一种CMM培养基及其应用的制作方法

一种cmm培养基及其应用
技术领域
1.本发明涉及一种间充质干细胞完全培养基及其应用，尤其涉及一种犬脐带间充质干细胞完全培养基及其应用，属于动物医学、生物领域。


背景技术：

2.兽医学实验和临床中,干细胞在再生医学和组织工程中的应用在都迅速出现。一方面，人类干细胞新疗法的临床前疗效和安全性测试必须使用两种动物物种进行评估，即首先是啮齿动物物种(最好是大鼠)，其次是与人类更相似的非啮齿动物大型动物。间充质干细胞(mscs)用于人类疾病治疗应用的研究中，一般认为狗优于啮齿动物。与啮齿动物相比，狗在解剖学、发病机制、运动表现和较大关节等方面比啮齿类与人更为相似可以更详细地评估治疗效果。另一方面，狗本身也经常受到疾病的折磨，需要干细胞等新型疗法的介入。到目前为止，许多犬类骨科和神经系统疾病的现有治疗方案通常不能产生预期的临床结果或患者恢复正常功能。因此，mscs在这一特定领域具有很大的前景。实际上，大量的mscs已用于兽医和人类细胞治疗。在人类医学中，1-5百万个细胞/kg被静脉注射或直接注射到组织中。为了获得这种数量级的细胞数量，需要进行培养扩增。目前广泛应用的一般培养方法所获取的间充质干细胞往往存在干性丢失及复制性衰老严重的情况，妨碍了干细胞治疗研究的效果。因此，发展能够大量扩增并能保持干细胞干性的犬间充质干细胞培养方法对于干细胞再生医学研究以及兽医临床实践均有重要意义。


