利用LAMP快速检测抗ALS类除草剂稗草ALS基因突变的方法

利用lamp快速检测抗als类除草剂稗草als基因突变的方法
技术领域
1.本发明属于生物检测技术和农业科学领域，具体涉及快速检测抗als类除草剂稗草als基因w574l突变的引物、检测方法及应用。


背景技术：

2.环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，lamp)采用特异识别靶序列上6个位点的4条引物及一种具有链置换活性的dna聚合酶，在等温条件下进行核酸扩增，具有特异性强、灵敏度高、等温、操作简单和检测结果快速等优点，并且可以通过浊度比色法、荧光目测比色法等快速检测是否产生扩增产物。sybr greenι是一种能和dna双螺旋结构特异结合的荧光染料，将其加入产物中，可根据反应产物中是否反应出大量dna双螺旋结构呈现出不同颜色变化，阳性(存在大量扩增产物)为绿色，阴性(无扩增产物)为橙色。目前，该技术已广泛被各国检疫部门采用，用于检测病毒、细菌、寄生虫、菌物等；许多研究机构已经开展lamp快速检测基因突变的相关研究。
3.稗属，拉丁文名：echinochloa beauv.，为一年生或多年生草本植物，是水稻田最主要的杂草之一；稗草的大爆发最高可使水稻产量减少30％-40％。湖北省地处长江中游，是我国水稻种植大省；近些年，由于气候、除草剂长期不科学施用，湖北公安地区爆发大量对als类除草剂(双草醚、嘧啶肟草醚等)产生严重抗药性的稗草，严重影响正常水稻生产，增大了基层植保单位杂草防治的难度。


