一种黄芩药材的质量评价方法与流程

1.本发明涉及药材质量检测技术领域，尤其涉及一种黄芩药材的质量评价方法。


背景技术：

2.黄芩，为唇形科黄芩的干燥根，主产于我国河北、山西、内蒙古、河南、陕西等地，北方多数省区都可种植。临床应用广泛，常用于湿温、黄疸、泻痢、肺热咳嗽、痈肿疮毒、胎动不安等症。目前，黄芩市场上野生品、不同年限的栽培品及习用品混杂，质量参差不齐，严重影响其相关产品的临床疗效。而2020年版《中国药典》黄芩的定量指标仅有黄芩苷一项，难以真正体现和保障黄芩的内在品质及其相关制剂的质量。
3.现有技术中指纹图谱能全面反映中药材的化学成分信息，但其具有模糊性的属性，致使其缺乏准确的定性定量数据支撑，具有一定的局限性。另外，现有技术中虽然也有以多个黄酮类成分的同步测定来用于控制黄芩质量的相关报道，但因其成本高，且必须有足够量、高纯度的化学对照品，使其在实际的生产和市场监督中很难得到应用。
4.因此，需要提供一种黄芩中成药黄酮类成分的多指标质量评价方法，以全面的对黄芩质量进行评价，保证临床疗效。


技术实现要素：

5.针对现有黄芩药材的质量评价方法成本高、对照品用量大，以及无法对黄芩质量进行全面评价的问题，本发明提供一种黄芩药材的质量评价方法。
6.为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：
7.一种黄芩药材的质量评价方法，采用高效液相色谱法，包括以下步骤：
8.(1)混合对照品溶液和供试品溶液的配制：
9.取黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和野黄芩苷对照品，用溶剂配制成混合对照品溶液；
10.取黄芩药材配制成供试品溶液；
11.(2)对所述混合对照品溶液和供试品溶液进行检测，色谱条件如下：
12.色谱柱：c18色谱柱；
13.流动相a：乙腈，流动相b：体积浓度为0.18％-0.22％的磷酸水溶液；
14.流速：0.9ml/min-1.1ml/min；
15.检测波长：278nm-282nm；
16.洗脱方式为梯度洗脱，洗脱程序如下：
17.0min，17％流动相a，83％流动相b；
18.20min，22％流动相a，78％流动相b；
19.45min，22％流动相a，78％流动相b；
20.50min，30％流动相a，70％流动相b；
21.60min，40％流动相a，60％流动相b；
22.70min，60％流动相a，40％流动相b。
23.相对于现有技术，本发明提供的黄芩药材的质量评价方法准确、快捷、高效、价廉，在同一液相色谱条件下既可以完成黄芩指纹图谱的构建，还可实现对黄芩药材中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和野黄芩苷含量的定量检测。且本发明提供的黄芩质量评价方法使黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素和野黄芩苷的分离度均大于1.5；黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素和野黄芩苷的线性关系良好(r≥0.9998)；精密度、重复性、稳定性试验的rsd均小于2.0％。说明本发明提供的黄芩药材的质量评价方法准确度高、耐用性好，可解决现有黄芩质量评价方法成本高、对照品用量大，以及无法对黄芩质量进行全面评价的问题，为控制黄芩药材的质量控制提供了有效保障，具有较高的推广和实用价值。
24.可选的，所述溶剂为体积浓度为68％-72％的甲醇水溶液。
25.可选的，所述流速为1.0ml/min。
26.可选的，所述检测波长为280nm。
27.可选的，所述色谱条件的柱温为25℃-35℃，进样体积为10μl。
28.可选的，所述色谱柱规格为250mm*4.6mm，填料直径为5μm。
29.可选的，所述高效液相色谱的色谱柱为shiseido capcell pak c18、thermo acclaimtm 120 c18或agilent 5 hc-c18中的一种。
30.可选的，所述混合对照品溶液中黄芩苷的浓度为624.00μg/ml，汉黄芩苷浓度为401.88μg/ml，黄芩素浓度为42.92μg/ml，汉黄芩素浓度为43.40μg/ml，野黄芩苷浓度为41.56μg/ml。
31.可选的，所述供试品的制备方法包括：将黄芩药材研磨，加入体积浓度为68％-72％的甲醇水溶液，超声提取，过滤，得所述供试品溶液。
32.可选的，采用上述高效液相色谱条件构建黄芩药材的指纹图谱，同时对黄芩药材中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和野黄芩苷的含量进行定量。
