用于鉴定“安源1号”刺参群体的引物组合及其应用

1.本发明属于分子生物学领域，具体涉及鉴定“安源1号”刺参群体的分子鉴定标记引物组合及应用。


背景技术：

2.刺参是我国传统高端保健食品，在我国辽宁、山东广泛养殖，是我国海水养殖的支柱产业，年产量保持在20万吨左右，产业链长，产品多元化，年产值达到300-400亿元。截止2021年，经全国水产原种与良种委员会审定，农业农村部公告，刺参“安源1号”(gs-01-014-2017)获批国审水产新品种并推广，刺参“安源1号”是以棘刺数数量超过50个且生长速度快的“水院1号”为亲本，以棘刺数量、体重和出肉率为选育目标，经过连续4代选育而成。在相同的养殖条件下，与普通刺参相比，“安源1号”刺参体表颜色呈褐色或黑褐色，棘刺数量多且长度较长，生长速率快，加工出成率高，目前已在山东、辽宁、福建沿海广泛推广养殖，经济效益显著，市场上已有冒充“安源1号”海参幼苗，扰乱市场，开发可用于鉴别“安源1号”刺参的分子标记不但可有效解决纠纷，而且对规范海参市场，有效开展刺参种质资源保护具有重要意义。
3.单核苷酸多态性(snps)标记作为第三代分子标记，为共显性标记，具有较高的多态性，可通过测序技术快速检测。本研究利用重测序数据进行“安源1号”特有snp位点挖掘，结合kasp分型技术设计可用于鉴别“安源1号”刺参的引物组合，为刺参新品种“安源1号”亲权鉴定和种质资源保护提供技术支持。


