一种检测重金属汞离子的纳米花免疫层析试纸条及其应用

1.本发明属于重金属污染快速检测技术领域，具体涉及一种检测重金属汞离子的纳米花免疫层析试纸条及其应用。


背景技术：

2.随着当今社会生活水平的不断进步，大量未经过有效处理的工业污染以及农业活动导致重金属过量向外排放，进而通过大气沉降、农业施肥、人类摄食等方式直接或间接危害环境和人体健康。重金属在向环境中排放的过程中，会很快的沉降到沉降物中，很容易造成二次释放，继续污染水体，给鱼类等水生生物带来巨大危害；如果使用被污染过含有重金属的污水灌溉农田，将会对土壤和农作物造成严重污染．这些重金属污染均会在食物链的生物放大作用下成千上百倍富集，最终进入人体器官累积，对人体健康构成巨大威胁。植物具有吸收、积累汞的能力，并随水土中含汞量增加而吸收积累更多的汞，植物中汞又可被当做动物饲料，循环进入动物体内。汞及其它重金属传统的检测方法如原子吸收光度法、电感耦合等离子体质谱法等分析方法可满足痕量检测需要,但这些方法设备昂贵、检测费时费力且成本高,不适应现场快速检测的需要。免疫检测方法具有快速、灵敏、适于现场检测等特点,为汞及其它重金属的检测提供了一种新的选择。本发明利用金纳米花颗粒来标记抗体制备免疫检测的探针，结合免疫层析试纸条技术，研发出纳米花免疫层析试纸条，该免疫层系试纸条组装简单，特异性强，只针对hg
2+
有竞争，对其他金属离子无交叉反应，稳定性良好，灵敏度高，重复性极好，检测限低于国家食品安全标准，能有效准确地检出粮食中残留的重金属汞离子，这对粮食中重金属残留的安全监测具有中重要的现实意义。


技术实现要素：

3.本发明针对上述问题，提供一种检测重金属汞离子的纳米花免疫层析试纸条及其引用。本发明的纳米花免疫层析试纸条特异性强、灵敏度高，稳定性好，可用于粮食中汞离子的快速检测。
4.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种检测重金属汞离子的纳米花免疫层析试纸条，所述纳米花免疫层析试纸条包括以下组分：塑料外壳、样品垫、免疫探针结合垫、硝酸纤维膜和吸水垫；所述免疫探针结合垫滴加有抗汞离子单克隆抗体标记的金纳米免疫探针；所述抗汞离子单克隆抗体是抗hg
2+-itcbe半抗原鼠源杂交瘤细胞株7a1分泌的单克隆抗体，鼠源杂交瘤细胞株7a1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期为2021年11月23日，保藏号为cgmcc no.23879。
5.上述一种检测重金属汞离子的纳米花免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：（1）金纳米花溶液的制备：在经过王水浸泡并洗净高温灭菌的250 ml锥形瓶，加入100 ml双蒸水，用1 m naoh调至ph 7.5；搅拌条件下，依次加入750 μl的1wt%氯金酸、500 μ
l胶体金作为种子、300 μl 1wt%柠檬酸三钠和1 ml新配置的0.03 m的对苯二酚溶液，继续搅拌至稳定的蓝色，得金纳米花溶液；（2）免疫探针的制备：取10 ml金纳米花溶液置于已高温灭菌的细口瓶中，冰浴下，加入60 μl 0.1 m k2co3，搅拌均匀，随后逐滴加入60 μl 1.25 mg/ml的抗汞离子单克隆抗体，继续搅拌1 h，然后按照总体积的1％加入bsa，冰浴下，继续搅拌30 min，接下来按照总体积的0.5％加入peg 20000，冰浴下，继续搅拌30 min，最后将标记好的溶液封口，置于4℃冰箱平衡过夜，获得抗汞离子单克隆抗体标记的金纳米免疫探针（aunf-mab）；所述抗汞离子单克隆抗体的制备方法为：将处于对数生长期的鼠源杂交瘤细胞株7a1按1
×
10
6 cell/只注射到石蜡致敏过的9周龄balb/c雌鼠腹腔，待小鼠腹部膨大且有紧张感时抽取腹水，经分离纯化获得抗hg