33.进一步地，本发明以黄芩苷为内参物，按外标法测定黄芩苷含量，然后采用一测多评法(qams)测定汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和野黄芩苷的含量。具体方法为建立黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素和野黄芩苷的相对校正因子，并用相对校正因子计算黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素和野黄芩苷的含量。
34.本发明提供的黄芩药材的质量评价方法，结合指纹图谱法和一测多评法，解决了目前黄芩质量评价方法成本高、对照品用量大，以及无法对黄芩质量进行全面评价的问题，且该检测方法准确、快捷，具有较高的推广和实用价值。
附图说明
35.图1为本发明实施例2中由10批黄芩供试品溶液在紫外280nm下的色谱图采用中位数法自动匹配生成的对照指纹图谱；
36.图2为本发明实施例2中对照图谱加10批黄芩药材的指纹图谱；
37.图3为本发明实施例2中混合对照品溶液的色谱图。
具体实施方式
38.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明
进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
39.本发明用到的试药：
40.甲醇(色谱纯，费舍尔公司)；乙腈(色谱纯，费舍尔公司)；磷酸(分析纯，北京化工厂)；娃哈哈纯净水。
41.对照品：黄芩苷(批号110715-201318，含量93.3％)；黄芩素(批号111595-201306，含量97.8％)；汉黄芩苷(批号112002-201702，含量98.5％)；汉黄芩素(批号111514-200403，含量100.0％)；野黄芩苷(批号110842-200605，含量100.0％)。上述对照品均购自中国食品药品检定研究院。
42.10批黄芩药材从热河不同栽培基地采集，将其编号为s1-s10，分别是：s1产地为承德市双滦区；s2产地为承德市滦平县；s3产地为承德市丰宁县；s4产地为承德市丰宁县；s5产地为承德市宽城县；s6产地为承德市兴隆县；s7产地为承德市隆化县；s8产地为承德市营子区；s9产地为承德市区；s10产地为承德市平泉市。上述黄芩药材经承德市食品药品检验检测中心鉴定为黄芩属植物黄芩s.baicalensis的干燥根。
43.实施例1
44.1.1溶液的配制
45.(1)混合对照品溶液：分别精密称取黄芩苷15.71mg、汉黄芩苷10.20mg置于25ml容量瓶中，取黄芩素10.73mg、汉黄芩素10.85mg、野黄芩苷10.39mg置于50ml容量瓶中，用体积浓度为70％的甲醇水溶液定容，摇匀；再分别吸取上述5种溶液各5ml置于同一25ml容量瓶中，用体积浓度为70％甲醇的水溶液配制成黄芩苷浓度为624.00μg/ml，汉黄芩苷浓度为401.88μg/ml，黄芩素浓度为42.92μg/ml，汉黄芩素浓度为43.40μg/ml和野黄芩苷浓度为41.56μg/ml的混合对照品溶液。
46.(2)供试品溶液：分别取编号为s1-s10的10批热河黄芩药材供试品适量，研细，精密称取0.15g，放于锥形瓶内，精密加入体积浓度为70％的甲醇水溶液50ml，称定重量，超声处理45min，再称定重量，用70％的甲醇水溶液补足减失的重量，先过滤纸，再取续滤液过0.22μm微孔滤膜，制得10份所述供试品溶液。
47.1.2黄芩药材的质量评价方法中的高效液相色谱条件
48.色谱系统：waters e2695色谱系统；
49.色谱柱：shiseido capcell pak c18，250mm*4.6mm，5μm；
50.流动相a：乙腈；
51.流动相b：体积浓度为0.2％的磷酸水溶液；
52.流速：1.0ml/min；
53.检测波长：280nm；
54.柱温：25℃；
55.进样体积为10μl；
56.梯度洗脱，洗脱程序如下：
[0057][0058][0059]
实施例2
[0060]
建立对照指纹图谱：
[0061]
分别取实施例1制备的混合对照品溶液和10份供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪进行检测，记录色谱图，采用2004a指纹图谱相似度评价软件，时间窗宽度设置为0.10，采用中位数法自动匹配生成黄芩药材的对照指纹图谱，见图1，并生成对照图谱加10批黄芩药材的指纹图谱，见图2。
[0062]
10批黄芩药材指纹图谱色谱峰匹配出共有峰30个，参照混合对照品溶液的保留时间和光谱信息，混合对照品溶液的色谱图见图3，将其中10号峰指认为野黄芩苷，14号峰指认为黄芩苷，21号峰指认为汉黄芩苷，26号峰指认为黄芩素，28号峰指认为汉黄芩素，各特征峰相对峰面积及相对保留时间均具有较好的重复性，相似度均在0.990以上，相似度结果见表1。
[0063]
表1指纹图谱相似度结果
[0064][0065][0066]
实施例3
[0067]
线性关系：
[0068]
取实施例1制备的混合对照品溶液作为线性储备液。
[0069]