技术实现要素：

4.本发明要解决的技术问题在于基于重测序技术和kasp分型技术提供一共可用于鉴别“安源1号”刺参群体的snp标记的引物，应用此引物可以成功鉴别“安源1号”刺参群体和个体。
5.为解决上述技术问题本发明采用如下技术方案：
6.一种用于鉴定“安源1号”刺参群体的引物组合，所述引物组合见表1：
7.表1用于鉴定“安源1号”刺参的snp标记引物组合
8.9.本发明提供利用上述3组引物用于鉴定刺参新品种“安源1号”群体的方法，所述方法具体如下：
10.采用sds法提取刺参样品的dna，以kasp组合标记进行待测样品snp基因分型，检测“安源1号”刺参群体特有标记位点；判定标准为：检测个体具有全部3个上述引物标记位点，判定为“安源1号”刺参个体。群体样品大于等于30只，检测个体具有全部3个上述引物标记位点为阳性检出，群体中阳性检出率达到80％及以上，判定“安源1号”刺参群体。
11.本发明与现有技术相比的有益效果：
12.本发明利用重测序数据进行刺参“安源1号”群体特有snp位点挖掘，结合kasp分型技术设计可用于鉴别刺参“安源1号”群体的引物组合，为刺参“安源1号”亲权鉴定和种质资源保护提供技术支持。
附图说明
13.图1为使用本发明引物鉴别待检刺参群体的分型图(显示部分结果)。
具体实施方式：
14.下面通过实施例来对本发明的技术方案做进一步解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。
15.实施例1
16.1“安源1号”刺参特异性snp标记获取
17.1.1样本选择
18.采集刺参新品种“安源1号”、山东烟台、山东牟平、山东长岛县、山东威海、辽宁大连、辽宁庄河7个有代表性的刺参养殖、野生群体共256只。
19.1.2提取dna
20.采用sds法进行基因组总dna的提取。试剂盒选用tiangen amp marine animals dna kit(tiangen，中国北京市)，提取刺参的肌肉组织，以1％的琼脂糖凝胶电泳初步检测核酸的纯度和完整度，合格的dna样品主带清晰，无降解或轻度降解。经检验合格的刺参dna样品质量浓度调至约100ng/ul保存。
21.1.3基因组重测序
22.检测合格的样本采用bioruptor pico超声破碎仪随机打断成350bp的片段，然后利用基因组dna文库构建试剂盒进行文库制备。按照以下步骤进行文库构建：
23.(1)通过bionuptor pico超声破碎仪将基因组dna的打断；
24.(2)dna片段末端补平:将基因组末端修复成平末端，并在5'末端加磷酸基团；
25.(3)dna片段3’末端加'a'；
26.(4)dna末端连接adaptor:通过ta连接将adaptor添加到dna片段两端；
27.(5)pcr扩增:将添加完接头的连接产物进行pcr扩增形成可进行测序的文库。
28.构建完成的文库通过qubit文库浓度定量、琼脂糖电泳检测文库大小特征和qpcr对文库的有效浓度进行准确定量3种方式进行文库质检，质检合格的文库进行浓度均一化，并在illumina hiseq2500测序平台上进行高通量测序。
29.1.4 snp获取与质控
30.在得到clean reads后，采用bwa软件将clean reads与参考基因组(https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/all/gca/002/754/855/gca_002754855.1_asm275485v1/)比对。使用软件gatk(v3.8)对样本进行群体snp检测，并对获得的结果进行过滤，过滤标准为
“‑‑
minq 200
‑‑
mindp 3
‑‑
min-meandp 3
‑‑
max-missing 0.8
‑‑
maf 0.05”。
31.1.5关联分型
32.使用plink软件进行基因组关联分析，
[0033]“安源1号”刺参和其他种群的刺参分为两个亚群。
[0034]
采用logistic模型进行关联分析，获得每个snp对应的显著性p值，使用bonferroni对获得的p进行校正，最终获得“安源1号”刺参显著关联snp位点。
[0035]
1.6 kasp引物设计
[0036]
根据上述“安源1号”显著snp位点设计出42对pcr 3’末端特异性扩增引物，设计软件为primer 5，每个序列需要3条引物，即两条特异的上游引物和一条通用的下游引物。引物设计原则为：(1)引物自身无发夹结构，上下游引物之间不会形成引物二聚体；(2)引物的gc含量在40～60％，tm值在55～65℃之间。
[0037]
2 kasp标记验证
[0038]
2.1验证群体dna提取和标记检测
[0039]
随机选“安源1号”刺参，其他群体刺参各15只，以sds法提取dna，在douglas array taper platform进行标记检测，在soellex高通量pcr水浴环境中进行荧光定量pcr反应，试剂选用tb greentm premix ex taqtmⅱ,配制出20μl混合体系以“变性—退火延伸”的两步法反应程序进行特异性扩增。
[0040]
2.2 kasp标记分型
[0041]
利用araya荧光阅读仪读取到fam和vic两种荧光基团的信号，将结果导入数据库。
[0042]
在douglas scientific dashboard按照分型明确、ntc(无样品阴性对照)、无特异性扩增的原则进行样品snp分型。利用snp viewer基因型读取软件对分型结果进行分析，kasp标记在样本中读取到杂合基因型即为分型成功。在分型图中，x:x代表纯合型，包括a:a、t:t、c:c、g:g、-:-(缺失)五种类型，x:y代表杂合型，包括a:g、c:t、a:-(部分缺失)三种类型，？代表无信号或信号较弱，uncallable代表有信号但无明确分型。
[0043]
从42个kasp标记中筛选出3个标记，筛选条件是在“安源1号”群体检出率达到100％，同时在其他群体中不出现，3个kasp标记所在的序列见表1。
[0044]
2.3“安源1号”刺参鉴定标准与应用
[0045]
判定标准为：采用sds法提取刺参样品的dna，以kasp组合标记进行待测样品snp基因分型，检测“安源1号”刺参群体特有标记位点；判定标准为：检测个体具有全部3个上述引物标记位点，判定为“安源1号”刺参个体。群体样品大于等于30只，检测个体具有全部3个上述引物标记位点为阳性检出，群体中阳性检出率达到80％及以上，判定“安源1号”刺参群体。
[0046]
判定标准设置说明：基于前期调研显示，刺参池塘、底播养殖过程中极易出现非有意的个体、群体混杂现象，设置80％的阳性检出率作为“安源1号”群体判别指标较客观。
[0047]
应用：
[0048]
1.对已知种质的30只刺参(5只“安源1号”刺参，25只为不同地域普通刺参)进行鉴定，结果显示：5只“安源1号”刺参个体全部具有3个引物标记；25只不同地域普通刺参3个标记全部检出的为0，(具2个标记的4只，1个标记的8只)，判定为非“安源1号”刺参。检出准确率为100％。
[0049]
2.检测4个群体(1个群体为购买“安源1号”刺参苗种的池塘养殖群体，32只；另4个群体为大连、山东随机抽取池塘采样群体，每个池塘30只，共120只)，snpviewer检测结果显示(显示部分结果，见图1)：“安源1号”苗种养殖群体共32只，具3个标记的29只，“安源1号”群体阳性检出率为90.63％，判定为“安源1号”刺参群体。其他4个群体的中，3个标记全部检出的为0，(具2个标记的17只，1个标记的32只)，判定为非“安源1号”刺参群体。

技术特征：
1.一种用于鉴定“安源1号”刺参群体的引物组合，其特征在于所述引物组合见下表2.利用权利要求1所述引物组合来进行鉴定“安源1号”刺参群体的方法，其特征在于所述方法具体如下：采用sds法提取刺参样品的dna，以所述引物组合进行待测样品snp基因分型，检测“安源1号”刺参群体特有标记位点；判定标准为：检测个体具有全部3个上述引物标记位点，判定为“安源1号”刺参个体；群体样品大于等于30只，检测个体具有全部3个上述引物标记位点为阳性检出，群体中阳性检出率达到80％及以上，判定“安源1号”刺参群体。

技术总结
本发明涉及用于鉴定“安源1号”刺参群体的引物组合及其应用，属于分子生物学领域，所述的引物组合如表1所示。本发明还提供利用上述引物组合来进行鉴定“安源1号”刺参群体的方法，采用SDS法提取刺参样品的DNA，以所述引物组合进行待测样品SNP基因分型，检测“安源1号”刺参群体特有标记位点；判定标准为：检测个体具有全部3个上述引物标记位点，判定为“安源1号”刺参个体；群体样品大于等于30只，检测个体具有全部3个上述引物标记位点为阳性检出，群体中阳性检出率达到80％及以上，判定“安源1号”刺参群体。刺参群体。刺参群体。


技术研发人员：丁君 常亚青 国超 王荦 宋坚
受保护的技术使用者：大连海洋大学
技术研发日：2022.03.18
技术公布日：2022/5/25