技术实现要素：

3.发明目的：本发明的第一目的是提供一种犬脐带间充质干细胞完全培养基cmm培养基；本发明的第二目的是提供该cmm培养基在分离培养犬脐带间充质干细胞中的应用；本发明的第三目的是提供一种犬脐带间充质干细胞分离培养方法；本发明的第四目的是提供一种该cmm培养基分离培养得到的犬脐带间充质干细胞在制备治疗犬关节炎药物中的应用。
4.技术方案：本发明所述的一种犬脐带间充质干细胞完全培养基为cmm培养基，所述cmm培养基包括dmem/f12培养基及占dmem/f12培养基体积百分比为1-10％的犬富血小板血浆。
5.进一步地，还包括10～20μg/l硒元素、55～75mg/l l-抗坏血酸、200～500μg/l氢化可的松、15～30mg/l肝素、450～500mg/l nahco3和250～400mg/l转铁蛋白(transferrin)。
6.进一步地，所述犬富血小板血浆的提取包括以下步骤：将犬抗凝全血离心后分成三层，上层为血清、中层为富含血小板的血浆层、下层为红细胞层；无菌条件下抽取中层的血浆层，获得犬富血小板血浆。
7.进一步地，所述离心速率为800-2000rpm，离心时间为15-20min。
8.本发明还包括所述的犬脐带间充质干细胞完全培养基在分离培养犬脐带间充质
干细胞中的应用。
9.本发明还包括一种犬脐带间充质干细胞分离培养方法，包括以下步骤：
10.(1)将犬脐带用清洗液清洗，剪成小段，得到犬脐带段；
11.(2)将犬脐带段中血管去除，剪碎，得到犬脐带碎片；
12.(3)用消化液消化犬脐带碎片，过筛弃去组织块，得到细胞溶液；
13.(4)将细胞溶液离心分离，以cmm培养基重悬，得到经cmm培养基处理过的细胞组织；
14.(5)将细胞组织接种到magrigel包被的培养皿中，以本发明所述的cmm培养基培养即获得犬脐带间充质干细胞。
15.进一步地，步骤(1)中，所述清洗液为双倍双抗的pbs溶液，所述双倍双抗为青霉素和链霉素。
16.进一步地，步骤(1)中，所述剪成小段为3-5cm。
17.进一步地，步骤(3)中，所述消化液为0.2％胶原酶i。
18.进一步地，步骤(3)中，所述消化时间为30-50min。
19.进一步地，步骤(3)中，所述过筛为70um细胞筛。
20.进一步地，步骤(4)中，所述离心分离速度为1500-2000rpm，离心分离时间为15-30min
21.进一步地，步骤(5)中，所述细胞接种量为5
×
10
4-5
×
105/ml，该接种量指每毫升的cmm培养基中含有5
×
10
4-5
×
105个细胞。
22.本发明还包括所述的cmm培养基及所述分离培养方法培养获得的脐带血间充质干细胞在制备治疗犬关节炎药物中的应用。
23.有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下显著优点：本发明首次将犬富血小板血浆应用于培养基中获得cmm培养基。应用本发明所述的cmm培养基提供的分离培养方法所获得的脐带间充质干细胞有相较于一般的培养方法所获得脐带间充质干细胞有更强的干细胞活性和增值能力。应用本发明所述的cmm培养基培养获得的间充质干细胞能够更好的改善关节炎带来的跛行和疼痛，能够更好的改善修复关节功能。
附图说明
24.图1为实施例6和对比例5的培养体系下op和co细胞倍增时间图；
25.图2为op和co在第20代时干细胞干性基因oct4、nanog、sox2的表达状态图；
26.图3为op对犬关节炎影响图。
具体实施方式
27.下面结合附图进一步对本发明的技术方案作进一步说明。
28.实施例1犬富小板血浆制备
29.犬富血小板血浆通过以下方法获得：通过犬静脉，取全血5-50毫升，加入肝素抗凝，在1500rpm下离心分离15min，离心液分成三层，上层为血清、中层为富含血小板的血浆层、下层为红细胞层；无菌条件下抽取中层的血浆层，获得犬富血小板血浆。
30.实施例2cmm培养基配制
nahco3和250mg/ltransferrin。
51.对比例4改良后的普通培养基配制
52.com-2完全培养基，其包括dmem/f12培养基和占dmem/f12培养基体积百分比为10％fbs，20μg/l硒元素、75mg/l l-抗坏血酸、500μg/l氢化可的松、30mg/l肝素、500mg/l nahco3和400mg/ltransferrin。
53.对比例5普通培养方式及改良环境下犬脐带间充质干细胞分离培养方法以普通培养方式获得了犬脐带间充质干细胞作为比较分析的对照：
54.(1)获得犬脐带组织后，将犬脐带组织用含有双倍双抗(青霉素200u/ml，链霉素0.2mg/ml)的pbs漂洗干净，将犬脐带组织剪成3-5cm小段；
55.(2)分离血管后，将犬脐带组织漂洗干净，用眼科剪将犬脐带组织剪碎至2mm3左右；
56.(3)37℃下，使用0.2％胶原酶i消化50min，过70μm细胞筛，弃去组织块；
57.(4)以1500rpm离心15min，弃去上清，以5
×
105个细胞/ml的密度在对比例1-4中制备的com-b、com-0、com-1、com-2重悬并接种培养，接种到实施例5中制备的matrigel包被的培养皿，每三天换液，待细胞爬出。至细胞融合，进行传代，传代方法如同一般细胞的消化传代方法，传代后仍在在实施例5中制备的matrigel包被的培养皿中以对应的com-b、com-0、com-1、com-2培养基，由此获得犬脐带间充质干细胞称分别为co、co1、co2、co3。
58.通过记录细胞数量查知，cmm培养环境下的任一株细胞的增值速度均高于com培养环境下的细胞。其中，co、co1、co2、co3四株细胞中以co细胞株增值速度最高，而op、op1、op2三株细胞中op细胞株增值速度最高。因此我们仅以co和op为例进行说明对比。
59.实施例6和对比例5的培养体系下细胞倍增时间如图1所示，图1为实施例6和对比例5的培养体系下op和co细胞倍增时间图，由图1可知，在本发明提供的培养环境下，op细胞增殖达到了35代，才出现了倍增时间的略微延长，而在对比例5的方法下，co第25代时倍增时间已经达到了67h，出现了衰老迹象；表明cmm培养基长时间维持了较好的细胞活性和增值状态。
60.实施例7间充质干细胞干性基因表达水平的实时定量pcr检测
61.仍然以在cmm培养条件下生长最好的op和普通com培养条件下生长最好的co对比，应用总rna试剂盒分别提取实施例6中op和对比例5中co两种细胞总rna后，检测sox2、oct4、nanog等干细胞干性基因以及骨分化基因alp、runx2的表达情况，并进行比较，β2微球蛋白(microglobulin)为参照。定量pcr反应使用一步法rt-qpcr试剂盒(lm-0051，上海联迈生物工程有限公司)施行，反应体系按照说明书要求建立。反应条件为：首先94℃5分钟处理完毕后进入反应循环。循环条件为：94℃30秒，55℃30秒，68℃2分钟，30个循环。最后68℃处理10分钟。所用引物分别为：
62.oct4：
63.forward:gagtgagaggcaacctggag
64.reverse:gtgaagtgagggctcccata
65.nanog：
66.forward:gaataacccgaattggagcag
67.reverse:agcgattcctcttcacagttg
68.sox2：
69.forward：agtctccaagcgacgaaaaa
70.reverse：gcaagaagcctctccttgaa
71.alp：
72.forward：tcaacagaccctgaaatacgc
73.reverse：tcttggagagggccacgtaag
74.runx2：
75.forward：gtctccttccagaatgcttcc
76.reverse：ggaactgaggatgaggagac
77.b2 microglobulin：
78.forward：tctacattgggcactgtgtcac
79.reverse：aagagttcaggtctgaccaag
80.实施例6的op和对比例5的co在第20代时干细胞干性基因oct4、nanog、sox2的表达状态如图2所示。图2为op和co在第20代时干细胞干性基因oct4、nanog、sox2的表达状态图，由图2可知，op中上述基因的表达水平分别是表达水平的1.4倍、1.3倍和1.8倍；而op中骨分化基因alp和runx2的表达是co的0.9和0.7倍。上述结果表明op有较强的干细胞特性，而co干性水平较低则有向骨分化的倾向从而证明了本发明op长时间维持了较好的细胞活性和增值状态。
81.实施例8op对犬关节炎影响
82.将符合关节骨关节炎病犬分成3组，每组10只。第一组为对照组，注射1毫升生理盐水；第二组为op组，进行op间充质干细胞患处注射，每周注射1次1毫升含有107个op细胞的生理盐水，3次为1个疗程；第三组为co组，进行co间充质干细胞患处注射，每周注射1次1毫升含有107个细胞的生理盐水，3次为1个疗程。一个疗程结束后，第90天以如下功能量表进行打分，具体见表1。
83.表1
84.跛行疼痛关节功能1分——正常1分——无痛楚1分——正常2分——间歇地2分——轻微痛楚2分——稍僵硬3分——持续的3分——明显痛楚3分——僵硬4分——不能负重行走4分——明显痛楚4分——很僵硬，不愿行走5分——不能独立行走5分——明显痛楚5分——不能独立行走
85.具体实验结果见图3，图3为op对犬关节炎影响图。由图3表明，相较于co间充质干细胞，应用op间充质干细胞能够更好的改善关节炎带来的跛行和疼痛，能够更好的改善修复关节功能。

