LXH0307、LXH0308作为基因编辑的小分子抑制剂及其应用

lxh0307、lxh0308作为基因编辑的小分子抑制剂及其应用
技术领域
1.本发明属于化学药物领域，具体涉及lxh0307、lxh0308作为spcas9的小分子抑制剂及其作用。


背景技术：

2.基因组编辑技术是一种通过人工手段在基因组水平对dna序列进行改造的遗传操作技术，包括特定dna片段的插入、敲除、替换和点突变。其中，依赖核酸酶的基因组编辑技术的基本原理是在基因组的特定位置产生双链dna断裂(double-stranded break，dsb)后通过非同源末端连接(non-homologous end joining，nhej)或同源重组(homologous recombination，hr)的方式进行修复。随着对核酸酶更深入的研究，基因组编辑技术也得到了快速发展，其中最常使用的核酸酶主要包括巨型核酸酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶以及成簇的规律间隔的短回文重复序列相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats(crispr)-associated proteins(cas)。
3.crispr/cas系统是来自细菌及古生菌的一种天然免疫系统，由crispr序列和高度多样化的cas蛋白组成。crispr序列由重复序列区(repeats)和间隔区(spacers)组成。重复序列区含有回文序列，可以形成发卡结构，间隔区是被俘获的外源dna序列。cas蛋白根据功能可以分为4个模块：适应模块主要参与获取spacer以及外源基因整合到crispr序列的过程；表达处理模块负责pre-crrna的处理；干扰和效应子模块参与靶标识别和切割；信号转导和辅助模块是一系列功能不同的基因的集合。基于cas蛋白的序列、组合差异，crispr系统可被分为2个大类。1类crispr/cas系统为多个cas蛋白组成的效应子模块，而2类crispr/cas系统为单个多域的cas蛋白效应子模块。
4.最近研究发现，crispr系统不仅可以用来切割病毒dna，也可以精确地切割其他的dna序列，crrna-tracrrna被简化为单链导向rna(single guide rna，sgrna)，可以被简单地设计、合成，通过改变sgrna的序列即可匹配靶基因，进而引导cas9蛋白到指定位置切割dna。
5.随着分子生物学和测序技术的发展，人们对疾病的认识进入了分子水平，发现了人类许多疾病的发生、进展都可能与基因突变相关。例如：某些原癌基因的突变可促使肿瘤的发生，甚至某些抑癌基因的突变可通过导致原癌基因的激活从而使肿瘤发生等(jiang cy,lin xh,zhao zg.applications of crispr/cas9 technology in the treatment of lung cancer.trends mol med,2019,25(11):1039-1049)。所以确定与疾病密切相关的基因及其功能将有助于为临床治疗提供更好的策略。随着crispr技术的迅速发展，基于crispr技术的基因组筛选在实验室水平上已得到了广泛的应用，这种筛选方法具有文库设计灵活、操作简单、覆盖范围广等优点。虽然crispr-cas9技术日趋完善，但将其广泛应用于临床基因治疗还存在一定的风险，其在特异性、安全性和在体转导方面仍有待提升。
6.crispr-cas9在基因疗法中的安全应用要求这样的能力：一旦所期望的用途已经实现，就控制cas9/sgrna复合物的基因编辑活性。尽管几个经改造的系统允许crispr-cas9
的受控激活以提高精确度，但是所有这些系统仍然缺乏提供可预测的控制和稳健的抑制的能力。研发调控基因编辑的试剂，对于大大改善基于crispr系统的临床治疗和研究应用的效力和安全性。


技术实现要素：

7.为了弥补现有技术的不足，本发明提供了调控基因编辑的化合物以及化合物的制备方法，本发明的化合物能具有较高的调控基因编辑活性的能力。
8.本发明采用了如下技术方案：
9.本发明第一方面提供了一种调控基因编辑的化合物，所述化合物具有式(i)所述的结构：
[0010][0011]
其中，所述r是芳香环，所述芳香环可以被0、1、2或3个取代基r1取代，所述取代基r1独立地选自卤代、cn、c
1-c
4-烷基、c
1-c
4-卤代烷基、c
3-c
4-环烷基、or2、nr2r3；每个r2和r3独立地是h、c
1-c4烷基或或c
1-c
4-卤代烷基；
[0012]
在一些实施方案中，所述芳香环是苯环或萘。
[0013]
在一些实施方案中，所述r2和r3独立地是h、c
1-c4烷基。
[0014]
在优选的实施方案中，所述化合物的结构如下所示：
[0015][0016]
