述重组质粒进行测序，测序结果如seq id no.1所示，结果表明所克隆的序列与solgenomics中公布的序列(solyc10g081170)一致。该基因编码的蛋白质的氨基酸序列如seq id no.2所示。
39.实施例2：cam2基因编辑载体的构建
40.在sgn网站(http://solgenomics.net/)找到cam2的dna全长序列如seq id no.9所示。利用crispr-p网站(http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/crispr)设计cam2基因的sgrna序列如seq id no.8所示。合成sgrna序列退火，与经过bbsⅰ单酶切过的atu6-sgrna-atubq-cas9中间载体用t4连接酶16℃过夜连接。将新得到的atu6-sgrna(cam2)-atubq-cas9重组质粒和载体pcambia1301分别用hindⅲ和ecorⅰ双酶切，二者用t4连接酶16℃过夜连接，得到基因编辑载体pcambia1301-atu6-sgrna(cam2)-atubq-cas9。由浙江尚亚生物技术有限公司上述重组质粒进行测序确认。
41.实施例3：番茄cam2转基因材料的制备与鉴定
42.将实施例1获得的过表达载体pfgc1008-cam2-ha和实施例2获得的基因编辑载体pcambia1301-atu6-sgrna(cam2)-atubq-cas9分别转化农杆菌gv3101，利用农杆菌侵染法转化到野生型番茄ailsa craig的子叶中，利用潮霉素初步筛选出候选t0代转基因植株。
43.1、利用western-blot验证cam2过表达阳性植株，具体方法如下：
44.取0.3g番茄叶片液氮研磨，加入600μl提取液(50mm tris-hcl，ph8.0，150mm nacl，1mm edta，1％triton x-100，1mm phenylmethylsulfonyl fluoride(pmsf)和0.2％β-mercaptoethanol)研磨成匀浆，4℃，12000rcf离心20min，取上清。蛋白含量用考马斯亮蓝法测定。蛋白变性后用12％的sds-page胶分离。sds-page胶分离蛋白转移至硝酸纤维素膜上，用含5％脱脂奶粉的tbst缓冲液(20mm tris，ph 7.5,150mm nacl，0.1％tween20)室温封闭1h，用鼠的ha单克隆抗体(pierce，26183)室温孵育1h，再用羊抗鼠(millipore，ap124p)的hrp二抗室温孵育1h，抗原抗体复合物利用鲁米诺化学发光检测试剂盒(thermo fisher scientific，34080)检测。
45.western-blot结果见图1。wt无蛋白条带，而过表达株系检测到cam2-ha蛋白条带。wt为野生型番茄ailsa craig；oe-cam2为cam2过表达植株。
46.2、pcr检测cam2crispr/cas9突变体植株
47.将上述t0代cam2突变体阳性植株种植于生长室，自交得到t1种子，并利用pcr和测
序技术验证基因编辑情况，获得了缺失了4个碱基的纯合突变体植株，序列比较如图2所示。将t1代植株进行自交，获得稳定遗传的t2代。
48.实施例4：番茄cam2基因对线虫抗性的影响
49.对得到的番茄cam2基因过表达和突变体植株进行接种根结线虫处理，具体如下：
50.将野生型番茄(wt)、突变体植株(cam2)和过表达植株(oe-cam2)分为两组，一组为对照组，一组为实验组。
51.当番茄长至四叶一心时，对实验组进行根结线虫接种处理，接种的根结线虫为j2期的南方根结线虫。
52.南方根结线虫的培养和接种，具体步骤如下：
53.(1)将感染根结线虫的病根打浆后与沙土充分混匀置于340mm
×
270mm
×
130mm的水培箱中，每盆栽种6株普通栽培番茄，于浙江大学农业试验站温室中繁殖线虫，室温维持在22-26℃。
54.(2)挖取发病严重的根系，将根部沙土用清水缓慢冲洗干净后，浸泡于0.5％的次氯酸钠水溶液中搅拌消毒3min，后用清水冲洗数次。
55.(3)将根剪成1cm的根段，放入搅碎机中打碎。匀浆依次经过80目、200目、325目和500目筛子，最后将500目筛子中的残渣冲洗于烧杯中，获得卵悬浮液。
56.(4)将收集到的卵悬浮液均匀倒入铺有8层吸水纸的13cm
×