分别精密吸取上述线性储备液5ml、2.5ml、1ml、0.5ml和0.1ml置于10ml容量瓶中，加体积浓度为70％的甲醇水溶液稀释至刻度，制得线性溶液。
[0070]
取各线性溶液10μl，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。以进样浓度为横坐标，响应信号(峰面积)为纵坐标，用最小二乘法进行线性回归，得到各成分的回归方程以及线性范围，结果见表2。
[0071]
表2各待测成分回归方程及线性范围
[0072]
待测成分回归方程r线性范围(μg/ml)黄芩苷y＝3456328.50x-6031.000.99986.24～624.00黄芩素y＝611892.30x-23286.500.99990.42～42.92汉黄芩苷y＝3717698.30x+2290.000.99994.01～401.88汉黄芩素y＝724224.80x-28499.000.99990.43～43.40野黄芩苷y＝304540.50x-11993.000.99980.41～41.56
[0073]
由表2可知，黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素和野黄芩苷分别在6.24μg/ml-624.00μg/ml、0.42μg/ml-42.92μg/ml、4.01μg/ml-401.88μg/ml、0.43μg/ml-43.40μg/ml和0.41μg/ml-41.56μg/ml范围内线性关系良好，r≥0.9998。
[0074]
实施例4
[0075]
精密度试验：
[0076]
取实施例1制备的混合对照品溶液，注入高效液相色谱仪进行检测，连续进样测定6次，记录峰面积，计算rsd。
[0077]
结果显示，连续进样6次，黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素和野黄芩苷峰面积的rsd分别为0.68％、0.84％、0.23％、1.62％和0.86％，说明本方法精密度良好。
[0078]
实施例5
[0079]
稳定性试验：
[0080]
取实施例1制备的编号为s7的供试品溶液在室温下静置，每隔0h、4h、8h、12h、24h后，注入高效液相色谱仪进行检测，记录峰面积，计算rsd。
[0081]
结果显示，供试品溶液在室温条件下，放置24h，黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和野黄芩苷这5个黄酮类成分峰面积的rsd分别为0.1％、0.1％、2.0％、0.5％和0.86％，表明24h内供试品溶液中上述5种成分的稳定性良好。
[0082]
实施例6
[0083]
加样回收率试验：
[0084]
取已知含量的编号为s7的黄芩样品细粉，精密称定0.075g，置于具塞锥形瓶中，以黄芩样品中各成分含量：对照品为1∶1的质量比加入一定量的对照品，精密加入体积浓度为70％甲醇的水溶液50ml，称定重量，超声处理45min，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，先过滤纸，再取续滤液过0.22μm微孔滤膜，制得回收率溶液，平行制备6份。
[0085]
取实施例1制备的编号为s7的供试品溶液和上述回收率溶液，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图。以外标法计算各待测成分含量并计算加样回收率。
[0086]
结果显示，黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和野黄芩的平均加样回收率均在97.20％～98.07％之间，rsd在0.76％～2.03％之间，表说明该方法的准确度良好。
[0087]
实施例7
[0088]
相对校正因子的计算及验证：
[0089]
7.1相对校正因子的计算
[0090]
分别取实施例1制备的混合对照品溶液1μl、2μl、5μl、10μl、15μl、20μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。以黄芩苷为内参物，计算相对校正因子，并取其平均值用于一测多评法定量分析。内参物黄芩苷(a)的含量采用外标法计算，其他4种成分黄芩素(b)、汉黄芩苷(c)、汉黄芩素(d)和野黄芩苷(e)的含量采用各自与内参物的相对校正因子进行计算，各待测成分相对校正因子计算结果见表3。
[0091]
相对校正因子计算公式：f
k/s
＝(ck×as
)/(cs×ak
)，其中cs为内参物进样浓度，as为内参物峰面积，ck为成分k的进样浓度，ak为成分k的峰面积。
[0092]
表3不同进样量相对校正因子的计算
[0093]
进样量(μl)f
b/afc/afd/afe/a
10.740.950.651.4420.730.950.641.4450.730.940.641.46100.720.940.621.43150.710.940.621.43200.710.950.621.42均值0.720.940.631.43rsd(％)1.670.572.100.95