本发明第二方面提供了一种制备本发明第一方面所述的化合物的方法，所述方法包括：
[0017]
1)使用溴苯胺、乙醛酸乙酯，和boc-二氢吡咯反应合成化合物2-p；
[0018]
2)使用柱层析方法分离得到化合物2-p1和2-p2；
[0019]
3)将化合物2-p1与2-氟苯硼酸进行suzuki偶联反应生成化合物3-p1；
[0020]
4)将化合物3-p1进行羧酸还原反应生成化合物4-p1；
[0021]
5)化合物4-p1在酸性条件下脱boc生成化合物5-p1；
[0022]
6)将化合物5-p1进行磺酰化反应生成lxh0307和lxh0308。
[0023]
在一些实施方案中，步骤1)合成化合物2-p的方法如下：将乙醛酸乙酯和4-溴苯胺加入到甲苯溶液中，然后加入mgso4搅拌得到反应液1；将boc-二氢吡咯加入甲苯溶液中，然后加入三氟甲基磺酸钪反应得到反应液2；将反应液1和反应液2加在一起反应，萃取旋干。
[0024]
在一些实施方案中，在0℃下搅拌得到反应液1。
[0025]
在一些实施方案中，在0℃下加入三氟甲基磺酸钪。
[0026]
在一些实施方案中，萃取试剂为乙酸乙酯/水。
[0027]
在一些实施方案中，步骤2)柱层析中的洗脱剂选自pe和ea。
[0028]
在一些实施方案中，pe:ea为6％时分离得到2-p1。
[0029]
在一些实施方案中，步骤3)suzuki偶联反应的催化试剂为xphos-pd-g3。
[0030]
在一些实施方案中，步骤3)suzuki偶联反应的碱性试剂为k3po4。
[0031]
在一些实施方案中，步骤3)suzuki偶联反应的过程如下：
[0032]
将2-p1、2-氟苯硼酸、k3po4溶于二氧六环中，然后加入xphos-pd-g3，110℃回流反应。
[0033]
在一些实施方案中，步骤3)还包括使用柱层析分离得到3-p1。
[0034]
在一些实施方案中，柱层析的洗脱剂选自pe和ea。
[0035]
在一些实施方案中，pe:ea为14％时分离得到3-p1。
[0036]
在一些实施方案中，步骤4)羧酸还原反应的过程如下：
[0037]
将3-p1溶于thf中，缓慢滴加还原剂溶液进行反应。
[0038]
在一些实施方案中，所述还原剂为libh4。
[0039]
在一些实施方案中，所述还原剂溶液为libh4的甲醇溶液。
[0040]
在一些实施方案中，反应条件为0℃反应2h，然后进行室温反应15h。
[0041]
在一些实施方案中，反应结束后加入酸。
[0042]
在一些实施方案中，所述酸为hcl。
[0043]
在一些实施方案中，步骤4)还包括对反应液进行萃取。
[0044]
在一些实施方案中，萃取试剂为乙酸乙酯/水。
[0045]
在一些实施方案中，步骤4)还包括使用柱层析分离得到4-p1。
[0046]
在一些实施方案中，柱层析的洗脱剂选自dcm和meoh。
[0047]
在一些实施方案中，dcm：meoh为4％。
[0048]
在一些实施方案中，步骤5)脱boc的过程如下：
[0049]
将4-p1加入到hcl/et2o中常温进行反应。
[0050]
在一些实施方案中，步骤5)中还包括对反应液进行旋干，洗涤。
[0051]
在一些实施方案中，洗涤试剂为pe、dcm和正己烷的混合溶液。
[0052]
在一些实施方案中，所述5-p1为黄色固体。
[0053]
在一些实施方案中，步骤6)进行磺酰化反应的步骤如下：
[0054]
将5-p1加入到dcm中，缓慢滴加et3n，使5-p1充分溶解，随后再滴加磺酰化试剂进行反应；
[0055]
在一些实施方案中，所述磺酰化试剂选自丹酰氯、2-甲氧基苯磺酰氯；
[0056]
在一些实施方案中，于0℃下缓慢滴加et3n。
[0057]
在一些实施方案中，所述步骤6)还包括将反应液进行淬灭。
[0058]
在一些实施方案中，所述步骤6)还包括对淬灭后的反应液进行萃取。
[0059]
在一些实施方案中，萃取试剂为二氯甲烷/水。
[0060]
优选地，步骤6)还包括柱层析步骤。
[0061]
优选地，柱层析的洗脱剂选自pe和ea 。
[0062]
优选地，洗脱剂pe和ea的比例为50％。
[0063]
本发明第三方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括本发明第一方面所述的化合物，其药学上可接受的盐、其光学异构体、其外消旋体、或其溶剂化物；或本发明第二方面所述的方法制备的化合物或中间体；
[0064]
在一些实施方案中，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
[0065]
本发明第四方面提供了一种调控crispr系统进行基因编辑的方法，给需要的对象施用本发明第一方面所述的化合物、其药学上可接受的盐、其光学异构体、其外消旋体、或其溶剂化物；或本发明第三方面所述的药物组合物。
[0066]