13cm方形培养皿中，置于28℃恒温培养箱中孵化2-3d。
57.(6)用洗瓶轻轻冲洗培养皿，使孵化好的根结线虫冲洗进烧杯中，在50倍光学显微镜(bx61；olympus co.，tokyo，japan)下观察记录j2期线虫的数目。
58.(7)将线虫悬浮液接种至待处理植株根部土壤，每株约接种1000条j2期线虫，置于人工气候室培养，期间正常浇水。
59.植株栽培在装有高温灭菌的河沙的塑料杯中，用大量元素水溶肥(杭州康成农业科技有限公司)浇灌。生长条件：温度25℃/20℃(昼/夜)，光周期12h/12h(昼/夜)，光通量密度为400μmolm-2
s-1
，湿度75％左右。
60.线虫处理4周后，进行根结表型观察和根结数统计。
61.根结表型观察采用酸性品红染色法，具体方法如下：
62.(1)根系洗净，用1.5％-5％的次氯酸钠溶液对根系进行5-10min的光下漂白，以去除根系内影响染色的杂质。
63.(2)将上述根系用清水冲洗并浸泡30min。倒掉浸泡液，吸干根系水分，用3.5％酸性品红溶液完全浸没根系，加热至沸腾并持续3-5min，室温静置冷却。
64.(3)根系冷却后用清水冲洗，除去表面多余品红液体。
65.(4)加入酸性甘油后加热至沸腾后立即将根系转移至常温酸性甘油中。
66.(5)在酸性甘油中放置24h后进行根结表型拍照和根结数统计。
67.根结数统计的具体方法如下：
68.将待统计的番茄根系洗净，表面水分吸干，称重，仔细记录每棵根的根结数。通过计算每克鲜重根的根结数量来评估植株的线虫敏感性。
69.根结表型观察和根结数统计结果见图3。与wt相比，cam2突变体植株根结数显著增多，表明植株根结线虫抗性减弱；而oe-cam2植株的根结数显著减少，表明植株根结线虫抗
性增强(图3b)，从根系酸性品红染色结果可以明显看到根结表型差异(图3a)。说明cam2基因能够提高番茄对南方根结线虫的抗性。
70.实施例5：番茄cam2基因对抗性激素ja和ja-ile的影响
71.由于ja在植物响应生物胁迫中扮演重要角色，故对野生型番茄(wt)、过表达植株(oe-cam2)和突变体植株(cam2)接种根结线虫后，进行茉莉酸(ja)和茉莉酸异亮氨酸耦合物(ja-ile)含量和合成相关基因表达量测定。
72.1、在根结线虫接种24h后取番茄叶样，提取和测定ja和ja-ile含量，具体方法如下：
73.(1)将100mg液氮冷冻番茄叶片或根系样品在磨样仪中研磨成粉末；
74.(2)加入1ml色谱级乙酸乙酯，该乙酸乙酯已加入d6-ja(olchemim ltd.，czechoslovakia)和d6-ja-ile(quality control chemicals inc.，usa)作为内标，最终浓度分别为10ng ml-1
和40ng ml-1
的标准液。将样品置于暗处，4℃180rpm萃取12h；
75.(3)在4℃，12000rcf，离心10min，收集上清液，用1ml色谱级乙酸乙酯再次萃取沉淀；
76.(4)合并两次上清液于5ml离心管中，n2吹干；
77.(5)加入0.5ml的70％色谱级甲醇(v/v)，充分涡旋，将离心管中残余物重新悬浮，4℃，12000rcf，离心10min；
78.(6)将上清液转移至棕色玻璃瓶中，用hplc-ms/ms进行分析测定(agilent technologies，california，usa)。ja和ja-ile含量测定结果见图4。
79.根结线虫接种24h后，cam2突变体中由根结线虫诱导的ja(图4a)和ja-ile(图4b)含量都显著低于野生型番茄；而oe-cam2植株中的ja(图4a)和ja-ile(图4b)含量都显著高于野生型番茄。表明cam2基因促进ja合成。
80.2、在根结线虫接种24h后取番茄叶样提取rna，根据引物序列进行实时荧光定量pcr(qrt-pcr)，具体方法如下：
81.使用植物总rna提取试剂盒(rna simple total rna kit，tiangen，china)提取总rna，方法参照试剂盒说明书。总rna用nano drop(thermo fisher scientific，usa)测定rna的浓度和质量，并将rna浓度调为基本一致。使用反转录试剂盒(hiscriptii q rt supermix for qpcr， gdna wiper，vazyme，china)反转录样品总rna，方法参照试剂盒说明书。