2+-itcbe单克隆抗体；（3）免疫探针结合垫与样品垫的预处理：将未处理的免疫探针结合垫和样品垫用剪刀剪成宽1.3 cm的长条状，将其置于大培养皿中，用提前配好的封闭液淹没，随后转移到37 ℃恒温培养箱封闭2 h，从培养箱取出后滤去封闭液并继续置于培养箱烘干，烘干后4 ℃保存；后续使用按照长为1.3 cm，宽为4 mm裁剪；所述封闭液的组成为：5wt% bsa+1vol % tween-20；（4）nc膜划线：取羊抗鼠二抗在nc膜上进行划线，最终划在c线上的浓度为0.53 ng/cm，经过裁剪后，每张宽4 mm的卡条上划线羊抗鼠二抗的含量为0.212 ng；取完全抗原hg
2+-itcbe-bsa在nc膜上划线，最终划在t线上的浓度为0.043 ng/cm，经过裁剪后，每张宽4 mm的卡条上完全抗原hg
2+-itcbe-bsa的含量为0.0172 ng，即为t线；在同一张nc膜上，c、t线之间距离为0.5 cm；（5）免疫探针结合垫的制备：在预处理后的免疫探针结合垫上滴加3 μl步骤（2）制备的抗汞离子单克隆抗体标记的金纳米免疫探针；（6）免疫层析试纸条的组装：将步骤（4）划线后的nc膜、步骤（5）制备的免疫探针结合垫、步骤（3）预处理的样品垫、吸水垫，依次组装在底板上；其中免疫探针结合垫和样品垫重叠交错粘贴，同端相隔2 mm，吸水垫与nc膜首尾重叠2 mm，盖上塑料外壳盖子，干燥封装，置4 ℃保存。
6.上述一种检测重金属汞离子的纳米花免疫层析试纸条在检测重金属汞离子中的应用。
7.一种检测重金属汞离子的纳米花免疫层析试纸条的检测原理：当试纸条开始用于检测时，首先将制备好的金标探针滴加在金标垫上，待干燥后再按照示意图（图1）的组装方式进行组装，并将样品滴加在样品垫上，液体通过层析作用向吸水纸一端流过去，经过t线时，未与样品中的抗原结合的金标探针与t线完全抗原结合，就会停留在t线，结果t线显色，液体会继续向前流走，当经过c线时，与样品中抗原结合或者未结合的金标探针都会与c线结合，直至饱和，结合的金标探针会停留在c线，结果c线显色。整个显色反应需要10 min左右。
8.本发明的有益效果：（1）本发明开发出一种检测重金属汞离子的纳米花免疫层析试纸条，利用该纳米花免疫层析试纸卡能检测粮食中重金属汞离子的含量，检测阈值为50 ng/ml，在可视条件下最低检测限为1.56 ng/ml；在读卡仪检测条件下最低检测限为0.39 ng/ml，检测时间只
需要5 min。
9.（2）本发明提供一株抗重金属汞离子单克隆抗体细胞株，测定亲和力常数kaff=7.2
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9 l/mol，有着较高的亲和力，能够较好地识别汞离子半抗原，对汞离子50%抑制率ic50=37.426 ng/ml。
10.附图说明：图1 纳米花免疫层系试纸条结构模型。
11.图2 抗原偶联物琼脂糖凝胶分析。泳道1：klh 泳道2：hg
2+-itcbe-klh 泳道 3: hg
2+-itcbe-bsa 泳道4: bsa。
12.图3 小鼠尾血效价及icelisa测定；a 小鼠尾血效价；b 小鼠尾血竞争。
13.图4 7a1单克隆抗体亚型的鉴定。
14.图5 sds-paeg对7a1单克隆抗体纯化结果鉴定。
15.图6 纯化后抗体与腹水效价图。
16.图7 单克隆抗体亲和力测定。
17.图8 抗体交叉反应性分析。
18.图9 抗hg
2+-itcbe单克隆抗体竞争曲线的绘制。
19.图10 金纳米花溶液紫外全波长扫描图以及tem图。a：全波长扫描图；b：tem图。
20.图11 金纳米花标记最适抗体量和ph的测定。a 抗体标记金纳米花最适用量为4.98 μg/ml；b 抗体标记金纳米花体系的最适ph为6.5。