技术实现要素：

4.根据本研究团队近年研究发现，由于该抗药性稗草的靶标基因als基因的w574l突变，导致原本对als类除草剂敏感的杂草稗产生严重抗药性。因此，建立一种快速检测该抗药性杂草稗als基因w574l突变的技术，对于快速确定稗草抗药性、拟定稗草防治策略、减少水稻产量损失有着重要的意义。本发明基于发现的稗草als基因的w574l突变设计多套lamp反应引物，从中优选出特异性、反应效率最好的一套引物；建立了快速检测该基因突变的技术流程；优化出最佳的反应体系和反应条件；基于荧光染料sybr greenι，建立了检测结果直接可视的方法，通过肉眼即可判定结果，便于基层植保单位快速获得检测结果。
5.具体技术步骤如下：
6.(1)提取样品的基因组dna。
7.(2)将所提取样本的基因组dna建立总体积为25μl的反应体系(表2)，在63℃条件下进行扩增反应60min，反应结束后，在80℃条件下放置10min用于终止反应。
8.反应引物：
9.f3:caaccaacacctgggtatgg
10.b3:ttcctggtgcgggacaat
11.fip:gctctcattctctgggttcccctggtgcagttggaggaca
12.bip:gaagagcgaagtacgtgcagcagatatccaacaggtacggcc
13.(3)反应结果：1)反应产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测是否出现反应产物(图2)，s(敏感性稗草)未分离出条带，说明结果为阴性(不存在突变)；r(抗药性稗草)为分离出条带，说明结果为阳性(存在突变)。2)直接在扩增产物中加入1μl的1000x sybr greenι(图3)，反应结果可以在正常光或紫外光条件下观察，s(敏感性稗草)在正常光照下呈橙色，在紫外光下荧光反应弱，说明结果为阴性(不存在突变)；r(抗药性稗草)在正常光下呈绿色，在紫外光下出现强荧光反应，说明结果为阳性(存在突变)。
14.与现有技术相比，本发明具有以下特点：
15.1、本发明是国内外首例利用环介导等温扩增技术快速检测抗als类除草剂稗草靶标基因als基因w574l突变的技术，该技术的建立对国内外杂草科学研究团队检测杂草突变起了重要借鉴作用。
16.2、该快速检测技术具有极高的实用性。由于als基因产生w574l突变，湖北省地区的稗草近些年对以嘧啶肟草醚、双草醚等为主的als类除草剂产生严重抗药性，严重阻碍了基层植保单位的杂草防治工作，极大程度影响了水稻正常生产。本发明可以快速检测稗草是否存在als类除草剂靶标基因的抗性突变，帮助植保单位快速了解稗草抗性情况并精准制定防治策略。
17.3、检测过程便捷迅速：正常的基因测序检测耗时较长、需要2-3天；而该检测技术流程简单、耗时短(包括田间取样、基因组dna的提取、lamp反应)，全过程最多只需半天。
18.4、检测成本和设备要求低：正常的基因测序检测成本和仪器要求极高，费用昂贵，而该检测技术成本低，必须设备仅为水浴锅等恒温设备。
19.5、反应特异性强：本发明根据lamp反应原理，针对稗草als基因的六个区域设计了两对引物(fip、bip、f3、b3),并将w574l突变位点设计在内引物fip序列上；相比于仅采用一对引物识别基因片段的pcr扩增，基于lamp的该检测技术的特异性更加优异。
附图说明
20.图1lamp引物筛选(m：marker；ck：空白对照组；s：敏感型；r：抗药型。)；
21.图2反应产物2％凝胶电泳结果；
22.图3(a)在反应产物中直接加入sybr greenι的结果，(b)将加入sybr greenι的反应产物置于紫外光下的结果；
23.图4灵敏度检测，(a)反应产物进行2％琼脂糖凝胶电泳的结果，(b)反应产物加入sybr greenι的结果，其中，1-7分别代表不同的dna模板添加浓度，1：50ng
·
μl-1
，2：25ng
·
μl-1
，3：5
×
10-1
ng
·
μl-1
，4：5
×
10-2
ng
·
μl-1
，5：5
×
10-3
ng
·
μl-1
，6：5
×
10-4
ng
·
μl-1
，7:5
×
10-5
ng
·
μl-1
。
具体实施方式
24.以下结合实施例对本发明做具体的说明。
25.实施例1：lamp反应引物的筛选和确定。
26.引物设计：利用在线引物设计软件primer explorer v5，将包含w574l突变的稗草als部分基因序列(genbank：kj638691.1)作为模板，输入设计软件，引物设计的主要设计条件见表1，其它条件保持默认。
27.表1
[0028][0029]
引物筛选：建立总体积为25μl的lamp反应体系1(表2)；初步建立反应条件：63℃恒温条件下反应90min，然后在80℃下反应10min终止反应。取3μl反应产物在2％琼脂糖凝胶电泳中观察结果(图2)，s(敏感性稗草)未分离出条带，说明结果为阴性(不存在突变)；r(抗药性稗草)为分离出条带，说明结果为阳性(存在突变)。直接在扩增产物中加入1μl的1000x sybr greenι(图3)，反应结果可以在正常光或紫外光条件下观察，s(敏感性稗草)在正常光照下呈橙色，在紫外光下荧光反应弱，说明结果为阴性(不存在突变)；r(抗药性稗草)在正常光下呈绿色，在紫外光下出现强荧光反应，说明结果为阳性(存在突变)。利用反应体系1筛选出1套特异性和反应效率最好的lamp引物。结果显示(图1)：1号引物的特异性最佳。
[0030]
1号引物：
[0031]
f3:caaccaacacctgggtatgg
[0032]
b3:ttcctggtgcgggacaat
[0033]
fip:gctctcattctctgggttcccctggtgcagttggaggaca
[0034]
bip:gaagagcgaagtacgtgcagcagatatccaacaggtacggcc。
[0035]
实施例2：快速检测技术的灵敏度试验。
[0036]
按下表构建反应体系：
[0037]
表2
[0038][0039]
在反应体系中加入浓度分别为50ng
·
μl-1
,25ng
·
μl-1
,5
×
10-1
ng
·
μl-1
,5
×
10-2
ng
·
μl-1
,5
×
10-3
ng
·
μl-1
,5
×
10-4
ng
·
μl-1
,5
×
10-5
ng
·
μl-1
的dna模板(图4)。本试验中添加dna模板浓度为5
×
10-4
ng
·
μl-1
和5
×
10-5
ng
·
μl-1
的处理在2％琼脂糖凝胶电泳中未分离出条带，且在反应产物中加入sybr green i后呈现橙色，说明反应结果均呈阴性，说明该检测技术对于添加dna浓度的检测下限最低达到10-3
ng
·
μl-1
数量级。
[0040]
实施例3：快速检测技术的检测准确程度。
[0041]
种植了一批采样于湖北公安地区对als类除草剂存在抗药性的稗草，根据先前的研究已知该批稗草部分存在als基因w574l突变。首先对取自该批稗草的42个样本进行基因测序，然后将这42个样本利用该快速检测技术进行检测，通过与基因测序的结果对比，测试该快速检测技术的检测准确程度(如表3)。经对比统计可知该检测技术对该批样本的检测准确程度：以凝胶电泳为产物分析方法的：85.71％；以添加荧光显色剂为产物分析方法的：83.33％。
[0042]
表3
[0043]
[0044][0045]
本发明可以快速检测稗草是否存在als类除草剂靶标基因的抗性突变，帮助植保单位快速了解稗草抗性情况并精准制定防治策略。此外，本发明检测过程便捷迅速，特异性强，成本和设备要求低。