82.使用sybr green rt-pcr kit荧光染料试剂盒(vazyme，china)和lightcycler 480实时荧光检测系统(roche，switzerland)进行基因表达分析。选择番茄actin2基因作为内参基因，扩增引物序列如表1所示。
83.表1 实时荧光定量pcr引物序列
[0084][0085]
每个反应体系为20μl：10μl染料，8.2μlddh2o，1μl反转录产物，正向、反向引物各0.4μl。
[0086]
pcr反应条件为：95℃3min；95℃30s，58℃15s，72℃1min，共设45个循环。
[0087]
相对转录水平的计算参照livak和schmittgen(“analysis of relative gene expression data using real-time quantitative pcr and the 2-δδct
method”methods，2001，25，402-408)的方法，qrt-pcr结果见图5。
[0088]
根结线虫接种24h后，与野生型番茄相比，cam2突变体中根结线虫诱导的ja合成相关基因aoc(图5a)，aos2(图5b)和loxf(图5c)的表达量显著下降；而oe-cam2植株则相反。表明cam2基因能够促进ja合成相关基因表达。

技术特征：
1.cam2基因作为调控因子在提高植物对虫害胁迫抗性中的应用，其特征在于，所述cam2基因的蛋白编码区的核苷酸序列如seq id no.1所示或与seq id no.1所示序列具有至少70％同源性且编码的蛋白在功能上等价。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述cam2基因编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括：利用生物技术手段，使植物体中的cam2基因上调表达，提高其对虫害胁迫的抗性。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述植物为番茄。5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述虫害为根结线虫。6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述cam2基因作为调控因子通过提高植株抗性激素的含量，进而提高植物对虫害胁迫的抗性。7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抗性激素为茉莉酸。8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述cam2基因通过促进茉莉酸合成相关基因的表达，提高茉莉酸含量；所述茉莉酸合成相关基因包括aoc基因、aos2基因和loxf基因，其蛋白编码区的核苷酸序列分别如seq id no.3，seq id no.4和seq id no.5所示。9.一种提高植物根结线虫抗性的方法，其特征在于，包括：将核苷酸序列如seq id no.1所示的cam2基因片段插入过表达载体中构建重组质粒，再通过农杆菌介导技术将目标基因片段导入受体，培育筛选获得功能性获得的转基因植株。10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述受体为番茄子叶。

技术总结
本发明公开CaM2基因作为调控因子在提高植物对虫害胁迫抗性中的应用，属于生物技术领域。所述CaM2基因的蛋白编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明首次公开CaM2基因在提高植物对虫害尤其是根结线虫抗性中的调控作用，CaM2基因通过诱导茉莉酸合成相关基因的表达，提高茉莉酸的含量，进而提高植株对根结线虫的抗性。番茄CaM2基因上调表达能够显著提高其对根结线虫的抗性。本发明为培育抗线虫番茄新品种提供了基因资源，具有一定的潜在应用价值，为剖析植物防御根结线虫的响应机制提供更完善的理论依据，具有重要的实践价值。具有重要的实践价值。具有重要的实践价值。


技术研发人员：喻景权 孙婷 周艳虹 周杰 胡璋健 敬北宇
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：2022.03.18
技术公布日：2022/5/25