一种全血检测甲状旁腺素的试剂盒及其使用方法与流程

1.本技术涉及甲状旁腺素免疫检测的技术领域，更具体地说，它涉及一种全血检测甲状旁腺素的试剂盒及其使用方法。


背景技术：

2.甲状旁腺激素(parathyroid hormone，pth)，是甲状旁腺合成并分泌的碱性单链多肽类激素，由84个氨基酸组成的。正常人血浆中pth的浓度约为1毫微克/毫升，pth在循环血液中的半衰期约为20分钟，主要在肾脏内灭活。
3.它的主要功能是调节脊椎动物体内钙和磷的代谢，促使血钙水平升高，血磷水平下降。pth促使血浆钙离子浓度升高，其作用的主要靶器官是骨和肾脏。它动员骨钙入血，促进肾小管对钙离子(ca
2+
)的重吸收和磷酸盐的排泄，使血钙浓度增加和血磷浓度下降。pth对肾脏的直接作用是促进肾小管对ca
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的重吸收，因而减少ca
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从尿中排泄。
4.而pth的分泌主要受血浆ca
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浓度的调节。血浆ca
2+
浓度升高，pth的分泌即受到抑制；血浆ca
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浓度降低，则刺激pth的分泌。低血钙不仅促进pth的合成和分泌，还刺激甲状旁腺组织的增生。
5.如果pth的分泌过于旺盛，会引起骨钙质的消蚀而易于骨折或骨畸形，并因血钙量过高而导致一系列恶果，如软骨与血管的钙化、神经损伤、肾结石等。若pth的分泌不足，肾脏的磷酸盐排泄量减低，磷酸钙沉积于骨，进而使得血钙的浓度下降过甚，从而导致肌肉神经接合处的收缩、松弛反应消失、肌肉痉挛及手足抽搐。
6.因此，准确检测血液中pth的水平是十分必要的。
7.目前国内市售的试剂盒，大多是基于酶联免疫吸附法或者放射性免疫分析法或者磁微粒化学发光法。目前最为常用的是采用磁微粒化学发光法来检测血液内的pth含量，其检测一个样本的时间至少在20分钟，存在反应时间长的问题，为临床的广泛应用带来阻碍和限制。


技术实现要素：

8.针对上述的不足，本技术的第一个目的在于提供一种全血检测甲状旁腺素的试剂盒，其具有检测时间短的优点。
9.本技术的第二个目的在于提供一种全血检测甲状旁腺素的试剂盒的使用方法。
10.为实现上述第一个目的，本技术提供了如下技术方案：一种全血检测甲状旁腺素的试剂盒，包括盒体，所述盒体内设有若干个装有不同试剂的试剂管，所述试剂管包括装有r1试剂的第一试剂管、装有r2试剂的第二试剂管、装有r3试剂的第三试剂管和装有r4试剂的第四试剂管；所述r1试剂为能够与人全血中的红细胞特异性结合的抗红细胞抗体，所述抗红细胞抗体上还结合有磁分离试剂；所述r2试剂为hrp标记的pth单抗溶液，所述r3试剂为acridan标记的pth单抗溶
液，所述r4试剂为生理盐水。
11.通过采用上述技术方案，在使用本技术的试剂盒时，直接用人全血样本进行检测，无需将人全血样本做离心处理，得到人血清之后再进行相关的检测。
12.本技术的试剂盒中的r1试剂本身是结合有抗红细胞抗体磁分离试剂，其能够和人全血中的红细胞特异性结合，形成磁分离试剂-抗红细胞抗体-红细胞复合物，该复合物能够通过磁分离处理将红细胞自人全血样本中更加高效地、完全地去除，免去离心去除红细胞的操作，节约检测时间。此外，通过r2试剂和r3试剂的组合使用，将二者和人全血样本混合后，能够形成hrp-pth-acridan复合物，该复合物在激发剂和隔离剂的作用下产生剧烈的发光反应，实现最终的检测，检测灵敏度较高。更重要的是，本技术的试剂盒中，参与最终检测的试剂都是液体试剂，因此该检测的反应过程是基于纯液相体系进行反应的，因此相对于相关技术中的有固相参与反应的反应体系，本技术的检测过程更加高效。
13.优选地，所述r1试剂的制备包括以下步骤：s1-1、将粒径为1-3μm的羧基磁珠，经第一缓冲液清洗、edc试剂活化后稀释，即得到磁分离试剂；s1-2、于所述磁分离试剂中加入所述抗红细胞抗体，以所述羧基磁珠的体积计，所述抗红细胞抗体的加入量为5-10mg/ml，充分混匀后反应26-31min，使得所述抗红细胞抗体和所述羧基磁珠交联，得到第一交联液；s1-3、于所述第一交联液中加入含有胺基的氨基酸溶液以使得所述羧基磁珠上未反应的活化氨基酸位点完全反应，随后经磁吸附处理，收集固相以得到交联后的羧基磁珠-抗红细胞抗体复合物；s1-4、用第二缓冲液将所述羧基磁珠-抗红细胞抗体复合物清洗后经磁吸附处理，随后于固相中加入所述第二缓冲液，即得到所述r1试剂，其中所述r1试剂中所述抗红细胞抗体的浓度为1.2-1.4mg/l；最后将得到的r1试剂装入所述第一试剂管并密保存即可。
14.通过采用上述技术方案，首先磁分离试剂中的羧基磁珠已经被活化，使得羧基磁珠具有结合抗红细胞抗体的能力，进而实现羧基磁珠和抗红细胞抗体的非特异性结合。但此时，羧基磁珠上活化氨基酸位点并未全部负载有抗红细胞抗体，因此加入含有胺基的氨基酸溶液，使得羧基磁珠上的活化氨基酸位点均负载有蛋白质或者氨基酸，进而使得氨基酸-羧基磁珠-蛋白质复合物的稳定性更好。步骤s1-4中第二缓冲液的清洗操作，主要是为了将氨基酸-羧基磁珠-蛋白质复合物上黏附的例如甘氨酸等杂质洗去，避免这些杂质对后续的反应带来干扰。步骤s1-4中第二缓冲液的再次加入，其目的在于进一步提高羧基磁珠-抗红细胞抗体复合物的稳定性；而羧基磁珠和抗红细胞抗体的稳定交联，有利于全面去除人全血样本中的红细胞。
15.优选地，所述r2试剂制备方法包括以下步骤：s2-1、取摩尔比为1:(1.3-1.6)的pth单抗和hrp分别做脱盐处理后，将分别含有两种蛋白质的溶液混合后并浓缩，得到含有pth单抗和hrp的第一浓缩液；s2-2、于所述第一浓缩液中加入bs3试剂，并在水浴环境下反应，使得pth单抗和hrp交联，得到第二交联液，所述第二交联液中含有hrp标记的pth单抗；所述bs3试剂和pth单抗的质量比为(0.37-0.52):1；s2-3、于所述第二交联液中加入氨基酸溶液，用于结合未反应的活化氨基酸位点；
s2-4、将步骤s2-3最终获得的溶液进行蛋白纯化，收集含有纯化后的hrp标记的pth单抗的纯化液并浓缩，使得溶液中hrp标记的pth单抗的浓度为0.6-1.1mg/ml，即得hrp标记的pth单抗溶液；s2-5、于s2-4中最终得到的溶液内加入第三缓冲液，使得所述hrp标记的pth单抗的浓度为0.005-0.015mg/l，最终得到的溶液即为所述r2试剂；最后将得到的r2试剂装入所述第二试剂管并密保存即可。