21.图12 金纳米花标记抗体最佳c以及最佳t线选择。a 最佳c线浓度为0.53 μg/cm；b 最佳t线浓度为0.043 μg/cm。
22.图13 纳米花免疫层系试纸条特异性测定。a 纳米花免疫层系试纸卡条特异性的测定；b 免疫读卡器对t线数值的测定。
23.图14 纳米花免疫层系试纸条灵敏度测定。a 免疫层系试纸卡条灵敏度的测定；b利用免疫读卡器对灵敏度数值的测定。
24.图15 纳米花免疫层系试纸条实际样品检测。
具体实施方式
25.下面结合具体实施例对本发明做进一步描述，在此发明的示意性实施例以及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
26.实施例1 抗汞离子单克隆细胞株7a1的筛选以及抗体制备1、人工完全抗原的制备取10 mg血蓝蛋白klh溶解于1 ml hbs缓冲液，用1 mol/ml naoh调节至ph=8，随后加入10 mg 1-（4-异硫氰苄基）乙烯基二胺-n,n,n,n-四乙酸(itcbe)，混合均匀后，在室温下180 r/min避光交联过夜，得到半抗原，再缓慢滴加130 μl 汞离子标准溶液（1 mg/ml），180 r/min转速避光交联反应6 h，用0.01 m pbs (nacl l8.0 g ； kcl 0.2 g ； na2hpo
4 1.44 g；kh2po
4 0.24 g ；加蒸馏水至 1000 ml，ph调至7.4)透析两天，每4 h更换一次透析液，透析后用peg 20000进行浓缩，得到免疫抗原hg
2+-itcbe-klh。将血蓝蛋白klh替换为牛血清白蛋白（bsa）制备检测抗原hg
2+-itcbe-bsa，制备过程同上（图2）。
27.2、动物免疫
以人工完全抗原hg
2+-itcbe-klh为免疫抗原，免疫6周龄balb/c小鼠。取hg
2+-itcbe-klh与等体积弗氏完全佐剂混匀，用漩涡振荡器与注射器抽吸结合乳化完全后以每只100 μg/200 μl的量于小鼠颈背部皮下多点注射。之后的免疫取免疫抗原与弗氏不完全佐剂按1:1混合乳化完全，按每只小鼠50 μg/200 μl皮下多点注射，每次免疫间隔14 d。第四次开始每次免疫后5-7 d内，尾部静脉取血，分离血清，采用间接elisa法检测小鼠血清效价，并用间接竞争elisa法测定小鼠血清ic50（图3）。选择效价及ic50均相对较好的小鼠，用2倍于前一次免疫剂量的免疫抗原hg
2+-itcbe-klh以生理盐水稀释至500 μl，腹腔注射，进行最后一次加强免疫。上述间接elisa和间接竞争elisa均为常规的elisa操作。
28.3、细胞融合最后的加强免疫后3-4 d取小鼠的脾细胞，采用50%聚乙二醇1450（peg 1450）作为融合剂，脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞按照4:1的细胞个数混合于20 ml新鲜的rpmi 1640不完全培养基，轻柔混合均匀后，置1100 rpm，7 min，离心，弃上清，轻弹离心管使底部细胞松散，随后将离心管置于37 ℃水浴，于1 min内先慢后快地滴加1 ml于37 ℃预热的50% peg 1450，边加边晃动离心管，促进细胞接触，静置0.5 min，随后在第1 min内缓慢加入1 ml rpmi 1640不完全培养液，在2 min内先慢后快补加rpmi 1640不完全培养液至40 ml，终止peg的作用；1000 rpm离心10 min，弃去上清，加入5 ml新鲜培养基轻柔混匀，将细胞悬液转入95 ml含2% hat的完全培养基（含20% fbs的rpmi 1640培养基），混合混匀，随后铺板至预先铺好饲养层细胞的96孔板（每孔约2000个饲养层细胞含10% fbs的rpmi 1640培养基），每孔100 μl；融合15 d后更换2% hat的完全培养基。待细胞生长至融合后第5-7 d，每孔吸取100 μl上清，补加120 μl含2% hat的完全培养基（含20% fbs的rpmi 1640培养基），融合第10-12 d，采用elisa方法分两步进行筛选，第一步采用间接elisa法筛选出抗hg