技术特征：
1.一种cmm培养基，其特征在于，所述cmm培养基包括dmem/f12培养基及占dmem/f12培养基体积百分比为1-10％的犬富血小板血浆。2.根据权利要求1所述的cmm培养基，其特征在于，所述cmm培养基还包括10～20μg/l硒元素、55～75mg/l l-抗坏血酸、200～500μg/l氢化可的松、15～30mg/l肝素、450～500mg/l nahco3和250～400mg/l转铁蛋白。3.根据权利要求1所述的cmm培养基，其特征在于，所述犬富血小板血浆的提取包括以下步骤：将犬抗凝全血离心后分成三层，无菌条件下抽取中层的血浆层，获得犬富血小板血浆。4.权利要求1-3任一项所述的cmm培养基在分离培养犬脐带间充质干细胞中的应用。5.一种犬脐带间充质干细胞分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将犬脐带用清洗液清洗，剪成小段，得到犬脐带段；(2)将犬脐带段中血管去除，剪碎，得到犬脐带碎片；(3)用消化液消化犬脐带碎片，过筛弃去组织块，得到细胞溶液；(4)将细胞溶液离心分离，以cmm培养基重悬，得到经cmm培养基处理过的细胞组织；(5)将细胞组织接种到magrigel包被的培养皿中，以权利要求1～3任一项所述的cmm培养基培养即获得犬脐带间充质干细胞。6.根据权利要求5所述的犬脐带间充质干细胞分离培养方法，其特征在于，步骤(1)中，所述剪成小段为3-5cm，所述双倍双抗为青霉素和链霉素。7.根据权利要求5所述的犬脐带间充质干细胞分离培养方法，其特征在于，步骤(3)中，所述消化时间为30-50min。8.根据权利要求5所述的犬脐带间充质干细胞分离培养方法，其特征在于，步骤(4)中，所述离心分离速度为1500-2000rpm，离心分离时间为15-30min。9.根据权利要求5所述的犬脐带间充质干细胞分离培养方法，其特征在于，步骤(5)中，所述细胞接种量为5
×
10
4-5
×
105/ml。10.根据权利要求1-3任一项所述的cmm培养基、权利要求5-9任一项所述的方法培养获得的脐带血间充质干细胞在制备治疗犬关节炎药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种CMM培养基及其应用，所述CMM培养基包括DMEM/F12培养基及占DMEM/F12培养基体积百分比为1-10％犬富血小板血浆，还包括10～20μg/L硒元素、55～75mg/LL-抗坏血酸、200～500μg/L氢化可的松、15～30mg/L肝素、450～500mg/L NaHCO3和250～400mg/LTransferrin。本发明还公开了CMM培养基在犬脐带血间充质干细胞分离培养中的应用。本发明的分离培养方法得到的犬脐带间充质干细胞相较于一般的培养方法所获得脐带间充质干细胞有更强的干细胞活性和增值能力。本发明得到的犬脐带间充质干细胞对犬关节炎有明显的改善作用。作用。作用。


技术研发人员：袁术斌 袁荃 樊德俊 孙博
受保护的技术使用者：江苏银丰生物工程有限公司
技术研发日：2022.02.15
技术公布日：2022/5/25