本发明第五方面提供了一种编辑一个或多个靶基因组区域的方法，向包含一个或多个基因组区域的一个或多个细胞施用
[0067]
1)crispr编辑系统；和
[0068]
2)本发明第一方面所述的化合物、其药学上可接受的盐、其光学异构体、其外消旋体、或其溶剂化物；或本发明第三方面所述的药物组合物。
[0069]
在一些实施方案中，crispr编辑系统在先施用于所述一个或多个细胞中。
[0070]
在一些实施方案中，所述一个或多个细胞是培养的细胞。
[0071]
在一些实施方案中，所述一个或多个细胞是生物体内的体内细胞。
[0072]
在一些实施方案中，所述一个或多个细胞是来自生物体的离体细胞。
[0073]
在一些实施方案中，所述crispr编辑系统为crispr-cas编辑系统。
[0074]
在一些实施方案中，1)和2)经由不同途径施用。
[0075]
在一些实施方案中，1)和2)经由相同途径施用。
[0076]
在一些实施方案中，所述crispr编辑系统由一种或多种载体递送。
[0077]
在一些实施方案中，所述一种或多种载体选自病毒载体、质粒或ssdna。
[0078]
在一些实施方案中，所述病毒载体选自逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体和/或单纯疱疹病毒载体。
[0079]
在一些实施方案中，所述crispr编辑系统通过合成rna递送。
[0080]
在一些实施方案中，所述crispr编辑系统通过纳米制剂递送。
[0081]
本发明第六方面提供了一种试剂产品，包括：
[0082]
1)第一试剂，所述的第一试剂为基因编辑抑制剂，所述的基因编辑抑制剂是本发明一方面所述的化合物、或其药学上可接受的盐、或其光学异构体或其外消旋体、或其溶剂化物；和
[0083]
2)第二试剂，所述的第二试剂是进行crispr基因编辑的试剂。
[0084]
在一些实施方案中，所述第二试剂包括选自下组的一种或多种试剂：
[0085]
1)cas9核酸酶、cas9核酸酶的编码序列、或表达cas9核酸酶的载体、或组合；
[0086]
2)grna、crrna、或用于产生所述grna或crrna的载体；
[0087]
3)用于同源定向修复的模板：单链核苷酸序列或质粒载体。
[0088]
本发明第七方面提供了一种用于编辑一个或多个靶基因组区域的试剂盒，所述试剂盒包括：
[0089]
1)第一容器，以及位于第一容器内的基因编辑抑制剂，所述的基因编辑抑制剂是
本发明第一方面所述的化合物、或其药学上可接受的盐、或其光学异构体或其外消旋体、或其溶剂化物；或本发明第三方面所述的组合物；
[0090]
2)第二容器，以及位于第二容器内的crispr编辑系统试剂；
[0091]
在一些实施方案中，所述crispr编辑系统为crispr-cas编辑系统。
[0092]
在一些实施方案中，所述crispr-cas编辑系统包括：
[0093]
至少一种向导rna元件和cas蛋白元件。
[0094]
在一些实施方案中，所述向导rna元件包含：1)含有与所述一个或多个靶基因组区域处的核苷酸序列基本上互补的核苷酸序列的靶向rna，或含有编码所述靶向rna的核苷酸序列的核酸；2)以及含有能够与所述靶向rna杂交的核苷酸序列的激活rna，或含有编码所述激活rna的核苷酸序列的核酸。
[0095]
在一些实施方案中，所述cas蛋白为cas9蛋白。
[0096]
在一优选的实施方案中，所述cas9蛋白为spcas9蛋白。
[0097]
在一些实施方案中，其中所述crispr编辑系统包含或包装在一种或多种载体中。
[0098]
在一些实施方案中，所述一种或多种载体选自病毒载体、质粒或ssdna。
[0099]
在一些实施方案中，所述病毒载体选自逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体和/或单纯疱疹病毒载体。
[0100]
本发明第八方面提供了本发明第一方面所述的化合物、本发明第三方面所述的药物组合物、本发明第六方面所述的试剂产品或本发明第七方面所述的试剂盒在调控基因组编辑中的应用。
[0101]
在一些实施方案中，所述基因组编辑针对致病基因、肿瘤相关基因(如致癌基因)、免疫相关基因(如与自身免疫相关的基因)、视觉相关基因、听觉相关、代谢相关、病毒感染相关、遗传疾病相关基因。
[0102]
在一些实施方案中，所述基因组编辑采用的是crispr编辑系统；
[0103]
在一些实施方案中，所述crispr编辑系统选自crispr-cas编辑系统。
[0104]
本发明第九方面提供了本发明第一方面所述的化合物、本发明第三方面所述的药物组合物、本发明第六方面所述的试剂产品或本发明第七方面所述的试剂盒在制备治疗疾病的药物中的应用。
[0105]
在一些实施方案中，所述疾病为癌症。
[0106]
在一些实施方案中，所述疾病为遗传性病症。
[0107]