2+-itcbe而不抗载体蛋白的阳性孔；第二步采用间接竞争elisa法对第一步筛选出来的阳性孔以hg
2+-itcbe作为竞争抗原进行间接竞争elisa；选择吸光值和灵敏度均较高的孔（此处的吸光值，指同一个细胞孔的第一步检测结果；此处的灵敏度，指抑制率为50%时的竞争抗原浓度，即同一个细胞孔的第二步检测结果），采用有限稀释法进行亚克隆。第一次亚克隆后7-8 d采用同样的两步筛选进行检测，选择吸光值和灵敏度均较高的孔，其余亚克隆后10-12 d改为仅用间接elisa法进行检测，选择吸光值较高的孔，重复亚克隆2-3次后，直至阳性率为达到100%，获得鼠源杂交瘤细胞株7a1。
29.鼠源杂交瘤细胞株7a1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期为2021年11月23日，保藏号为cgmcc no. 23879。
30.4、抗体亚型鉴定用市售亚型测定试剂盒（厂家sigma，货号iso2-1kt）鉴定杂交瘤细胞株7a1分泌的抗hg
2+-itcbe的单克隆抗体，鉴定结果如图4所示，该细胞株为igg1亚型。
31.实施例2抗hg
2+-itcbe单克隆抗体的制备与性质鉴定1、腹水的制备与纯化1）腹水的制备将处于对数生长期的鼠源杂交瘤细胞株7a1按约1
×
10
6 cell/只注射到石蜡（500 μl/只）致敏过的9周龄balb/c雌鼠腹腔，一周后观察小鼠，待小鼠腹部膨大且有紧张感时抽
取腹水，置4℃、13000 r/min离心20 min，离心后分为三层（由下向上依次为聚集物，含有大量抗体的中间层，脂质层），取中间层。
32.2）抗体纯化将腹水用平衡缓冲液（na2hpo
4 3.5814 g/l，nacl 4.383 g/l，ph7.0）以1:10稀释，稀释后的腹水经过0.45 μm过滤后过protein g亲和层析柱，按商用的protein g亲和层析使用说明进行操作，将纯化后的抗体在透析袋中依次用pbs（nacl 8.0 g ； kcl 0.2 g ；na2hpo
4 1.44 g ；kh2po
4 0.24 g ；加蒸馏水至1000 ml，ph调至7.4）透析3 d，超纯水透析1 d，最后使用peg 20000浓缩，获得抗hg
2+-itcbe单克隆抗体，将单克隆抗体置-20℃冰箱中保存备用。以13% sds-page凝胶电泳检测验证抗体的纯度，如图5所示，纯化后的抗体在25 kda及50 kda处均有条带，分别对应igg抗体的轻链和重链，而且几乎没有杂带，表明纯化效果良好。用超纯水透析完全后，冷冻干燥，收集冻干粉，即得抗二价汞离子单克隆抗体7a1，将抗体置-20 ℃冰箱中备用。
33.3）效价测定：采用常规非竞争酶联免疫吸附分析（elisa）法测定腹水的效价及纯化后抗体的效价，结果如图6所示，腹水的效价超过1.28
×
105，纯化后抗体效价超过0.64
×
105，表明经过纯化后抗体依然保持较高活性。
34.2、单克隆抗体的表征鉴定1）亲和力测定根据beatty的方法，用间接elisa进行单克隆抗体亲和力常数kaff的测定。用elisa包被缓冲液将hg
2+-itcbe-bsa稀释成10、5、2.5 、1.25 μg/ml包被酶标板，其余步骤按常规间接elisa操作。利用origin 8.0进行分析，如图7所示，按下面公式计算抗体的亲和力常数，计算结果为7.3
×
10
9 l/mol，为高亲和力抗体。