16.通过采用上述技术方案，首先使用bs3试剂将pth抗体和hrp交联，实现pth的hrp标记；随后将hrp标记的pth单抗脱盐纯化，得到纯化后的hrp标记的pth单抗。最后将纯化后的hrp标记的pth单抗溶液进行浓缩，使得hrp标记的pth单抗的稳定性更佳，其原因在于：蛋白纯化后得到的是hrp标记的pth抗体，当蛋白质存在溶液中时，蛋白质的浓度越大，蛋白质的稳定性越高，因此，将纯化后的hrp标记的pth单抗溶液进行浓缩，使得纯化液中的蛋白质浓度变大，hrp标记的pth抗体的稳定性更高。采用第三缓冲液将hrp标记的pth单抗封闭，使得hrp和pth单抗的交联更稳定。在上述的原料用量下，hrp标记的pth单抗易于与待检样本中的pth结合。
17.优选地，所述r3试剂制备方法包括以下步骤：s3-1、取pth单抗进行脱盐处理，收集脱盐处理后的pth单抗溶液；s3-2、将脱盐处理后的pth单抗溶液浓缩至浓度为5-7mg/ml，随后加入acridan试剂，以使得acridan试剂和pth单抗交联，得到第三交联液，所述第三交联液中含有acridan标记的pth单抗；其中，添加的acridan试剂和pth单抗的质量比为(0.16-0.23):1；s3-3、于所述第三交联液中加入含有胺基的氨基酸溶液，使得溶液内未反应的活化氨基酸位点完全反应；s3-4、将s3-3最终得到的溶液进行脱盐，收集脱盐后的acridan标记的pth单抗溶液，其中，acridan标记的pth单抗浓度为0.9-1.0mg/ml；s3-4、于脱盐后的acridan标记的pth单抗溶液中加入第四缓冲液，使得acridan标记的pth单抗的浓度为0.012-0.022mg/l，即得到r3试剂；最后将得到的r3试剂装入所述第三试剂管并密保存即可。
18.通过采用上述技术方案，首先使用acridan试剂标记pth抗体，实现pth的acridan标记；随后对acridan标记的pth单抗进行脱盐纯化，得到acridan标记的pth单抗；最后用第四缓冲液将acridan标记的pth单抗封闭，进一步稳定acridan和pth抗体之间的交联效果。在上述的原料用量下，交联后其交联稳定性较佳；除此以外，得到的acridan标记的pth单抗易于与待检样本中的pth结合。
19.优选地，所述试剂盒还包括激发液试剂管和隔离液试剂管，所述激发液试剂管内装有激发液，所述隔离液试剂管内装有隔离液试剂管。
20.优选地，所述试剂盒还包括若干的校准品试剂管，若干所述校准品试剂管内分别装有浓度为0pg/ml、10pg/ml、60pg/ml、300pg/ml、1500pg/ml、3000pg/ml的甲状旁腺素抗原溶液。
21.为实现上述第二个目的，本技术提供了如下技术方案：一种全血检测甲状旁腺素的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：s1、取人全血样本于第一反应管中，打开第一试剂管和第四试剂管，随后于第一反
应管中加入所述r1试剂和所述生理盐水，在反应不少于3min后，对反应液进行磁分离处理，收集液相，弃去固相，实现人全血样本中红细胞的分离去除；s2、打开第二试剂管和第三试剂管，于s1中收集得到的液相中加入所述r2试剂和所述r3试剂，在35-37℃的条件下孵育5-7min后，实现待检样品中的pth和hrp标记的pth单抗、acridan标记的pth单抗的同时交联，得到第四交联液，所述第四交联液中含有hrp标记的pth单抗-pth-acridan标记的pth单抗的复合物；s3、打开激发液试剂管和隔离液试剂管，于所述第四交联液中加入所述激发液和所述隔离液后，测定发光值即可；以所述校准品的各个浓度的溶液为待测样品，重复步骤s1-s3，测定其发光值并进行标准曲线的绘制，并根据标准曲线的线性方程计算人全血样本中pth的含量。
22.通过采用上述技术方案，首先在待检样本的选择上，选用的是人全血，未对人全血进行离心处理，省去了离心步骤(通常离心步骤的时间需要15-30min)，进而缩短了每个样品的检测时间。由此使得将本技术的试剂盒在医学检测应用上时，具有较好的应用前景。在本技术试剂盒的使用方法中，生理盐水的加入使得人全血样本中的红细胞维持正常的渗透压，避免因红细胞破裂后，其内容物释放到外部溶液中，影响后续的反应和检测。在该方法中，磁分离试剂和抗红细胞抗体先行交联，交联产物在接触人血样本时，人血样本中的红细胞通过抗原-抗体间的特异性结合，与交联产物形成磁分离试剂-抗红细胞抗体-红细胞复合物(即为固相)。在磁吸附的作用下，磁分离试剂-抗红细胞抗体-红细胞复合物与人血样本进行固液分离，摒弃固相，留有液相(液相中含有待检测的pth)以进行后面的处理过程。该脱除人全血中红细胞的磁分离方式与现有技术的离心方式相比，首先花费的时间较短，其次，红细胞的脱除是基于抗原抗体的靶向性特异性结合以及磁分离原理来实现的，使得红细胞的脱除效率更高。
23.优选地，s1中添加的所述r1试剂和所述人全血样本的体积比为(1-11):10，s2中所述r2试剂和所述磁分离试剂的体积比为(9-15):6，r3试剂和磁分离溶液的体积比为(9-15):6；添加的所述r4试剂和所述r1试剂的体积比为(4-5):3。
24.综上所述，本技术具有以下有益效果：1.本技术提出了一种全新的方法学，即：基于磁分离技术、夹心法化学发光免疫分析法与邻近化学发光技术的技术原理，实现了对人全血样本中pth含量的检测。
25.2.本技术的试剂盒中所用到的磁分离试剂，其本质是用来去除人全血样本中的红细胞，并且不参与发光反应；而整个检测过程不涉及对人全血样本的离心去除红细胞的过程；试剂盒在使用时的发光反应是纯液相反应体系，并不涉及液固反应。
26.3.将本技术的试剂盒用于待检样本中pth的含量测定时，其检测时间短于12min，具有总检测时间短的优势。
具体实施方式
27.以下结合实施例对本技术作进一步详细说明。
28.本技术中以下原料为购买获得，具体见表1。
29.表1原料信息表
其中，mes缓冲液的配置：将1.952g的mes溶于80ml的纯水中，调节ph为6.0，用纯水定容到100ml即可。
30.bio-rad蛋白纯化仪的lp系统购自美国伯乐bio-rad，其为液相色谱，设备型号为：biologic lp。
31.底物液为aps-5(即：9-(4
’‑