本发明第十方面提供了本发明第一方面所述的化合物、本发明第三方面所述的药物组合物、本发明第六方面所述的试剂产品或本发明第七方面所述的试剂盒在构建疾病模型中的应用。
[0108]
在一些实施方案中，所述疾病模型为细胞疾病模型或动物疾病模型。
[0109]
在一些实施方案中，所述疾病模型用于筛选治疗疾病的药物。若待筛选物质可以治疗或缓解疾病的症状，则说明待筛选物质可以作为治疗疾病的潜在药物。
[0110]
本发明的有益效果：
[0111]
本发明提供了显著抑制基因编辑的化合物lxh0307和lxh0308，该化合物对于crispr-cas介导的剪切效率具有较强的抑制效果；
[0112]
本发明基于lxh0307/lxh0308和crispr编辑系统，为精准基因编辑提供了一种简
单而又高效的策略。
[0113]
本发明的化合物的制备合成方法，使用boc保护的策略，降低成本同时，增加了收率。
附图说明
[0114]
图1是spcas9抑制剂对体外酶切活性的影响图；其中，1a是抑制剂lxh0307，1b是抑制剂lxh0308。
具体实施方式
[0115]
本发明涉及crispr-cas9基因编辑平台的领域。特别地，本发明鉴定出了控制cas9基因编辑活性的ii-c型cas9抗-crispr(acr)抑制剂。此类acr抑制剂的共施用可以在下列方面提供有利的辅助：允许通过在空间或时间上控制cas9活性来进行安全且实用的生物学治疗法；控制在野生群体中的基于cas9的基因驱动器以减轻此类强制遗传计划的生态学后果；和对进入基因编辑技术的各种生物技术、农业和医学应用中的一般性研究作出贡献。
[0116]
crispr-cas系统是在细菌和古细菌中的适应性免疫系统，其帮助抵御捕食性病毒的攻击。这些系统使用小的rn(crispr rna(crrna))作为向导来鉴别其核酸靶标，所述核酸靶标然后被切割并失活。
[0117]
crispr-cas系统的一个亚组(称为“ii型”的那些)采用了称为cas9的蛋白质，并且该蛋白质(连同其rna向导者一起)已适应于作为革命性的基因组编辑平台。还已开发了在其核酸酶活性位点中携带突变的变体作为rna-向导的dna结合平台，以使得能够进行基因标记和转录控制。cas9已经被广泛用作研究工具，并且它还正用于宽范围的生物技术应用，和用于畜牧业、农业和其他地方。
[0118]
另外，crispr-cas9平台正在被开发为用于许多疾病的潜在地革命性的治疗方法，鉴于其修饰对疾病作出贡献的基因组座位、破坏病原体的基因组或引入在治疗上有用的序列(例如，用于癌症免疫疗法的嵌合抗原受体)的潜在能力。
[0119]
cas9应用的一个目前的限制是，其活性可以是非常难以控制的：它一般是具有活性的，只要它存在并且能够接近通常以所谓的单一向导rna(sgrna)形式的其crrna向导者。该控制缺乏可以因许多原因而引入困难。最值得注意的是，尽管cas9在仅编辑它被导向的基因组座位方面常常是高度准确的，但是脱靶效应并非不常见。脱靶cas9活性具有将突变引入至不期望的位点的不期望的后果。这对于许多目的来说是所关注的事，尤其是但非仅仅对于临床治疗法。
[0120]
已充分确立，细胞中存在的有功能的cas9/sgrna越多，并且cas9/sgrna持续越久那么脱靶效应的可能性就越大。虽然并不需要理解本发明的机制，但是认为一旦发生了“中靶”基因组编辑，持续的cas9/sgrna可以不再识别和编辑所期望的座位，由此完成其预期目的。尽管如此，仍然有功能的cas9/sgrna复合物可以继续在其他地方找到和编辑脱靶位点。
[0121]
本发明考虑了抑制cas9/sgrna活性的组合物。虽然并不需要理解本发明的机制，但是认为这些抑制剂化合物与具有活性的cas9/sgrna相互作用，并且作为“关闭开关”起作用，所述关闭开关使cas9/sgrna活性减小至最小量。和/或保持对于其预期目的来说必需的持续时间。进一步，认为cas9/sgrna抑制剂组合物可以将cas9/sgrna活性限制至特定的组
织或器官，或者限制至任何给定的一套使用者自定义的条件，通过当不希望其活性时，在任何地方、在任何时间或在任何环境下“触动关闭开关”。
[0122]
因此，本发明提供了一种调控基因编辑的化合物，所述化合物具有式(i)所述的结构：
[0123][0124]
其中，所述r是芳香环，所述芳香环可以被0、1、2或3个取代基r1取代，所述取代基r1独立地选自卤代、cn、c
1-c
4-烷基、c
1-c
4-卤代烷基、c
3-c
4-环烷基、or2、nr2r3；每个r2和r3独立地是h、c
1-c4烷基或或c
1-c
4-卤代烷基；
[0125]
在一些实施方案中，所述芳香环是苯环或萘。
[0126]
在一些实施方案中，所述r2和r3独立地是h、c
1-c4烷基。
[0127]
在一些实施方案中，所述衍生物具有如下任一所示的结构：
[0128][0129]