35.式中： [ab] 表示抗原浓度为[ag] 时，在ic50处的抗体浓度；[ab]t表示抗原浓度为[ag]t时，在ic50处的抗体浓度；n=[ag]/[ag]t2）抗体交叉反应性分析检测抗原hg
2+-itcbe-bsa以5 μg/ml包被酶标板，hg
2+
，zn
2+
，mg
2+
，cu
2+
，ca
2+
，mn
2+
，fe
2+
，cd
2+
，cr
3+
九种金属离子标准品螯合itcbe，以及itcbe分别作为竞争抗原，分别将10种竞争抗原按200 ng/ml倍比稀释，抗体7a1按1:64k稀释，采用常规的间接竞争elisa法进行特异性的鉴定，结果如图8所示。
[0036]
4）抗体灵敏度测定用常规的间接竞争elisa法鉴定其对hg
2+-itcbe的灵敏度，绘制标准竞争曲线，结果如图9a所示，曲线方程y=0.0366+{0.8753/[1+(x/37.426)
0.9067
]}，r2=0.99017，其中ic50 =37.426 ng/ml，在ic10 ~ ic90之间呈现良好的线性关系，线性部分直线方程为y =0.89963-0.26524x，r2=0.97494，结果如图9b所示，线性范围0.00099 ～ 1.024 μg/ml。
[0037]
实施例3 纳米花免疫层析试纸条卡的研制（1）金纳米花工作液的制备准备一个经过酸酐浸泡并洗净高温灭菌的250 ml锥形瓶，加入100 ml双蒸水，用
1m naoh调至ph 7.5左右。搅拌条件下，依次加入750 μl的1wt%氯金酸、500 μl胶体金作为种子、300 μl 1wt%柠檬酸三钠和1 ml新配置的0.03 m的对苯二酚溶液，搅拌至深蓝色，制得金纳米花溶液。接下来利用酶标仪对制备的金纳米花溶液进行扫描，扫描区间为400-900 nm，观察其最大的吸收峰波长（如图10a）。还需将制备好的金纳米花溶液进行扫描电子显微镜（tem）观察金纳米花颗粒大小并计算平均直径（如图10b）。然后将制备好的溶液封口，置于4 ℃冰箱储藏。
[0038]
（2）金纳米花免疫探针的标记1）金纳米花标记最适抗体量的确定首先，取8个酶标孔分别加入200 μl金纳米花工作液，第一孔作为空白对照，第二孔加入1 μl 1.25mg/ml的抗汞离子（hg
2+-itcbe）单克隆抗体，接下来向余下6孔依次加入2 μl、3 μl、4 μl、5 μl、6 μl和7 μl的抗汞离子单克隆抗体，用移液枪混匀，放入37℃恒温培养箱静置30 min。然后每孔加入20 μl 10wt％nacl溶液，混匀后于37℃恒温培养箱继续静置5min，取出后观察金纳米花工作液的颜色变化，通过酶标仪检测每孔590 nm处的吸光度（如图11 a）。结果显示：加入1 μl抗汞离子单克隆抗体时，在od
590 nm处，吸光度能达到最大值，且该孔的溶液颜色与对照组基本无明显变化，说明在该金纳米花工作液体系中加入1 μl1.25 mg/ml的单克隆抗体最稳定。
[0039]
2）金纳米花标记最适ph的确定对标记抗体量进行优化后，还需对工作液标记抗体时的ph进行优化，步骤如下：首先，取8个酶标孔分别加入200 μl金纳米花工作液，向上述金纳米花工作液中加入之前确定的最适抗体量1 μl（1.25 mg/ml），用移液枪轻轻混匀。第一孔作为空白对照，第二孔加入1 μl 0.1 m k2co3溶液，接下来向余下6孔依次加入2 μl、3 μl、4 μl、5 μl、6 μl和7 μl 0.1 m k2co3溶液，混匀后放入37 ℃恒温培养箱静置30 min。然后每孔加入20 μl 10％nacl溶液，混匀后37 ℃继续静置5min，观察金纳米花工作液的颜色变化，通过酶标仪检测每孔od
590 nm处的吸光度（如图11 b）。结果显示：加入1 μl 0.1 m k2co3时，在od 590 nm处，吸光度能达到最大值，且该孔的溶液颜色与对照组基本无明显变化，说明在该纳米花工作液体系中加入1 μl的0.1 m k2co3最稳定。
