与菜花颜色相关的分子标记的引物及鉴别菜花颜色的方法与流程

1.本发明属于分子标记技术领域，具体涉及一种与菜花颜色相关的分子标记的引物及鉴别菜花颜色的方法。


背景技术：

2.分子标记基于生物大分子的多态性提出的一种遗传标记技术。随着分子标记技术的出现，实现了植物育种的间接选择，显著提高了育种的有效性和遗传的准确性。因此，分子标记技术在遗传育种领域的地位愈发提高。分子标记技术包括两种类型，分别是同工酶标记和分子标记(即dna标记)。其中，由于翻译后修饰作用、发育阶段性、组织特异性和多态性位点少等特殊性，使得同工酶标记鉴定技术在遗传分析过程中实现较为困难，从而兴起了分子标记技术的研究。分子标记通过电泳实验结合一定的检测方法反映出目的基因组中特殊的变异特征dna片段。分子标记技术主要包括限制性片段长度多态性技术、随机扩增多态性dna技术、pcr与酶切结合标记技术等。这类经典的分子标记技术，存在一些实验步骤复杂，重复性低，且受到探针因素等的限制，使得dna模板要求高且需求量大，导致最终的多态性检出效率低。
3.本发明采用的特定引物扩增标记技术避免了上述分子标记的不足，具有稳定性高、高效便捷和取材少等特点，成功鉴别菜花颜色。这一结果为彩色菜花多态性研究提供了有效方法和手段。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种与菜花颜色相关的分子标记的引物及鉴别菜花颜色的方法，该方法可实现快速辅助鉴定菜花颜色，相对传统田间试验效率高，结果可靠。
5.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种与菜花颜色相关的分子标记的引物，所述分子标记引物包括正向引物fam、正向引物hex和反向引物c，所述正向引物fam的核苷酸序列如seq id no:1所示，所述正向引物hex的核苷酸序列如seq id no:2所示，所述反向引物c的核苷酸序列如seq id no:3所示。
6.本发明还提供了上述的与菜花颜色相关的分子标记的引物鉴别菜花颜色的方法，该方法为：
7.s1、提取菜花叶片基因组dna；
8.s2、以s1中所述菜花叶片基因组dna为模板进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；所述pcr扩增的反应体系为：s1中所述菜花叶片基因组dna 25ng、kasp 2
×
master mix 2.5μl、引物混合物0.07μl，无菌水补至5μl；
9.所述引物混合物的制备方法为：正向引物fam 12μl、正向引物hex12μl和反向引物c12μl、ddh2o 46μl，混合后取0.07μl；
10.所述pcr扩增的反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性20s，61℃退火45s，每个
循环延伸温度降低0.6℃，进行10个循环；95℃变性20s，55℃退火45s，进行30次循环；25℃终延伸∞(forever)，反应终止；
11.s3、对s2中得到的pcr扩增产物进行分析，在c07号染色体基因组位置区间50387046bp～50387048bp存在等位基因agt插入的为白菜花，在c07号染色体基因组位置区间50387046bp～50387048bp等位基因agt缺失的为黄菜花。
12.本发明与现有技术相比具有以下优点：
13.本发明利用分子标记的方法辅助筛选菜花颜色，在c07号染色体基因组位置区间50387046bp～50387048bp存在等位基因位点agt，等位基因agt插入的为白菜花，缺失的为黄菜花，可实现快速辅助鉴定菜花颜色，相对传统田间试验效率高，结果可靠。
14.下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
附图说明
15.图1是本发明实施例1的kasp检测分型图。
具体实施方式
16.实施例1
17.分子标记的确定：
18.1.1 dna提取
19.采用常规的ctab法对109份菜花叶片样品进行dna提取。通过微量分光光度对dna样品进行质检和dna浓度测定，同时通过琼脂糖凝胶电泳检测dna的完整性。
20.1.2 bsa混池构建和基因组重测序
21.对黄、白每个颜色的菜花，分别取30个个体，用nanodrop对提取的dna进行浓度测定，对30个个体的dna等量混合；使用ultra
tm dna library prep kit for (neb,usa)试剂盒构建paired-end测序文库，文库插入片段长度350bp。利用illumina hiseq测序平台进行高通量测序，序列读长150bp；使用fastqc对原始数据进行质控，包括对原始序列进行去接头、删除低质量的reads；最终，生成每个颜色的花菜的clean数据。
22.1.3变异位点检测
23.利用bwa软件将经过质控的reads与botrytis型菜花(brassica oleracea var.botrytis cv.korso)的参考基因组序列进行比对(基因组序列下载自：https://doi.org/10.6084/m9.figshare.c.5392466)；利用picard软件去除测序过程中pcr产生的重复；使用gatk软件检测出不同颜色菜花与参考基因组相比所具有的snp变异及indel变异，并分别用gatk的variant filtration模块和vcftools软件对变异结果质控过滤，去掉低质量变异结果，并生成最终的vcf文件。
24.1.4 or(黄色突变体)基因内部的变异位点
25.根据1.3产生的vcf文件，抽取or两个基因内部及上下游1kb区间内所检测出的所有snp和indel变异位点。
26.1.5 bsa关联分析
27.选择具有极端表型的个体进行混样，通过比较不同极端混样池之间的多态性并结