氯苯硫代磷酰氧亚甲基)-10-甲基-9，10-二氢化吖啶二钠盐)，购自于lumigen。该产品为专利产品，具体参考申请号为cn02805225.0、专利名称为“与过氧化物酶产生化学发光的改进化合物”的发明专利。
32.r1试剂的制备r1试剂的制备方法，包括以下步骤：s1-1、磁分离试剂的制备：取羧基磁珠，用第一缓冲液多次清洗后备用；随后加入edc试剂，使得羧基磁珠被活化，混合均匀后备用；将上述溶液用第一缓冲液清洗，即得到磁分离试剂。
33.其中，羧基磁珠的尺寸可以是1-3μm，例如可以是1.5μm。由于羧基磁珠的粒径小，为微米级别的，所以将羧基磁珠置于反应容器内时，为流体形态，因此在本技术的表述中，于羧基磁珠内添加的相关溶液的用量以羧基磁珠的体积计。
34.第一缓冲液为酸性缓冲液，可以是ph6.0的mes缓冲液。
35.以羧基磁珠的体积计，每次清洗羧基磁珠时第一缓冲液的用量为30-50ml，例如第一缓冲液的用量为35ml、40ml、45ml；用第一缓冲液清洗羧基磁珠的操作可以进行多次，例如清洗2-4次。
36.单位体积的羧基磁珠内edc试剂的加入量可以为4.5-5.5mg/ml，例如5mg/ml。
37.s1-2、于上述s1-1制备得到的磁分离试剂中加入抗红细胞抗体，充分混匀后反应一段时间，使得所述抗红细胞抗体和所述磁分离试剂交联，得到第一交联液，第一交联液中含有负载了抗红细胞抗体的羧基磁珠(为固相)。
38.其中，以羧基磁珠的体积计，抗红细胞抗体的加入量为5-10mg/ml，例如6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml。充分混匀后的反应时间可以为26-31min，如28min，29min，30min。
39.s1-3、于第一交联液中加入含有胺基的氨基酸溶液，并于室温反应4.5-8min，以结合第一交联液中未反应的活化氨基酸位点，使得于固相得到交联后的羧基磁珠-抗红细胞抗体复合物更加稳定。
40.其中，含有胺基的氨基酸溶液可以选择为甘氨酸溶液、tris溶液(即三羟甲基氨基甲烷的溶液)，对含有胺基的氨基酸溶液的浓度和用量不做限制，只要达到使得未反应的活化氨基酸位点均结合有氨基酸即可。进一步地，当含有胺基的氨基酸溶液选择为甘氨酸溶液的浓度可以为1m、2m、3m；选择1m甘氨酸溶液时，甘氨酸溶液与羧基磁珠-抗红细胞抗体交联溶液的体积比可以为(90-110):1000，例如100:1000；加入甘氨酸溶液后，反应时间至少为5min，可以选择为5-10min，例如5min，6min，7min，8.5min。
41.tris溶液，即三羟甲基氨基甲烷的溶液，配置为0.05mol/l的tris-hcl溶液。tris溶液与羧基磁珠-抗红细胞抗体交联溶液的体积比可以为(90-110):1000，例如100:1000；加入tris溶液后，反应时间至少为4.5min，可以选择为4.5-8min，例如5min，6min，7min。
42.s1-4、用第二缓冲液清洗步骤s1-3最终获得的羧基磁珠-抗红细胞抗体复合物，随后加入第二缓冲液进行溶液的稀释，使得溶液中抗红细胞抗体的浓度为1.2-1.4mg/l，即得到r1试剂。
43.随后将制备得到的r1试剂加入第一试剂管后，将第一试剂管密封即可。
44.r2试剂的制备包括以下步骤：s2-1、取摩尔比为1:(1.3-1.6)的pth单抗和hrp，分别加入第五缓冲液后进行脱盐处理，并分别得到pth单抗溶液和hrp溶液；随后将pth单抗溶液和hrp溶液混合到一起并浓缩至浓缩液中pth单抗的浓度为0.9-1.0mg/ml，即得到第一浓缩液，第一浓缩液中包含pth单抗和hrp。
45.其中，第五缓冲液为碱性缓冲液，可以为ph7.2的pb磷酸盐缓冲液；pth单抗和hrp的质量比可以为1:(1.3-1.6)，例如1:1.4，1:1.5。
46.s2-2、于步骤s2-1中得到的第一浓缩液里加入bs3试剂，充分混匀并在35-37℃的水浴条件下反应一段时间，使得pth单抗和hrp交联，得到第二交联液，第二交联液中含有hrp标记的pth单抗。
47.其中，水浴的时间可以为1.7-2.3h，例如1.8h，1.9h，2.0h，2.1h，2.2h；bs3试剂和pth单抗的质量比为(0.37-0.52):1，例如0.4:1，0.45:1，0.49:1。
48.s2-3、于步骤s2-2获得的第二交联液中加入含有胺基的氨基酸溶液，用于结合溶液中未反应的活化氨基酸位点，随后在室温条件下至少反应20min。
49.其中，含有胺基的氨基酸溶液可以选择为甘氨酸溶液、tris溶液，对含有胺基的氨基酸溶液的浓度和用量不做限制，只要达到使得未反应的活化氨基酸位点均结合有氨基酸即可。进一步地，当含有胺基的氨基酸溶液选择为甘氨酸溶液时，甘氨酸溶液的浓度可以为
1m、2m、3m；选择1m甘氨酸溶液时，甘氨酸溶液与第二交联液的体积比可以为(90-110):1000，例如100:1000。加入含有胺基的氨基酸溶液后，反应时间至少为20min，可以选择为20-25min，或可以选择为25-35min，例如22min，24min，26min，28min。
50.tris溶液，即三羟甲基氨基甲烷的溶液，配置为0.05mol/l的tris-hcl溶液。tris溶液与羧基磁珠-抗红细胞抗体交联溶液的体积比可以为(90-110):1000，例如100:1000；加入tris溶液后，反应时间至少为4.5min，可以选择为4.5-8min，例如5min，6min，7min。
51.s2-4、对步骤s2-3最终获得的溶液进行蛋白纯化后，收集含有hrp标记的pth单抗的纯化液并浓缩，得到第二浓缩液，第二浓缩液中hrp标记的pth单抗的浓度为0.6-1.1mg/ml，即得hrp标记的pth单抗。
52.其中，第二浓缩液中hrp标记的pth单抗的浓度可以为0.6-1.1mg/ml，例如0.75mg/ml，0.85mg/ml，0.95mg/ml，1.05mg/ml。
53.s2-5、于制备得到的hrp标记的pth单抗溶液(即上述制备得到的hrp标记的pth单抗浓度为0.9-1.0mg/ml的溶液)中加入第三缓冲液，使得hrp标记的pth单抗的浓度为0.005-0.015mg/l，最终得到的溶液即为r2试剂。
54.其中，hrp标记的pth单抗的浓度还可以是0.007mg/l，0.009mg/l，0.011mg/l，0.013mg/l。
55.最后将制备得到的r2试剂装入第二试剂管后并密封保存即可。
56.r3试剂的制备r3试剂的制备，包括以下步骤：s3-1、取pth单抗，用第六缓冲液冲洗后做脱盐处理并浓缩，得到第三浓缩液，第三缩液中pth单抗的浓度为5-7mg/ml。