本发明所公开的化合物可以游离形式或在适当情况下作为其药学上可接受的衍生物存在。药学上可接受的衍生物包括但不限于药学上可接受的前药、盐、酯、此类酯的盐，或任何其他加合物或衍生物，其在施用于有需要的患者时能够直接地或间接地提供如本文其他地方描述的化合物，或者其代谢物或残余物。
[0130]
药物组合物
[0131]
本发明所述的药物组合物包括前述的化合物、其药学上可接受的盐、其光学异构体、其外消旋体、或其溶剂化物。
[0132]
术语“药学上可接受的盐”是指在合理的医学判断范围内适用于与人和低等动物的组织接触而没有不适当的毒性、刺激、过敏反应等的那些盐。
[0133]
药学上可接受的盐是本领域所熟知的。本文所公开的化合物的药学上可接受的盐包括衍生自合适的无机和有机酸和碱的盐。药学上可接受的无毒酸加成盐的实例是使用无机酸如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸或使用有机酸如乙酸、草酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸形成的或通过使用本领域中使用的其他方法如离子交换形成的氨基的盐。其他药学上可接受的盐包括藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、十二烷基硫酸盐、苹果酸盐、丙二酸盐、甲磺酸
盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一酸盐、戊酸盐等。另外的示例性盐包括己二酸盐、苯甲酸盐、柠檬酸盐、富马酸盐、马来酸盐或琥珀酸盐。衍生自适当碱的盐包括碱金属盐、碱土金属盐、铵盐和n+(c
1-4
烷基)4盐。
[0134]
在一些实施方案中，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。药学上可接受的载体、辅助剂或媒介物包括适合于特定预期剂型的任何或全部溶剂、稀释剂或其它液体媒介物、分散或混悬助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等。在remington:the science and practice of pharmacy,第21版,2005,d.b.troy,lippincott williams&wilkins,philadelphia著以及encyclopedia of pharmaceutical technology,j.swarbrick和j.c.boylan著,1988-1999,marcel dekker,new york(它们中的每一篇的内容通过引用并入本文)中公开了用于配制药学上可接受的组合物的各种载体及其制备的已知技术。除非任何常规的载体媒介物与本发明化合物不相容(例如由于产生任何不希望的生物学效应或在其它方面与药学上可接受的组合物的任意其它组分以有害的方式相互作用)，否则在本发明范围内预见到它的应用。
[0135]
可以充当药学上可接受的载体的物质的一些例子包括但不限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白如人血清白蛋白、缓冲物质如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸或山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质，如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶态二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯(polyacrylate)、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、羊毛脂；糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；粉末状黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石粉；赋形剂，如可可脂和栓剂用蜡；油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇类，如丙二醇或聚乙二醇；酯类，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；藻酸；无热原的水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇，和磷酸盐缓冲溶液，以及其它无毒的相容性润滑剂，如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁，而且根据配制人员的判断，着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、调味剂以及芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可以存在于组合物中。