技术特征：
1.一种基于环介导等温扩增快速检测抗als类除草剂稗草（echinochloa beauv.）als基因w574l突变的方法，其特征在于，针对拟检测的样品通过下述引物进行环介导等温扩增，并进行检测；其中，所述引物如下：f3: caaccaacacctgggtatggb3: ttcctggtgcgggacaatfip: gctctcattctctgggttcccctggtgcagttggaggacabip: gaagagcgaagtacgtgcagcagatatccaacaggtacggcc。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，反应体系按25 μl计，具体如下：组分（浓度）添加量（μl）终浓度10xthermopolbuffer2.51x甜菜碱（4.5m）5.00.9mdntps（10mm）3.51.4mmmgso4（100mm）1.56mmfip（40μm）1.52.4mmbip（40μm）1.52.4mmf3（5μm）10.2mmb3（5μm）10.2mmbstdna聚合酶（8u
·
μl-1
）10.32u
·
μl-1
dna模板1无菌水5.5总体积25。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，反应条件是在63℃条件下进行扩增反应60 min，反应结束后，在80℃条件下放置10 min用于终止反应。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测方法如下：反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，如果未有条带，说明结果为阴性，即不存在突变；若出现有条带，说明结果为阳性即存在所述突变。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测方法如下：直接在扩增产物中加入1
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l的1000 x sybr green ι，在正常光照下呈橙色，在紫外光下荧光反应弱，说明结果为阴性即不存在突变）；在正常光下呈绿色，在紫外光下出现强荧光反应，说明结果为阳性即存在所述突变。6.一种基于环介导等温扩增快速检测抗als类除草剂稗草（echinochloa beauv.）als基因w574l突变的引物，其特征在于，所述引物如下：f3: caaccaacacctgggtatggb3: ttcctggtgcgggacaatfip: gctctcattctctgggttcccctggtgcagttggaggacabip: gaagagcgaagtacgtgcagcagatatccaacaggtacggcc。7.如权利要求1至5任一项所述的方法在鉴定抗als类除草剂稗草（echinochloa beauv.）是否具有抗性中的应用。
8.如权利要求6所述的引物在鉴定抗als类除草剂稗草（echinochloa beauv.）是否具有抗性中的应用。

技术总结
本发明公开了一种快速检测抗ALS类除草剂稗草（Echinochloa Beauv.）的ALS基因W574L突变的引物和方法，本发明有助于基层植保单位快速了解稗草抗药性情况、准确制定杂草防治策略、避免草害爆发。检测方法如下：1）提取稗草基因组DNA；2）建立反应体系，在63℃下扩增60 min；3）在80℃下终止反应后，在反应产物中加入荧光显色剂或利用2％琼脂糖凝胶电泳检测是否发生扩增，并以此确定是否存在抗性突变。本发明可以用极短的时间检测杂草抗性突变，不需要昂贵的仪器，节约了高额的测序费用。节约了高额的测序费用。


技术研发人员：马洪菊 何顺 毛植尧 冯唐奇
受保护的技术使用者：华中农业大学
技术研发日：2022.02.16
技术公布日：2022/5/25