57.其中，第六缓冲液为碱性缓冲液即可，例如可以为ph7.2的pb磷酸盐缓冲液；第三浓缩液中pth单抗的浓度可以为5-7mg/ml，例如5.5mg/ml，6mg/ml，6.5mg/ml。
58.s3-2、于第三浓缩液中加入acridan试剂，充分混匀后在35-37℃的水浴条件下至少反应0.8h，可以为0.8-1.2h，例如0.9h，1.0h，1.1h，随即得到第三交联液，第三交联液中含有acridan标记的pth单抗；其中，acridan试剂和pth单抗的质量比可以为(0.16-0.23):1，例如0.17:1，0.19:1，0.21:1。
59.s3-3、于第三交联液中加入含有胺基的氨基酸溶液，用于结合未反应的活化氨基酸位点，随后在室温条件下反应一段时间。
60.其中，含有胺基的氨基酸溶液可以选择为甘氨酸溶液、tris溶液，tris溶液，即三羟甲基氨基甲烷的溶液，配置为0.05mol/l的tris-hcl溶液。
61.对含有胺基的氨基酸溶液的浓度和用量不做限制，只要达到使得未反应的活化氨基酸位点均结合有氨基酸，以使得溶液中的acridan标记的pth单抗稳定存在即可。进一步地，当含有胺基的氨基酸溶液选择为甘氨酸溶液时，甘氨酸溶液的浓度可以为1m、2m、3m；选择1m甘氨酸溶液时，甘氨酸溶液与第三交联液的体积比可以为(90-110):1000，例如100:1000。加入含有胺基的氨基酸溶液后，反应时间至少为17min，可以选择为17-23min，23-31min，例如18min，20min，22min，24min，26min，28min。
62.tris溶液，即三羟甲基氨基甲烷的溶液，配置为0.05mol/l的tris-hcl溶液。tris溶液与羧基磁珠-抗红细胞抗体交联溶液的体积比可以为(90-110):1000，例如100:1000；
加入tris溶液后，反应时间至少为4.5min，可以选择为4.5-8min，例如5min，6min，7min。
63.s3-4、将步骤s3-3最终得到的溶液进行脱盐处理，即得到脱盐处理的acridan标记的pth单抗溶液，其中，溶液中acridan标记的pth单抗浓度为0.9-1.0mg/ml。
64.s3-5、于上述制备得到的acridan标记的pth单抗溶液(即上述制备得到的acridan标记的pth单抗浓度为0.9-1.0mg/ml的溶液)中加入第四缓冲液，使得acridan标记的pth单抗的浓度为0.012-0.022mg/l，即为r3试剂。
65.其中，acridan标记的pth单抗的浓度可以为0.012-0.022mg/l，例如0.013mg/l，0.017mg/l，0.019mg/l，0.021mg/l。
66.将上述制备得到的r3试剂装入第三试剂管中，将第三试剂管密封保存即可。
67.一种全血检测甲状旁腺素的试剂盒的使用方法一种全血检测甲状旁腺素的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：s1、取人全血样本加入到洁净的第一反应管中，打开第一试剂管和第四试剂管，将第一试剂管中r1试剂、第四试剂管中的生理盐水(即r4试剂)分别加入第一反应管中，使得r1试剂中的负载于羧基磁珠上的抗红细胞抗体和人全血样本中的红细胞特异性结合，并均负载于羧基磁珠上，此时，固相上存在的是羧基磁珠、抗红细胞抗体和红细胞。在反应时间不少于3min后，至少进行1.5min的磁分离处理，然后弃去固相(即羧基磁珠、抗红细胞抗体和红细胞)，得到磁分离溶液(即液相)。其中，生理盐水的加入只要能够维持人全血样本的渗透压即可，r1试剂和人全血样本的体积比为(3-9):10，r4试剂和所述r1试剂的体积比可以为(4-5):3。
68.其中，于人全血样本中加入生理盐水和r1试剂后，反应时间至少为3min，生理盐水的加入主要使得人全血样本中的红细胞维持正常的渗透压，反应时间可以为4min，6min，8min；随后的磁分离处理时间至少为2min，可以为2-5min；r1试剂和人全血样本的体积比可以为(2.1-9.6):10，例如2.5:10，4:10，8:10。
69.s2、随后将磁分离溶液置于洁净的第二反应管中；打开第二试剂管和第三试剂管，在第二反应管中加入r2试剂和r3试剂，随后在水浴条件下孵育5-7min后，使得待检测样本中同一pth上同时特异性结合有hrp标记的pth单抗和acridan标记的pth单抗，得到第四交联液，第四交联液中含有hrp标记的pth单抗-pth-acridan标记的pth单抗的复合物；其中，r2试剂和磁分离溶液的体积比为(9-13):6，r3试剂和磁分离溶液的体积比为(9-15):6。
70.其中，r2试剂和磁分离溶液的体积比可以为(9-13):6，例如10:6，12:6；r3试剂和磁分离溶液的体积比可以为(9-15):6，例如9.2:6，12:6，14.5:6。
71.s3、打开激发液试剂管和隔离液试剂管，于第四交联液中加入的激发液和的隔离液后，在25-30s后测定发光值；其中，激发液和磁分离溶液的体积比为(9-14):6，隔离液和磁分离溶液的体积比为(9-14):6；激发液和磁分离溶液的体积比可以为(9-11):6，可以为(11-13):6，例如10:6，12:6；隔离液和磁分离溶液的体积比可以为(9-11):6，可以为(11-13):6，例如10:6，12:6。
72.打开各个标准品管，以标准品为待测样品，重复进行步骤s1-s3，测定其发光值并进行标准曲线的绘制，并根据标准曲线的线性方程计算人全血样本中pth的含量。
73.制备例磁分离试剂的制备例
磁分离试剂的制备方法，具体包括以下步骤：取50ul的羧基磁珠，用第一缓冲液清洗，本制备中选择的第一缓冲液为ph6.0的mes缓冲液，将羧基磁珠清洗3次，每次mes缓冲液的加入量为2ml，弃去清洗液后留有羧基磁珠备用。称取5mg的edc试剂，加入到1ml的ph6.0的mes溶液中，得到edc试剂-mes溶液，edc试剂-mes溶液中edc的含量为5mg/ml，混合均匀后备用。
74.将上述获得的edc试剂-mes溶液全部加入到上述备用的羧基磁珠中，使得羧基磁珠被活化，得到的最终溶液为磁分离试剂。该活化过程使得羧基磁珠上具有结合氨基酸的活化氨基酸位点，以便在后期能够结合相关的氨基酸或蛋白质。
75.r1试剂的制备例r1试剂的制备方法，具体包括以下步骤：s1-1、于磁分离试剂的制备例中得到的1ml的磁分离试剂中加入0.4mg的抗红细胞抗体，充分混匀后反应30min，由于活化的羧基磁珠上具有结合氨基酸的活化氨基酸位点，因此抗红细胞抗体能够和羧基磁珠上的活化氨基酸位点非特异性结合，即完成抗红细胞抗体和羧基磁珠的交联，得到1ml的第一交联液，第一交联液中含有负载了抗红细胞抗体的羧基磁珠。