[0040]
(3）金纳米花标记抗汞离子单克隆抗体取10 ml金纳米花工作液置于已高温灭菌的20 ml细口瓶中，冰浴下，加入60 μl最适k2co3（0.1 m）的量（考虑到在加样或者标记过程中，会出现抗体的损失，所以按照1.2倍的体积量加入最适抗体量），搅拌均匀，随后逐滴加入最适抗体标记量60 μl，继续搅拌1 h，然后按照总体积的1％加入bsa蛋白0.1012 g，冰浴下，继续搅拌30 min，接下来按照总体积的0.5％加入peg20000 0.0506 g，冰浴下，继续搅拌30 min，最后将标记好的溶液封口，置于4℃冰箱平衡过夜。
[0041]
（4）金纳米花快速检测试纸条最适条件的选择1) 探针结合垫与样品垫的处理将未处理的金标垫和样品垫用剪刀剪成宽1.3 cm的长条状，将其置于大培养皿中，用提前配好的封闭液（5% bsa+1% tween-20）淹没，随后转移到37℃恒温培养箱封闭2 h。从培养箱取出后滤去封闭液并继续置于培养箱烘干，烘干后4℃保存。后续使用按照长为1.3 cm，宽为4 mm裁剪。
[0042]
2)试纸条c线最佳稀释度的选择将2 mg/ml的羊抗鼠二抗用0.01 m pbs按照c线的最终浓度稀释，最终稀释为1.33、0.89、0.67、0.53 μg/ml四个浓度，每种浓度各取10 μl在nc膜上进行划线，使用喷金仪划线时，按照0.2 μl/cm的划线速度，重复5次，最终划在c线上的浓度分别为1.33、0.89、0.67、0.53 ng/cm；将划完线的nc膜置于37℃恒温培养箱干燥15 min后裁条，宽度4 mm，经过裁剪后，每张宽4 mm的卡条上羊抗鼠二抗含量分别为0.532、0.356、0.268、0.212 ng。接下来分别向4个组装好的免疫层系试纸条上滴加3 μl的金标探针，在样品垫上缓慢滴加100 μl 0.01 m pbs，置于室温下反应10 min，观察试纸条c线颜色深浅，最后通过观察，选择浓度为0.53 ng/cm（即每张剪裁后宽4 mm的卡条上羊抗鼠二抗的含量为0.212ng）为最佳c线划线浓度 (图12 a)。
[0043]
3)试纸条t线最佳稀释度的选择将完全抗原hg
2+-itcbe-bsa用0.01 m pbs按照t线最终浓度稀释，最终稀释为0.21、0.11、0.071、0.053、0.043 μg/ml五个浓度，每种浓度各取10 μl在nc膜上进行划线，使用喷金仪划线时，按照0.2 μl/cm的划线速度，重复划五次，最终划在t线上的浓度分别为0.21、0.11、0.071、0.053、0.043 ng/cm；将划完线的nc膜置于37 ℃恒温培养箱干燥15 min后裁条，宽度4 mm；经过裁剪后，每张宽4 mm的卡条上抗原量分别为0.084、0.044、0.0284、0.0212、0.0172 ng。接下来分别向5个组装好的免疫层系试纸条上滴加3 μl的金标探针，在样品垫上缓慢滴加100 μl 0.01 m pbs，置于室温下反应10 min，观察试纸条t线颜色深浅，最后通过观察，选择浓度为0.043 ng/cm（即每张剪裁后宽4 mm的卡条上完全抗原hg
2+-itcbe-bsa的含量为0.0172 ng）为最佳t线划线浓度（图12 b）。
[0044]
（5）金纳米花快速检测试纸条测试1）金纳米花层析试纸条特异性测定根据上述优化的最佳c线和最佳t线稀释比例在nc膜上同时划线，将划线完的nc膜置于37℃恒温培养箱干燥15 min后裁条。接下来在探针结合垫上滴加3μl免疫探针量并组装好试纸条。用0.01 m pbs将hg
2+-itcbe、ca
2+-itcbe、mg
2+-itcbe、mn
2+-itcbe、cu
2+-itcbe、fe