合表型进行目标基因的定位。具体来讲，主要是寻找混池之间基因型频率的显著差异，用δ(snp-index)统计。标记snp与性状关联度越强，δ(snp-index)越接近于1。根据vcf文件中检测出的变异位点，利用qtl-seq方法中的qtlplot软件分别计算黄、白色两个性状混池样本的snp-index，并且分别计算黄色与白色极端性状混池之间的频率差值，即δ(snp-index)。挑出δ(snp-index)超过99％阈值且值接近于1所对应的snp区间。
28.1.6 snp/indel位点引物设计和合成
29.根据步骤1.4和1.5关联分析得到的snp或者indel位点，设计引物。具体步骤为，获取snp/indel位点侧翼的基因组序列，序列长度不低于100bp。根据序列分别设计了正向引物fam、正向引物hex和反向引物c。两个正向引物的3’端最后一个碱基分别对应snp位点的两个基因型，5’端分别带有fam或hex荧光基团的接头序列(正向引物引物带的是fam荧光基团的接头序列，反向引物带的是hex荧光基团的接头序列)。与菜花颜色相关的分子标记的引物中正向引物fam的核苷酸序列如seq id no:1所示，正向引物hex的核苷酸序列如seq id no:2所示，反向引物c的核苷酸序列如seq id no:3所示。
30.1.7 snp分型实验步骤
31.1.7.1 pcr扩增程序设定和扩增
32.将菜花叶片基因组dna为模板进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；所述pcr扩增的反应体系为：s1中所述菜花叶片基因组dna 25ng、kasp2
×
master mix 2.5μl、引物混合物0.07μl，无菌水补至5μl；
33.所述引物混合物的制备方法为：正向引物fam 12μl、正向引物hex12μl和反向引物c12μl、ddh2o 46μl，混合后取0.07μl；
34.kasp 2
×
mix购于艾吉析科技(上海)有限公司；
35.pcr扩增的反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性20s，61℃退火45s，每个循环延伸温度降低0.6℃，进行10个循环；95℃变性20s，55℃退火45s，进行30次循环；25℃终延伸forever，反应终止。
36.1.7.2荧光值读取
37.pcr扩增循环结束后，在35℃的环境下，利用荧光定量pcr仪读取荧光值。kasp基因分型系统使用荧光团fam和hex来区分两个等基因位点。rox用于校正孔与孔之间由于反应体积误差导致的信号差异。
38.1.7.3数据分析和基因型数据获取
39.我们利taqman genotyper software软件对步骤1.7.2的结果数据进行分析。将hex和fam数据分别绘制在x轴和y轴上。根据相对荧光值，对样品进行聚类分簇，进一步根据样品簇确定基因型。
40.1.7.4候选snp/indel位点
41.黄菜花特异的等位基因位点是指某一个多态基因位点对应的一个基因型只分布在黄菜花样品中，在白菜花中分布为不同的基因型。根据这一标准和bas混池测序结果，在c07号染色体上供筛选获取了1个黄菜花特异的等位基因位点。同时分析了or基因上的多态位点，在or基因上获得了1个在2种不同材料之间具有分布差异多态性的位点。
42.对于在材料之间分布差异明显的snp位点进行进一步的序列分析和kasp预实验，供选取1个snp位点进行菜花群体实验研究，具体位点信息见表1。
43.表1菜花差异snp/indel位点
[0044][0045]
1.8 snp/indel kasp分型结果
[0046]
利用表1中的snp位点，分别对109份菜花样品进行基因分型，进一步统计各个snp位点对应基因型在不同颜色菜花中的分布频率。根据基因型分布频率推断snp位点对菜花颜色鉴定的特异性。snp位点基因分型结果和分布频率如下：
[0047]
07-095为插入缺失型多态位点，等位基因为agt 3碱基的插入或缺失。从图1的kasp分型图来看，所有样品都为del/del基因型或不含有该等位基因位点(noamp)。从菜花颜色上来看，del/del基因型主要分布在白菜花中。黄菜花中大部分样品无扩增，暗示部分黄菜花样品中缺失该位点或在这些样品中该位点附近存在其他多态位点，导致kasp引物检测失败。
[0048]
表2 y07-095多态位点在不同颜色菜花中的分布
[0049][0050]
注：表中ins/ins为纯合，ins/del为杂合，del/del为缺失，noamp为没有扩增。
[0051]
本实施例中c07染色体的第50387046bp～50387048bp等位基因agt前后的核苷酸序列前82bp和后144bp碱基信息如下：ttttttacataaaatttttaaaacatcactgaaacaatttttgttttgaaacaccatttaaagtgatgccgatgggagtagt[agt/-]aatacgttagagcatgattatccggggtccttagtgggtttcttagtgcgtggacccccacaaaacccttaaggatcggttacaaaaactactaattaagaaccgattttagtgagtttcttacactgttcgcgggacccactg；
[0052]
对pcr扩增产物进行分析，在c07号染色体基因组位置区间50387046bp～50387048bp存在等位基因agt插入的为白菜花，在c07号染色体基因组位置区间50387046bp～50387048bp等位基因agt缺失的为黄菜花。
[0053]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。