76.s1-2、于1ml的第一交联液中加入100ul的1m甘氨酸溶液，随后于室温反应5min，用于结合羧基磁珠上未结合到抗红细胞抗体的活化氨基酸位点。然后通过磁吸附的操作，留下固相，弃去液相，即得到交联后的羧基磁珠-抗红细胞抗体复合物该羧基磁珠上交联有抗红细胞抗体。
77.s1-3、用第二缓冲液清洗步骤s1-2最终获得的羧基磁珠(该羧基磁珠上交联有抗红细胞抗体)，清洗3次，每次清洗的缓冲液用量为2ml。然后通过磁分离处理后留有羧基磁珠，弃去清洗液。最后于羧基磁珠内加入20ml的第二缓冲液，第二缓冲液的加入主要实现了羧基磁珠和抗红细胞抗体在交联后的封闭及保存。本制备例中选择的第二缓冲液，是将tris、nacl、nan3、tween-20以及bsa-v分别加入至纯水中，即配置得到第二缓冲液，即第二缓冲液为ph 8.0的含有0.01m tris，0.2m nacl，0.005m nan3，0.01％(w/w)tween-20和0.1％(w/w)bsa-v的溶液。
78.s1-4、于步骤s1-3制备得到的溶液中加入第二缓冲液以将其稀释至溶液中抗红细胞抗体的浓度为1.35mg/l，即得到r1试剂。随即将r1试剂装入第一试剂管内并将第一试剂管密封保存。
79.r2试剂的制备例r2试剂的制备例，包括以下步骤：s2-1、取1mg的pth单抗(相对分子量为160mg/mmol，摩尔量为0.006mmol)和1.2mg的hrp(相对分子量为44mg/mmol，摩尔量为0.027mmol)，分别用第五缓冲液冲洗后进行脱盐处理，本实施例的第五缓冲液选择为ph7.2的pb磷酸盐缓冲液，本制备例中以下步骤里提到的pb磷酸盐缓冲液均为ph7.2的pb磷酸盐缓冲液。
80.(i)获得脱盐处理的pth单抗溶液：将1mg的pth单抗加入0.2ml的pb磷酸盐缓冲液中，混匀；上样：于一次性pd-10纯化柱内添加ph7.2的pb磷酸盐缓冲液，用于将柱子平衡，在一次性pd-10纯化柱的柱子平衡后，取0.2ml的上述的溶解有pth单抗的pb磷酸盐缓冲液一
次性自pd-10纯化柱的柱顶处添加，进行pth单抗的脱盐纯化；洗脱：待添加的样品全部进入pd-10纯化柱内后，自柱顶加入2.3ml的pb磷酸盐缓冲液，待缓冲液全部进入纯化柱后再加入2.5ml的pb磷酸盐缓冲液洗脱得到脱盐处理的pth单抗溶液。
81.(ii)获得脱盐处理的hrp溶液：将1.2mg的hrp加入0.2ml的pb磷酸盐缓冲液中，混匀，得到hrp溶液；上样：在一次性pd-10纯化柱的柱子平衡后，取0.2ml上述的hrp溶液自pd-10纯化柱的柱顶添加至pd-10纯化柱内，进行脱盐纯化；洗脱：待上述添加的样品全部进入pd-10纯化柱内后，自柱顶加入2.4ml的pb磷酸盐缓冲液，待缓冲液全部进入pd-10纯化柱后再加入2.5ml的pb磷酸盐缓冲液洗脱得到脱盐处理的hrp溶液。
82.上述的步骤(i)和(ii)的脱盐处理分别实现了pth的脱盐纯化和hrp的脱盐纯化。
83.将经过脱盐处理的pth单抗溶液和脱盐处理的hrp溶液混合到一起并采用ge的10k的离心浓缩管进行离心浓缩，使得最终溶液的体积浓缩到1ml，得到第一浓缩液，第一浓缩液中pth单抗的浓度为0.93mg/ml。
84.s2-2、于通过步骤s2-1得到的第一浓缩液中加入0.45mg的交联剂bs3试剂，充分混匀，并在37℃的水浴条件下反应2.2h，使得pth单抗和hrp交联，得到1ml的第二交联液，第二交联液中含有hrp标记的pth单抗。
85.s2-3、于步骤s2-2中获得的第二交联液中加入100ul的1m甘氨酸溶液，在室温条件下反应20min，以结合hrp上未结合有pth单抗的活化氨基酸位点，使得hrp和pth单抗之间的交联更加稳固。
86.s2-4、使用bio-rad蛋白纯化仪的lp系统进行蛋白纯化，纯化柱为ge的superdex200pg。上样前将步骤s2-3的溶液浓缩到500ul以内，本制备例将步骤s2-3的溶液浓缩至450ul。
87.纯化仪流速设置为1ml/min，收集40-65min之间的纯化峰对应的蛋白质溶液，混匀后得到纯化液；将纯化液浓缩至0.9ml，得到第二浓缩液，通过紫外分光光度计测得第二浓缩液中hrp标记的pth单抗的浓度为0.93mg/ml；随后于第二浓缩液中加入0.9ml的甘油，充分混匀后放于-20℃冰箱中冷冻备用。
88.s2-5、于上述制备得到的hrp标记的pth单抗溶液内加入第三缓冲液，以将上述步骤s2-4最终得到的溶液稀释至hrp标记的pth单抗的浓度为0.019mg/l，此稀释后的溶液即为r2试剂。将r2试剂装入第二试剂管内后，将第二试剂管密封后保存即可。
89.本制备例中的第三缓冲液是将ph8.0的tris、nacl、青霉素、羊血清和小鼠血清分别加入至纯水中，配置得到0.01m tris，0.015m nacl，0.001m青霉素，0.1％羊血清和0.01％小鼠血清的溶液。第三缓冲液的加入主要实现了交联后hrp标记的pth单抗封闭和稳定。
90.r3试剂的制备例r3试剂的制备方法，包括以下步骤：s3-1、取1mg的pth单抗，加入第六缓冲液之后做脱盐处理，使用的纯化柱是一次性pd-10纯化柱。其具体的纯化步骤同r2试剂的制备例中的步骤s2-1(i)，最终得到脱盐处理
的pth单抗溶液。本制备例中第六缓冲液选择为ph7.2的pb磷酸盐缓冲液。
91.将上述最终得到的脱盐处理的pth单抗溶液浓缩到0.9ml，得到第三浓缩液，第三浓缩液中pth单抗的浓度为6.7mg/ml。当溶液中pth单抗的浓度较大时，pth单抗的稳定性更高。
92.s3-2、于通过步骤s3-1得到的第三浓缩液内加入0.2mg的acridan试剂，充分混匀后在37℃的水浴条件下反应1h，使得pth单抗和acridan试剂交联，得到第三交联液，第三交联液内含有acridan标记的pth单抗。同时，第三交联液中可能含有还未完全结合有pth单抗的acridan试剂，这部分acridan试剂上存在未反应的活化氨基酸位点，会影响acridan试剂和pth单抗之间的交联稳定性，此未反应的活化氨基酸位点在以下步骤中进一步处理。
93.s3-3、于步骤s3-2中最终得到的第三交联液中加入100ul的1m甘氨酸溶液，在室温条件下反应20min，使得步骤s3-3中acridan试剂上的未反应的活化氨基酸位点，全部结合有甘氨酸，进一步稳定了acridan试剂和pth单抗之间的交联稳定性。