2+-itcbe和zn
2+-itcbe稀释至终浓度为200 ng/ml。各取100 μl滴加在试纸条样品垫上，置于室温下反应10 min，观察试纸条t线消失情况，判断试纸条的特异性。结果显示：该试纸条只对加入的hg
2+-itcbe复合物有竞争反应，t线消失，而对其他离子螯合物没有明显的交叉反应性，说明该试纸条特异性良好（图13）。
[0045]
2）金纳米花层析试纸条灵敏度测定根据上述优化的最佳c线和最佳t线稀释比例在nc膜上同时划线，将划线完的nc膜置于37 ℃恒温培养箱干燥15 min后裁条；接下来在探针结合垫上滴加3 μl免疫探针量并组装好试纸条。用0.01 m pbs将hg
2+-itcbe稀释至终浓为50 ng/ml、25 ng/ml、12.5 ng/ml、6.25 ng/ml、3.125 ng/ml、1.56 ng/ml、0.78 ng/ml、0.39 ng/ml和0 ng/ml。随后各取100 μl滴加在试纸条样品垫上，置于室温下反应10 min，观察试纸条t线消失情况，得出试纸条的检测范围。结果显示:当加入的hg
2+-itcbe的量为50 ng/ml的时候，可以观察到t线明显的消失，说明金标抗体的表位已经完全被样品中的半抗原hg
2+-itcbe所结合，随着浓度的对倍稀释，可以观察到t线颜色逐渐变深，在可视条件下，浓度为0.78 ng/ml的时候，t线与对照卡条颜色存在明显变化，在免疫读卡仪检测显示浓度为0.39 ng/ml的时候，与对照组t线相
比，抑制率能达到72%。因此，该免疫层系试纸条目测检测限为1.56 ng/ml，免疫读卡仪所能检测的检测限为0.39 ng/ml（图14）。（6）实际样品检测根据上述优化的最佳c线和最佳t线稀释浓度在nc膜上同时划线，将划线完的nc膜置于37 ℃恒温培养箱干燥15 min后裁条。在探针结合垫上滴加3 μl免疫探针量并组装好试纸条。从超市随机购买四种主要粮食作物作为检测对象，用研钵研磨成粉末状，过0.5 mm实验样品筛，收集过筛粉末。分别取过筛的大米、小麦、地瓜、玉米各1 mg，置于4个2 ml离心管中，继续向4个离心管中各加入1 ml去离子水，另外，取1 ml 200 ng/ml的二价汞离子作为对照，并分别向五种溶液中加入过量（400 ng）的itcbe，37℃摇床震荡3 h。然后1000 r/min离心20 min，分别收集上清，经0.22 μm滤膜过滤后取滤液待用。随后取100 μl大米、小麦、地瓜、玉米滤液分别滴加在试纸条样品垫上，置于室温下反应10 min，观察试纸条t线消失情况。结果显示：五种样品与对照组（点样为pbs缓冲液）相比，大米、小麦、地瓜、玉米四种样品t线颜色没有明显的变化，说明该样品中未含有汞离子残留；同时，在加标量为200 ng汞离子的样品中，与对照组相比，试纸条t线明显消失（图15），该结果与原子荧光光谱法检测结果一致（表1），说明该试纸条稳定性很好，能够应用于实际样品的现场检测。对检测粮食中重金属汞离子的残留具有现实意义。
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表1 实际样品检测注：原子荧光光谱分析法最低检测限为0.003 μg/ml以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

技术特征：
1.一种检测重金属汞离子的纳米花免疫层析试纸条，其特征在于：所述纳米花免疫层析试纸条包括以下组分：塑料外壳、样品垫、免疫探针结合垫、硝酸纤维膜和吸水垫；所述免疫探针结合垫滴加有抗汞离子单克隆抗体标记的金纳米免疫探针；所述抗汞离子单克隆抗体是抗hg