[0094]
由表3可知，以黄芩苷为内参物，黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素和野黄芩苷的平均相对校正因子分别为0.72、0.95、0.63和1.43。
[0095]
7.2不同仪器对相对校正因子的影响
[0096]
将实施例1中高效液相色谱条件中的色谱系统替换为agilent1260色谱系统，考察agilent1260和waters e2695色谱系统对相对校正因子的影响。
[0097]
取实施例1制备的混合对照品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，检测结果见表4。
[0098]
表4不同色谱条件下相对校正因子的计算
[0099]
色谱柱f
b/afc/afd/afe/a
waters e26950.720.940.621.43agilent 12600.720.940.621.45均值0.720.940.621.44rsd(％)0000.69
[0100]
结果显示，各待测成分的相对校正因子的rsd均小于5％，说明agilent1260和waters e2695色谱系统对相对校正因子无显著影响。
[0101]
7.3不同色谱柱对相对校正因子的影响
[0102]
将实施例1中高效液相色谱条件中的色谱柱分别替换为thermo acclaimtm 120 c18和agilent 5 hc-c18，考察不同品牌色谱柱对相对校正因子的影响。
[0103]
取实施例1制备的混合对照品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，检测结果见表5。
[0104]
表5不同色谱柱下相对校正因子的计算
[0105][0106][0107]
结果显示，各待测成分的相对校正因子的rsd均小于5％，说明shiseido capcell pak c18、thermo acclaimtm 120 c18和agilent 5 hc-c18色谱柱对相对校正因子无显著影响。
[0108]
7.4不同流速不同柱温对相对校正因子的影响
[0109]
微调色谱条件：将实施例1中高效液相色谱条件中的流速分别设置为0.9ml/min、1.0ml/min和1.1ml/min；将实施例1中高效液相色谱条件中的柱温分别设置为25℃、30℃和35℃，考察不同流速和柱温对相对校正因子的影响。
[0110]
在以上微调后的色谱条件下，分别取实施例1制备的混合对照品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，检测结果见表6和表7。
[0111]
表6不同流速对相对较正因子影响
[0112]
流速(ml/min)f
b/afc/afd/afe/a
0.90.740.950.651.441.00.730.950.641.441.10.730.940.641.45均值0.720.940.631.43rsd(％)0.790.611.821.05
[0113]
表7不同柱温对相对较正因子影响
[0114][0115][0116]
结果显示，不同流速和柱温下，各待测成分的相对校正因子的rsd均小于5％，说明
微调色谱流速和柱温对相对校正因子无显著影响。
[0117]
由表5-表7可知，在不同色谱系统和不同色谱条件下各待测成分的相对保留时间重现性良好，说明该方法耐用性良好，适于实际应用和推广。
[0118]
实施例8
[0119]
一测多评法待测成分色谱峰的定位：
[0120]
本试验分别考察相对保留值(r)和保留时间差(δt)在不同品牌色谱柱中的重现性，见表8和表9。
[0121]
表8不同色谱柱下待测成分的相对保留值
[0122]
色谱柱r
b/arc/ard/are/a
shiseido capcell pak c
18
1.301.161.490.74thermo acclaim
tm 120 c
18
1.331.181.550.73agilent 5 hc-c
18
1.291.151.500.75均值1.291.151.500.75rsd(％)1.301.071.731.10
[0123]
表9不同色谱柱下待测成分的保留时间差
[0124][0125][0126]
结果显示，相对保留值的波动相对较小，因此采用相对保留值法佐以化合物的紫外光谱进行黄芩中待测成分色谱峰的定位。根据实验结果最终确定相对保留值分别为rb/a＝1.30，rc/a＝1.07，rd/a＝1.73，re/a＝1.10。
[0127]
实施例9
[0128]
一测多评法与外标法测定结果的比较：
[0129]