94.s3-4、将步骤s3-3最终得到的溶液，使用pd-10纯化柱进行脱盐处理，获得脱盐处理的acridan标记的pth单抗溶液的具体步骤为：上样：在pd-10纯化柱的柱子平衡后，将步骤s3-3最终得到的溶液取0.6ml加到一次性pd-10纯化柱的柱子顶上，行脱盐纯化；洗脱：样品全部进入pd-10纯化柱内后，自柱顶加入2ml的pb磷酸盐缓冲液，待pb磷酸盐缓冲液全部进入纯化柱后再加入2.5ml的pb磷酸盐缓冲液洗脱得到脱盐处理的acridan标记的pth单抗溶液。
95.收集1ml经脱盐处理的acridan标记的pth单抗溶液，通过紫外分光光度计测得其中的acridan标记的pth单抗的浓度为1.0mg/ml，同时加入0.9ml的甘油，充分混匀后放于-20℃的冰箱冷冻备用。
96.s3-5、于上述制备得到的acridan标记的pth单抗溶液中加入第四缓冲液，将上述步骤s3-4最终得到的溶液稀释至acridan标记的pth单抗的浓度为0.019mg/l，此稀释后的溶液即为r3试剂。将r2试剂装入第二试剂管内后，将第二试剂管密封后保存即可。
97.本制备例中的第四缓冲液是用tris、nacl、青霉素、羊血清和小鼠血清分别加入至纯水中，配置得到ph8.0的0.01m tris，0.015m nacl，0.001m青霉素，0.1％羊血清，0.01％小鼠血清的溶液。第四缓冲液的加入主要实现了在acridan试剂和pth单抗交联后的封闭和稳定。
98.碱性磷酸酶标记的pth单抗的制备例本制备例与r2试剂的制备例的区别在于，本制备例以等质量的碱性磷酸酶替换hrp，其它同hrp标记的pth单抗的制备例的操作。
99.磁珠标记的pth单抗的制备例本制备例与r1试剂的制备例的区别在于，本制备例以等质量的pth单抗替换抗红细胞抗体，其它同磁分离试剂的制备例的操作。实施例
100.本实施例提供了一种检测甲状旁腺素的试剂盒，包括盒体，盒体内装有若干不同的试剂管。试剂管包括第一试剂管、第二试剂管、第三试剂管、第四试剂管、激发液试剂管、隔离液试剂管和若干个校准品试剂管。上述的各个试剂管用来盛装不同的试剂。
101.其中，第一试剂管内装有6ml的r1试剂，r1试剂中抗红细胞抗体的浓度为1.35mg/l。第二试剂管中装有12ml的r2试剂，r2试剂中hrp标记的pth单抗的浓度为0.019mg/l。第三试剂管内装有12ml的r3试剂，r3试剂中acridan标记的pth单抗的浓度为0.019mg/l。第四试剂管内装有20ml的生理盐水。激发液试剂管内装有12ml的激发液，隔离液试剂管内装有12ml的隔离液。校准品试剂管共有六个，分别装有浓度为0pg/ml、10pg/ml、60pg/ml、300pg/ml、1500pg/ml、3000pg/ml的甲状旁腺素抗原溶液(溶剂为小牛血清)，每个校准品试剂管中的装液量为4ml。
102.本技术的全血检测pth的试剂盒的组成具体见表2。
103.表2本实施例的pth试剂盒的组成一种全血检测甲状旁腺素的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：s1、取100ul的人全血样本加入到洁净的第一反应管中，打开第一试剂管和第四试剂管，取第一试剂管中60ul的r1试剂、第四试剂管中100ul的生理盐水(即r4试剂)分别加入第一反应管中，使得人全血样本中的红细胞和r1试剂中的负载于羧基磁珠上的抗红细胞抗体特异性结合，并均负载于羧基磁珠上。此时，固相上存在的是羧基磁珠、抗红细胞抗体和红细胞。在反应3min后，进行2min的磁分离处理，然后弃去固相(即羧基磁珠、抗红细胞抗体和红细胞)，得到磁分离溶液(即液相)。
104.s2、随后将磁分离溶液置于洁净的第二反应管中；打开第二试剂管和第三试剂管，在第二反应管中加入120ul的r2试剂和120ul的r3试剂，随后在水浴条件下孵育5min后，使得待检测样本中同一pth上同时特异性结合有hrp标记的pth单抗和acridan标记的pth单抗，得到第四交联液，第四交联液中含有hrp标记的pth单抗-pth-acridan标记的pth单抗的复合物。
105.s3、打开激发液试剂管和隔离液试剂管，于第四交联液中加入的100ul的激发液和100ul的隔离液后，在25s后使用滨松光子的bhp9507测定仪测定发光值。
106.随后打开各个标准品管，以标准品为待测样品，重复进行步骤s1-s3，测定其发光
值并进行标准曲线的绘制，并根据标准曲线的线性方程计算人全血样本中pth的含量。
107.其中，r1试剂通过r1试剂的制备例制备得到；r2试剂通过r2试剂的制备例制备得到；r3试剂通过r3试剂的制备例制备得到。
108.对比例本对比例和实施例的区别在于，本对比例是采用另一种检测方法检测人血中pth含量，采用商用的pth试剂盒，购自深圳市新产业生物医学工程股份有限公司。本对比例使用常规的基于磁微粒化学发光法检测pth含量的试剂盒进行样本中pth含量的检测，其他公司的类似产品的使用方法中，在加样量、孵育时间上存在差异，但整体流程相同，具体的使用方法包括以下步骤：步骤一：直接使用采血管取样，将采集得到的全血样本在3000rpm的转速下离心10min，取上清液于洁净的样本杯中，得到血清样本。
109.步骤二：取15ul的血清标本于一洁净的反应管中，于血清样本中加入120ul的碱性磷酸酶标记的pth单抗，60ul羧基磁珠标记的pth单抗和120ul的第四缓冲液，得到溶液ⅰ；随后在37℃的条件下孵育15min。在该反应中，血清中的pth单抗完全反应。碱性磷酸酶标记的pth单抗和pth(血清样本中的pth)特异性结合，羧基磁珠标记的pth单抗和pth(血清样本中的pth)上的其它结合位点特异性结合，最终形成磷酸酶标记的pth单抗-pth-羧基磁珠标记的pth单抗复合物。
110.其中，碱性磷酸酶标记的pth单抗通过碱性磷酸酶标记的pth单抗的制备例制备得到，羧基磁珠标记的pth单抗是通过磁珠标记的pth单抗的制备例制备得到。
111.步骤三：将步骤二中获得的溶液用磁性架吸附1min，羧基磁珠被吸附，随后丢弃液相中的剩余液。此处的羧基磁珠是磷酸酶标记的pth单抗-pth-羧基磁珠标记的pth单抗复合物，被吸附在磁性架上；而血清中的其它杂质以及未反应的碱性磷酸酶-pth单抗被保留在剩余液中。该过程实现了将羧基磁珠(磷酸酶标记的pth单抗-pth-羧基磁珠标记的pth单抗复合物)和杂质的分离。同时，被吸附在磁性架上的磷酸酶标记的pth单抗-pth-羧基磁珠标记的pth单抗复合物，由于羧基磁珠外表面上还黏附有血清中的杂质物质等(该部分杂质会对后期的发光反应产生干扰)，这部分杂质有待在接下来的步骤中去除。
