用于鉴定“安源1号”刺参群体的引物组合及其应用

    专利查询2022-12-27  80



    1.本发明属于分子生物学领域,具体涉及鉴定“安源1号”刺参群体的分子鉴定标记引物组合及应用。


    背景技术:

    2.刺参是我国传统高端保健食品,在我国辽宁、山东广泛养殖,是我国海水养殖的支柱产业,年产量保持在20万吨左右,产业链长,产品多元化,年产值达到300-400亿元。截止2021年,经全国水产原种与良种委员会审定,农业农村部公告,刺参“安源1号”(gs-01-014-2017)获批国审水产新品种并推广,刺参“安源1号”是以棘刺数数量超过50个且生长速度快的“水院1号”为亲本,以棘刺数量、体重和出肉率为选育目标,经过连续4代选育而成。在相同的养殖条件下,与普通刺参相比,“安源1号”刺参体表颜色呈褐色或黑褐色,棘刺数量多且长度较长,生长速率快,加工出成率高,目前已在山东、辽宁、福建沿海广泛推广养殖,经济效益显著,市场上已有冒充“安源1号”海参幼苗,扰乱市场,开发可用于鉴别“安源1号”刺参的分子标记不但可有效解决纠纷,而且对规范海参市场,有效开展刺参种质资源保护具有重要意义。
    3.单核苷酸多态性(snps)标记作为第三代分子标记,为共显性标记,具有较高的多态性,可通过测序技术快速检测。本研究利用重测序数据进行“安源1号”特有snp位点挖掘,结合kasp分型技术设计可用于鉴别“安源1号”刺参的引物组合,为刺参新品种“安源1号”亲权鉴定和种质资源保护提供技术支持。


    技术实现要素:

    4.本发明要解决的技术问题在于基于重测序技术和kasp分型技术提供一共可用于鉴别“安源1号”刺参群体的snp标记的引物,应用此引物可以成功鉴别“安源1号”刺参群体和个体。
    5.为解决上述技术问题本发明采用如下技术方案:
    6.一种用于鉴定“安源1号”刺参群体的引物组合,所述引物组合见表1:
    7.表1用于鉴定“安源1号”刺参的snp标记引物组合
    8.9.本发明提供利用上述3组引物用于鉴定刺参新品种“安源1号”群体的方法,所述方法具体如下:
    10.采用sds法提取刺参样品的dna,以kasp组合标记进行待测样品snp基因分型,检测“安源1号”刺参群体特有标记位点;判定标准为:检测个体具有全部3个上述引物标记位点,判定为“安源1号”刺参个体。群体样品大于等于30只,检测个体具有全部3个上述引物标记位点为阳性检出,群体中阳性检出率达到80%及以上,判定“安源1号”刺参群体。
    11.本发明与现有技术相比的有益效果:
    12.本发明利用重测序数据进行刺参“安源1号”群体特有snp位点挖掘,结合kasp分型技术设计可用于鉴别刺参“安源1号”群体的引物组合,为刺参“安源1号”亲权鉴定和种质资源保护提供技术支持。
    附图说明
    13.图1为使用本发明引物鉴别待检刺参群体的分型图(显示部分结果)。
    具体实施方式:
    14.下面通过实施例来对本发明的技术方案做进一步解释,但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。
    15.实施例1
    16.1“安源1号”刺参特异性snp标记获取
    17.1.1样本选择
    18.采集刺参新品种“安源1号”、山东烟台、山东牟平、山东长岛县、山东威海、辽宁大连、辽宁庄河7个有代表性的刺参养殖、野生群体共256只。
    19.1.2提取dna
    20.采用sds法进行基因组总dna的提取。试剂盒选用tiangen amp marine animals dna kit(tiangen,中国北京市),提取刺参的肌肉组织,以1%的琼脂糖凝胶电泳初步检测核酸的纯度和完整度,合格的dna样品主带清晰,无降解或轻度降解。经检验合格的刺参dna样品质量浓度调至约100ng/ul保存。
    21.1.3基因组重测序
    22.检测合格的样本采用bioruptor pico超声破碎仪随机打断成350bp的片段,然后利用基因组dna文库构建试剂盒进行文库制备。按照以下步骤进行文库构建:
    23.(1)通过bionuptor pico超声破碎仪将基因组dna的打断;
    24.(2)dna片段末端补平:将基因组末端修复成平末端,并在5'末端加磷酸基团;
    25.(3)dna片段3’末端加'a';
    26.(4)dna末端连接adaptor:通过ta连接将adaptor添加到dna片段两端;
    27.(5)pcr扩增:将添加完接头的连接产物进行pcr扩增形成可进行测序的文库。
    28.构建完成的文库通过qubit文库浓度定量、琼脂糖电泳检测文库大小特征和qpcr对文库的有效浓度进行准确定量3种方式进行文库质检,质检合格的文库进行浓度均一化,并在illumina hiseq2500测序平台上进行高通量测序。
    29.1.4 snp获取与质控
    30.在得到clean reads后,采用bwa软件将clean reads与参考基因组(https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/gca/002/754/855/gca_002754855.1_asm275485v1/)比对。使用软件gatk(v3.8)对样本进行群体snp检测,并对获得的结果进行过滤,过滤标准为
    “‑‑
    minq 200
    ‑‑
    mindp 3
    ‑‑
    min-meandp 3
    ‑‑
    max-missing 0.8
    ‑‑
    maf 0.05”。
    31.1.5关联分型
    32.使用plink软件进行基因组关联分析,
    [0033]“安源1号”刺参和其他种群的刺参分为两个亚群。
    [0034]
    采用logistic模型进行关联分析,获得每个snp对应的显著性p值,使用bonferroni对获得的p进行校正,最终获得“安源1号”刺参显著关联snp位点。
    [0035]
    1.6 kasp引物设计
    [0036]
    根据上述“安源1号”显著snp位点设计出42对pcr 3’末端特异性扩增引物,设计软件为primer 5,每个序列需要3条引物,即两条特异的上游引物和一条通用的下游引物。引物设计原则为:(1)引物自身无发夹结构,上下游引物之间不会形成引物二聚体;(2)引物的gc含量在40~60%,tm值在55~65℃之间。
    [0037]
    2 kasp标记验证
    [0038]
    2.1验证群体dna提取和标记检测
    [0039]
    随机选“安源1号”刺参,其他群体刺参各15只,以sds法提取dna,在douglas array taper platform进行标记检测,在soellex高通量pcr水浴环境中进行荧光定量pcr反应,试剂选用tb greentm premix ex taqtmⅱ,配制出20μl混合体系以“变性—退火延伸”的两步法反应程序进行特异性扩增。
    [0040]
    2.2 kasp标记分型
    [0041]
    利用araya荧光阅读仪读取到fam和vic两种荧光基团的信号,将结果导入数据库。
    [0042]
    在douglas scientific dashboard按照分型明确、ntc(无样品阴性对照)、无特异性扩增的原则进行样品snp分型。利用snp viewer基因型读取软件对分型结果进行分析,kasp标记在样本中读取到杂合基因型即为分型成功。在分型图中,x:x代表纯合型,包括a:a、t:t、c:c、g:g、-:-(缺失)五种类型,x:y代表杂合型,包括a:g、c:t、a:-(部分缺失)三种类型,?代表无信号或信号较弱,uncallable代表有信号但无明确分型。
    [0043]
    从42个kasp标记中筛选出3个标记,筛选条件是在“安源1号”群体检出率达到100%,同时在其他群体中不出现,3个kasp标记所在的序列见表1。
    [0044]
    2.3“安源1号”刺参鉴定标准与应用
    [0045]
    判定标准为:采用sds法提取刺参样品的dna,以kasp组合标记进行待测样品snp基因分型,检测“安源1号”刺参群体特有标记位点;判定标准为:检测个体具有全部3个上述引物标记位点,判定为“安源1号”刺参个体。群体样品大于等于30只,检测个体具有全部3个上述引物标记位点为阳性检出,群体中阳性检出率达到80%及以上,判定“安源1号”刺参群体。
    [0046]
    判定标准设置说明:基于前期调研显示,刺参池塘、底播养殖过程中极易出现非有意的个体、群体混杂现象,设置80%的阳性检出率作为“安源1号”群体判别指标较客观。
    [0047]
    应用:
    [0048]
    1.对已知种质的30只刺参(5只“安源1号”刺参,25只为不同地域普通刺参)进行鉴定,结果显示:5只“安源1号”刺参个体全部具有3个引物标记;25只不同地域普通刺参3个标记全部检出的为0,(具2个标记的4只,1个标记的8只),判定为非“安源1号”刺参。检出准确率为100%。
    [0049]
    2.检测4个群体(1个群体为购买“安源1号”刺参苗种的池塘养殖群体,32只;另4个群体为大连、山东随机抽取池塘采样群体,每个池塘30只,共120只),snpviewer检测结果显示(显示部分结果,见图1):“安源1号”苗种养殖群体共32只,具3个标记的29只,“安源1号”群体阳性检出率为90.63%,判定为“安源1号”刺参群体。其他4个群体的中,3个标记全部检出的为0,(具2个标记的17只,1个标记的32只),判定为非“安源1号”刺参群体。

    技术特征:
    1.一种用于鉴定“安源1号”刺参群体的引物组合,其特征在于所述引物组合见下表2.利用权利要求1所述引物组合来进行鉴定“安源1号”刺参群体的方法,其特征在于所述方法具体如下:采用sds法提取刺参样品的dna,以所述引物组合进行待测样品snp基因分型,检测“安源1号”刺参群体特有标记位点;判定标准为:检测个体具有全部3个上述引物标记位点,判定为“安源1号”刺参个体;群体样品大于等于30只,检测个体具有全部3个上述引物标记位点为阳性检出,群体中阳性检出率达到80%及以上,判定“安源1号”刺参群体。

    技术总结
    本发明涉及用于鉴定“安源1号”刺参群体的引物组合及其应用,属于分子生物学领域,所述的引物组合如表1所示。本发明还提供利用上述引物组合来进行鉴定“安源1号”刺参群体的方法,采用SDS法提取刺参样品的DNA,以所述引物组合进行待测样品SNP基因分型,检测“安源1号”刺参群体特有标记位点;判定标准为:检测个体具有全部3个上述引物标记位点,判定为“安源1号”刺参个体;群体样品大于等于30只,检测个体具有全部3个上述引物标记位点为阳性检出,群体中阳性检出率达到80%及以上,判定“安源1号”刺参群体。刺参群体。刺参群体。


    技术研发人员:丁君 常亚青 国超 王荦 宋坚
    受保护的技术使用者:大连海洋大学
    技术研发日:2022.03.18
    技术公布日:2022/5/25
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