首先在与本技术相同的色谱条件下，采用外标法(esm)对黄芩中的黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素和野黄芩苷进行多成分同步含量测定，然后根据以黄芩苷为内参物，用建立的一测多评法对黄芩素、汉黄芩苷、汉黄芩素和野黄芩苷的含量进行计算，并采用spss软件对2种方法测得的数据进行对比分析，以验证一测多评法用于黄芩中黄酮类成分多指标质量评价的准确性，结果见表10。
[0130]
表10 qams与esm测得5种指标成分的结果对比
[0131][0132][0133]
经配对t检验结果显示，2种方法所得量值无显著性差异(p＞0.05)，结果表明建立的一测多评法准确可靠，可用于黄芩中黄酮类成分多指标质量评价。
[0134]
综上所述，本发明提供的黄芩药材的质量评价方法，在同一液相色谱条件下可以构建黄芩药材的指纹图谱，同时可以测定黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和野黄芩苷的含量，实现对黄芩中黄酮类组分的定量检出。提出了黄芩的质量评价标准为野黄芩苷含量大于1.0mg/g，黄芩苷含量大于90.0mg/g，黄芩素含量大于2.5mg/g，汉黄芩苷含量大于20.0mg/g，汉黄芩素含量大于1.0mg/g，且与对照指纹图谱相似度大于0.90。该方法准确、快捷、高效、价廉，具有应用和推广的价值。
[0135]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种黄芩药材的质量评价方法，其特征在于，采用高效液相色谱法，包括以下步骤：(1)混合对照品溶液和供试品溶液的配制：取黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和野黄芩苷对照品，用溶剂配制成混合对照品溶液；取黄芩药材配制成供试品溶液；(2)对所述混合对照品溶液和供试品溶液进行检测，色谱条件如下：色谱柱：c18色谱柱；流动相a：乙腈，流动相b：体积浓度为0.18％-0.22％的磷酸水溶液；流速：0.9ml/min-1.1ml/min；检测波长：278nm-282nm；洗脱方式为梯度洗脱，洗脱程序如下：0min，17％流动相a，83％流动相b；20min，22％流动相a，78％流动相b；45min，22％流动相a，78％流动相b；50min，30％流动相a，70％流动相b；60min，40％流动相a，60％流动相b；70min，60％流动相a，40％流动相b。2.如权利要求1所述的黄芩药材的质量评价方法，其特征在于，所述溶剂为体积浓度为68％-72％的甲醇水溶液。3.如权利要求1所述的黄芩药材的质量评价方法，其特征在于，所述流速为1.0ml/min。4.如权利要求1所述的黄芩药材的质量评价方法，其特征在于，所述检测波长为280nm。5.如权利要求1所述的黄芩药材的质量评价方法，其特征在于，柱温为25℃-35℃，进样体积为10μl。6.如权利要求1所述的黄芩药材的质量评价方法，其特征在于，所述色谱柱规格为250mm*4.6mm，填料直径为5μm。7.如权利要求6所述的黄芩药材的质量评价方法，其特征在于，所述高效液相色谱的色谱柱为shiseido capcell pak c18、thermo acclaimtm 120c18或agilent 5hc-c18中的一种。8.如权利要求1所述的黄芩药材的质量评价方法，其特征在于，所述混合对照品溶液中黄芩苷的浓度为624.00μg/ml，汉黄芩苷浓度为401.88μg/ml，黄芩素浓度为42.92μg/ml，汉黄芩素浓度为43.40μg/ml，野黄芩苷浓度为41.56μg/ml。9.如权利要求1所述的黄芩药材的质量评价方法，其特征在于，所述供试品的制备方法包括：将黄芩药材研磨，加入体积浓度为68％-72％的甲醇水溶液，超声提取，过滤，得所述供试品溶液。10.如权利要求1所述的黄芩药材的质量评价方法，其特征在于，采用上述高效液相色谱条件构建黄芩药材的指纹图谱，同时对黄芩药材中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和野黄芩苷的含量进行定量。

技术总结
本发明涉及药材质量检测技术领域，公开了一种黄芩药材的质量评价方法。本发明采用高效液相色谱法对黄芩药材进行质量评价，色谱条件为：C18色谱柱，流动相A为乙腈，流动相B为体积浓度为0.18％-0.22％的磷酸水溶液，流速为0.9mL/min-1.1mL/min，检测波长为278nm-282nm，柱温为25℃-35℃，进样体积为10μL，梯度洗脱。通过本发明提供的黄芩药材的质量评价方法，不但可构建黄芩药材的指纹图谱，鉴别黄芩真伪，同时还可以以黄芩苷为内参物，通过一测多评法实现对黄芩药材中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素和野黄芩苷含量的定量检测，从而为全面评价黄芩药材的质量提供了有效保障。障。障。


技术研发人员：高婧 杨甲忠 王志轩 刘长明 马文静
受保护的技术使用者：承德市食品药品检验检测中心
技术研发日：2022.03.18
技术公布日：2022/5/25