112.然后加入400ul清洗液，震荡混匀，实现清洗羧基磁珠(羧基磁珠是磷酸酶标记的pth单抗-pth-羧基磁珠标记的pth单抗复合物)的目的，将羧基磁珠外表面上非特异性吸附的血清中的杂质物质等去除。其中，清洗液为含0.1％tween-20的生理盐水。
113.步骤四：重复步骤三4次。
114.步骤五：用磁性架吸附1min，随后吸取反应管中的剩余液，清除剩余液体，保留羧基磁珠，此处的羧基磁珠上负载磷酸酶标记的pth单抗和pth，即为磷酸酶标记的pth单抗-pth-羧基磁珠标记的pth单抗复合物。
115.然后于羧基磁珠内加入200ul底物液aps-5，底物液中含有发光底物aps-5，震荡混匀后进行检测即可。
116.检测方法的验证采取获得同样的人全血样本，分别使用实施例和对比例的试剂盒进行人血中pth的含量测定。使用实施例的pth试剂盒，按照实施例的pth检测方法制备得到的样本，采用hm240全自动分析系统进行检测；使用对比例的pth试剂盒，按照对比例的pth检测方法制备
得到的样本，采用axceed 260全自动化学发光免疫系统进行检测。
117.(1)检测时间比较和使用对比例的试剂盒进行人全血中pth含量的方法相比，使用实施例的试剂盒，其总的操作及反应时间比对比例的方法短，即检测一个人全血样本中pth的含量的总用时少，各个处理阶段的具体用时见表3。
118.表3实施例和对比例两种检测方法的各个处理阶段的用时注：实施例中的孵育时间即为实施例步骤s1中所述的反应时长(3min)、磁分离时长(2min)和步骤s2中所述的孵育时长(5min)的总和时间，即10min。
119.从表3的数据看出，使用实施例的试剂盒进行人全血中pth含量测定时，由于实施例的试剂盒能够针对人全血样本直接进行检测，不需要增加人全血样本的离心处理，因此在获取人全血样本后，整个检测时间仅花费676s，即11.3min；而采用传统的磁微粒化学发光法进行人血中pth含量测定时，首先要做的就是对获取得到的人全血进行离心处理，随后获得血清样本后再进行其它的操作，而仅仅离心这一步骤就用时10min，接近于实施例的检测过程的总用时；且采用对比例的试剂盒，其总用时达1711s，即28.5min，远远多于实施例的试剂盒的检测时长。
120.(2)线性比对取pth标准品配置pth标准溶液，pth的浓度(pmol/l)分别为：0pg/ml、10pg/ml、60pg/ml、300pg/ml、1500pg/ml、3000pg/ml。以上述的标准品为待检对象，分别使用实施例的pth试剂盒、对比例的pth试剂盒进行样本检测，分别得到对应pth浓度的发光数值，具体结果见表4。通过表4的结果，分析两种检测方法的线性回归。
121.表4实施例和对比例的检测方法的线性回归的对比
将表4的结果计算后，实施例中检测方法的一元线性标准曲线的方程为：y＝1778.9x-5761.9，r2＝0.9976；对比例中检测方法的一元线性标准曲线的方程为：y＝1430x-10748，r2＝0.9999。从该结果看出，本技术的检测方法和现有的检测方法的线性回归相似；且两种方法的一元线性标准曲线的r2接近，表明使用本技术的试剂盒和本技术试剂盒的使用方法进行样本检测时，其检测方法的线性回归和现有的对比例的方法相比，无明显差异。
122.(3)灵敏度比对表5实施例和对比例的检测方法的灵敏度对比检测方法灵敏度(pg/ml)实施例0.5对比例2表5的结果表明，本技术实施例的方法能够获得更高的检测灵敏度。出现这种结果的可能原因为：实施例的方法为纯液相反应，各个反应物之间的反应进行地高效完全。而对比例中存在的固相的非特异性吸附的反应底物(羧基磁珠标记的pth，羧基磁珠和pth之间是非特异性吸附)，使得反应不够完全、充分。因此使用实施例的试剂盒进行样品检测时，其检测方法灵敏度优于传统方法。
123.进一步具体的解释为：实施例的方法中，参与反应的底物有：hrp标记的pth单抗、pth、acridan标记的pth单抗，三者交联后得到hrp标记的pth单抗-pth-acridan标记的pth单抗复合物，所有反应均在液相中进行。而对比例的方法中，参与反应的底物为：碱性磷酸酶标记的pth单抗、pth、羧基磁珠标记的pth单抗，三者交联得到碱性磷酸酶标记的pth单抗-pth-羧基磁珠标记的pth单抗复合物。其中，碱性磷酸酶标记的pth单抗和pth的结合为抗原(pth)和抗体(碱性磷酸酶标记的pth单抗)之间的特异性吸附，该反应在液相中进行；pth和羧基磁珠标记的pth单抗之间的结合是液相(血清中pth)和固相(羧基磁珠标记的pth
单抗)之间的特异性吸附反应；且羧基磁珠标记的pth单抗本身在制备时，pth和羧基磁珠的连接是非特异性吸附连接，本身会存在羧基磁珠上用于结合氨基酸的活化氨基酸位点上没有结合到pth单抗(有部分活化氨基酸位点结合了甘氨酸)；除此以外，pth单抗和羧基磁珠的结合是非特异性结合，不够牢固。因此，实施例中纯液相的反应和对比例的反应相比，底物稳定性更强、反应更完全，因此其灵敏度更高。
124.(4)临床样本对比同时本技术对比了使用实施例的pth检测方法和对比例的(对比例中的检测方法即商用的pth检测方法)pth检测方法对临床样本的测试结果。临床样本为不大于2800pg/ml的样本，在每个区间段选取了10例样本进行比对测试。
125.表6检测不同浓度范围的pth时实施例和对比例方法的符合率结果对比浓度范围(pg/ml)0-1010-6060-300300-15001500-2800实施例的r2值0.970.950.990.980.98对比例的r2值0.910.930.940.910.99本技术对比了在不同浓度范围内的pth血清临床样本，从表6的内容发现使用本技术实施例的pth检测方法，在高浓度(1500-2800pg/ml)的范围内其符合率优于对比例中的检测方法，可能是因为实施例方法的高值线性范围优于对比例的试剂盒的检测方法，因此其测值的波动也较小的关系。而在其它浓度区间，二者基本一致。
126.本具体实施例仅仅是对本技术的解释，其并不是对本技术的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本技术的权利要求范围内都受到专利法的保护。

技术特征：