2+-itcbe半抗原鼠源杂交瘤细胞株7a1分泌的单克隆抗体，鼠源杂交瘤细胞株7a1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期为2021年11月23日，保藏号为cgmcc no.23879。2.权利要求1所述一种检测重金属汞离子的纳米花免疫层析试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）金纳米花溶液的制备：在经过王水浸泡并洗净高温灭菌的250 ml锥形瓶中加入100 ml双蒸水，用1m naoh调至ph 7.5；搅拌条件下，依次加入750 μl的1wt%氯金酸、500 μl胶体金作为种子、300 μl 1wt%柠檬酸三钠和1 ml新配置的0.03 m的对苯二酚溶液，继续搅拌至稳定的蓝色，得金纳米花溶液；（2）免疫探针的制备：取10 ml金纳米花溶液置于已高温灭菌的细口瓶中，冰浴下，加入60 μl 0.1 m k2co3，搅拌均匀，随后逐滴加入60 μl 1.25 mg/ml的抗汞离子单克隆抗体，继续搅拌1 h，然后按照总体积的1％加入bsa，冰浴下，继续搅拌30 min，接下来按照总体积的0.5％加入peg20000，冰浴下，继续搅拌30 min，最后将标记好的溶液封口，置于4 ℃冰箱平衡过夜，获得抗汞离子单克隆抗体标记的金纳米免疫探针；（3）免疫探针结合垫与样品垫的预处理：将未处理的免疫探针结合垫和样品垫用剪刀剪成宽1.3 cm的长条状，将其置于大培养皿中，用提前配好的封闭液淹没，随后转移到37 ℃恒温培养箱封闭2 h，从培养箱取出后滤去封闭液并继续置于培养箱烘干，烘干后4 ℃保存；后续使用按照长为1.3 cm，宽为4 mm裁剪；所述封闭液的组成为：5wt% bsa+1vol % tween-20；（4）nc膜划线：取羊抗鼠二抗在nc膜上进行划线，最终划在c线上的浓度为0.53 ng/cm，经过裁剪后，每张宽4 mm的卡条上划线羊抗鼠二抗的含量为0.212 ng；取完全抗原hg
2+-itcbe-bsa在nc膜上划线，最终划在t线上的浓度为0.043 ng/cm，经过裁剪后，每张宽4 mm的卡条上完全抗原hg
2+-itcbe-bsa的含量为0.0172 ng，即为t线；在同一张nc膜上，c、t线之间距离为0.5 cm；（5） 免疫探针结合垫的制备：在预处理后的免疫探针结合垫上滴加3 μl步骤（2）制备的抗汞离子单克隆抗体标记的金纳米免疫探针；（6）免疫层析试纸条的组装：将步骤（4）划线后的nc膜、步骤（5）制备的免疫探针结合垫、步骤（3）预处理的样品垫、吸水垫，依次组装在底板上；其中免疫探针结合垫和样品垫重叠交错粘贴，同端相隔2 mm，吸水垫与nc膜首尾重叠2 mm，盖上塑料外壳盖子，干燥封装，置4 ℃保存。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述抗汞离子单克隆抗体的制备方法为：将处于对数生长期的鼠源杂交瘤细胞株7a1按1
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6 cell/只注射到石蜡致敏过的9周龄balb/c雌鼠腹腔，待小鼠腹部膨大且有紧张感时抽取腹水，经分离纯化获得抗hg
2+-itcbe单克隆抗体。4.权利要求1所述一种检测重金属汞离子的纳米花免疫层析试纸条在检测重金属汞离子中的应用。

技术总结
本发明提供一种检测重金属汞离子的纳米花免疫层析试纸条，属于重金属快速检测技术领域。所述纳米花免疫层析试纸条包括以下组分：塑料外壳、样品垫、免疫探针结合垫、硝酸纤维膜和吸水垫；所述免疫探针结合垫滴加有抗汞离子单克隆抗体标记的金纳米免疫探针；所述抗汞离子单克隆抗体是抗Hg


技术研发人员：汪世华 董明科 凌素美 王荣智 贾坤志 林晶晶 徐杨 徐爱迪 万梦浩
受保护的技术使用者：福建农林大学
技术研发日：2022.03.18
技术公布日：2022/5/25