技术特征：
1.一种与菜花颜色相关的分子标记的引物，其特征在于，所述分子标记引物包括正向引物fam、正向引物hex和反向引物c，所述正向引物fam的核苷酸序列如seq id no:1所示，所述正向引物hex的核苷酸序列如seq id no:2所示，所述反向引物c的核苷酸序列如seq id no:3所示。2.一种如权利要求1所述的与菜花颜色相关的分子标记的引物鉴别菜花颜色的方法，其特征在于，该方法为：s1、提取菜花叶片基因组dna；s2、以s1中所述菜花叶片基因组dna为模板进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；所述pcr扩增的反应体系为：s1中所述菜花叶片基因组dna 25ng、kasp 2
×
master mix 2.5μl、引物混合物0.07μl，无菌水补至5μl；所述引物混合物的制备方法为：正向引物fam 12μl、正向引物hex12μl和反向引物c12μl、ddh2o 46μl，混合后取0.07μl；所述pcr扩增的反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性20s，61℃退火45s，每个循环延伸温度降低0.6℃，进行10个循环；95℃变性20s，55℃退火45s，进行30次循环；25℃终延伸forever，反应终止；s3、对s2中得到的pcr扩增产物进行分析，在c07号染色体基因组位置区间50387046bp～50387048bp存在等位基因agt插入的为白菜花，在c07号染色体基因组位置区间50387046bp～50387048bp等位基因agt缺失的为黄菜花。

技术总结
本发明提供了一种与菜花颜色相关的分子标记的引物，包括正向引物FAM、正向引物HEX和反向引物C，引物FAM的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，引物HEX的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述反向引物C的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。还提供了鉴别菜花颜色的方法，该方法为：提取菜花叶片基因组DNA，以菜花叶片基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，对PCR扩增产物进行分析，在C07号染色体基因组位置区间50387046bp～50387048bp存在等位基因AGT插入的为白菜花，等位基因AGT缺失的为黄菜花。本发明可实现快速辅助鉴定菜花颜色，相对传统田间试验效率高，结果可靠。结果可靠。结果可靠。


技术研发人员：罗枫 牛国保 高文政 王丽杰
受保护的技术使用者：天津科润农业科技股份有限公司
技术研发日：2022.03.17
技术公布日：2022/5/25