1.一种全血检测甲状旁腺素的试剂盒，其特征在于，包括盒体，所述盒体内设有若干个装有不同试剂的试剂管，所述试剂管包括装有r1试剂的第一试剂管、装有r2试剂的第二试剂管、装有r3试剂的第三试剂管和装有r4试剂的第四试剂管；所述r1试剂为能够与人全血中的红细胞特异性结合的抗红细胞抗体，所述抗红细胞抗体上还结合有磁分离试剂；所述r2试剂为hrp标记的pth单抗溶液，所述r3试剂为acridan标记的pth单抗溶液，所述r4试剂为生理盐水。2.根据权利要求1所述的一种全血检测甲状旁腺素的试剂盒，其特征在于，所述r1试剂的制备包括以下步骤：s1-1、将粒径为1-3 μm的羧基磁珠，经第一缓冲液清洗、edc试剂活化后稀释，即得到磁分离试剂；s1-2、于所述磁分离试剂中加入所述抗红细胞抗体，以所述羧基磁珠的体积计，所述抗红细胞抗体的加入量为5-10 mg/ml，充分混匀后反应26-31 min，使得所述抗红细胞抗体和所述羧基磁珠交联，得到第一交联液；s1-3、于所述第一交联液中加入含有胺基的氨基酸溶液以使得所述羧基磁珠上未反应的活化氨基酸位点完全反应，随后经磁吸附处理，收集固相以得到交联后的羧基磁珠-抗红细胞抗体复合物；s1-4、用第二缓冲液将所述羧基磁珠-抗红细胞抗体复合物清洗后经磁吸附处理，随后于固相中加入所述第二缓冲液，即得到所述r1试剂，其中所述r1试剂中所述抗红细胞抗体的浓度为1.2-1.4 mg/l；最后将得到的r1试剂装入所述第一试剂管并密保存即可。3.根据权利要求1所述的一种全血检测甲状旁腺素的试剂盒，其特征在于，所述r2试剂制备方法包括以下步骤：s2-1、取摩尔比为1:（1.3-1.6）的pth单抗和hrp分别做脱盐处理后，将分别含有两种蛋白质的溶液混合后并浓缩，得到含有pth单抗和hrp的第一浓缩液；s2-2、于所述第一浓缩液中加入bs3试剂，并在水浴环境下反应，使得pth单抗和hrp交联，得到第二交联液，所述第二交联液中含有hrp标记的pth单抗；所述bs3试剂和pth单抗的质量比为（0.37-0.52）:1；s2-3、于所述第二交联液中加入氨基酸溶液，用于结合未反应的活化氨基酸位点；s2-4、将步骤s2-3最终获得的溶液进行蛋白纯化，收集含有纯化后的hrp标记的pth单抗的纯化液并浓缩，使得溶液中hrp标记的pth单抗的浓度为0.6-1.1 mg/ml，即得hrp标记的pth单抗溶液；s2-5、于s2-4中最终得到的溶液内加入第三缓冲液，使得所述hrp标记的pth单抗的浓度为0.005-0.015 mg/l，最终得到的溶液即为所述r2试剂；最后将得到的r2试剂装入所述第二试剂管并密保存即可。4.根据权利要求1所述的一种全血检测甲状旁腺素的试剂盒，其特征在于，所述r3试剂制备方法包括以下步骤：s3-1、取pth单抗进行脱盐处理，收集脱盐处理后的pth单抗溶液；s3-2、将脱盐处理后的pth单抗溶液浓缩至浓度为5-7 mg/ml，随后加入acridan试剂，以使得acridan试剂和pth单抗交联，得到第三交联液，所述第三交联液中含有acridan标记
的pth单抗；其中，添加的acridan试剂和pth单抗的质量比为（0.16-0.23）:1；s3-3、于所述第三交联液中加入含有胺基的氨基酸溶液，使得溶液内未反应的活化氨基酸位点完全反应；s3-4、将s3-3最终得到的溶液进行脱盐，收集脱盐后的acridan标记的pth单抗溶液，其中，acridan标记的pth单抗浓度为0.9-1.0 mg/ml；s3-5、于脱盐后的acridan标记的pth单抗溶液中加入第四缓冲液，使得acridan标记的pth单抗的浓度为0.012-0.022 mg/l，即得到r3试剂；最后将得到的r3试剂装入所述第三试剂管并密保存即可。5.根据权利要求1所述的一种全血检测甲状旁腺素的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括激发液试剂管和隔离液试剂管，所述激发液试剂管内装有激发液，所述隔离液试剂管内装有隔离液试剂管。6.根据权利要求1所述的一种全血检测甲状旁腺素的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括若干的校准品试剂管，若干所述校准品试剂管内分别装有浓度为0 pg/ml、10 pg/ml、60 pg/ml、300 pg/ml、1500 pg/ml、3000 pg/ml的甲状旁腺素抗原溶液。7.权利要求1-6任一所述的一种全血检测甲状旁腺素的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：s1、取人全血样本于第一反应管中，打开第一试剂管和第四试剂管，随后于第一反应管中加入所述r1试剂和所述生理盐水，在反应不少于3 min后，对反应液进行磁分离处理，收集液相，弃去固相，实现人全血样本中红细胞的分离去除；s2、打开第二试剂管和第三试剂管，于s1中收集得到的液相中加入所述r2试剂和所述r3试剂，在35-37℃的条件下孵育5-7 min后，实现待检样品中的pth和hrp标记的pth单抗、acridan标记的pth单抗的同时交联，得到第四交联液，所述第四交联液中含有hrp标记的pth单抗-pth-acridan标记的pth单抗的复合物；s3、打开激发液试剂管和隔离液试剂管，于所述第四交联液中加入所述激发液和所述隔离液后，测定发光值即可；以所述校准品的各个浓度的溶液为待测样品，重复步骤s1-s3，测定其发光值并进行标准曲线的绘制，并根据标准曲线的线性方程计算人全血样本中pth的含量。8.根据权利要求7所述的一种全血检测甲状旁腺素的试剂盒的使用方法，其特征在于，s1中添加的所述r1试剂和所述人全血样本的体积比为（1-11）:10，s2中所述r2试剂和所述磁分离试剂的体积比为（9-15）:6，r3试剂和磁分离溶液的体积比为（9-15）:6；添加的所述r4试剂和所述r1试剂的体积比为（4-5）:3。

技术总结
本申请公开了一种全血检测甲状旁腺素的试剂盒及其使用方法，涉及免疫检测的技术领域，解决了相关试剂盒在使用时检测用时长的问题。试剂盒包括盒体，盒体内设有若干个装有不同试剂的试剂管，所述试剂中，R1试剂为结合有磁分离试剂的抗红细胞抗体，R2试剂为HRP标记的PTH单抗溶液，所述R3试剂为Acridan标记的PTH单抗溶液，所述R4试剂为生理盐水。本申请试剂盒使用方法包括：S1、于人全血中加R1试剂，磁分离后除红细胞，得液相；S2、于液相中加R2、R3试剂，孵育后得反应液；S3、于反应液中加入激发液隔离液，测定。本发明试剂盒用于检测人全血中的PTH含量，其具有检测用时少的优点。其具有检测用时少的优点。


技术研发人员：赵科
受保护的技术使用者：北京豪迈生物工程股份有限公司
技术研发日：2022.03.16
技术公布日：2022/5/25