[0136]
可以口服地、胃肠外地、通过吸入喷雾、局部地、直肠地、经鼻地、含服地、经阴道或经由植入的贮库(reservoir)施用本发明的组合物。本文中使用的术语“胃肠外”包括皮下、静脉内、肌肉内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、眼内、肝内、病灶内、硬膜外、椎管内和颅内注射或输注技术。优选地，口服地、腹膜内地或静脉内地施用所述组合物。本发明组合物的无菌可注射形式可为水性或油性混悬剂。这些混悬剂可以按照本领域已知的技术，使用合适的分散剂或润湿剂和助悬剂制备。无菌注射制剂也可以是在无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或混悬剂，例如在1,3-丁二醇中的溶液。可用的可接受的载体和溶剂是水、林格氏液溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的不挥发性油通常被用作溶剂或混悬介质。
[0137]
为此目的，可采用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油单脂或甘油二酯。脂肪酸(诸如油酸和它的甘油酯衍生物)可用于制备注射剂，天然的药学上可接受的油(诸如橄榄油或蓖麻油)也是如此，特别是其聚氧乙基化形式。这些油溶液或混悬剂还可以含有长链
醇稀释剂或分散剂，诸如羧甲基纤维素或通常用于配制药学上可接受的剂型(包括乳剂和混悬剂)中的类似分散剂。通常用于制备药学上可接受的固体、液体或其它剂型的其它常用表面活性剂(诸如吐温类、司盘类和其它乳化剂或生物利用度促进剂)也可以用于实现制剂的目的。
[0138]
可以以任何口服可接受的剂型(包括但不限于胶囊剂、片剂、水性混悬剂或溶液)来经口施用本发明的药学上可接受的组合物。在用于口服应用的片剂的情形下，常用的载体包括乳糖和玉米淀粉。通常也加入润滑剂，诸如硬脂酸镁。对于以胶囊剂形式口服施用，可用的稀释剂包括乳糖和干玉米淀粉。当口服使用需要水性混悬剂时，将活性成分与乳化剂和助悬剂组合。如果需要的话，还可以加入某些甜味剂、调味剂或着色剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、粉剂、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。
[0139]
用于口服施用的液体剂型包括、但不限于药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液、混悬剂、糖浆剂和酏剂。除了活性化合物以外，液体剂型可以含有本领域中通常使用的惰性稀释剂，例如，水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(具体地，棉籽油、花生油、玉米油胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯、及其混合物。除惰性稀释剂以外，口服组合物还可以包含辅助剂，诸如润湿剂、乳化剂和助悬剂、甜味剂、矫味剂和芳香剂。
[0140]
用于口服施用的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒。在这样的固体剂型中，将活性化合物与至少一种惰性的、药学上可接受的赋形剂或载体混合，所述赋形剂或载体是例如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或a)填充剂或增量剂，诸如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸，b)粘合剂诸如羧甲纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶，c)保湿剂诸如甘油，d)崩解剂诸如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠，e)溶液阻滞剂诸如石蜡，f)吸收促进剂诸如季铵化合物，g)润湿剂诸如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯，h)吸收剂诸如高岭土和皂粘土，和i)润滑剂诸如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠，及其混合物。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，所述剂型也可包含缓冲剂。
[0141]
方法
[0142]
本发明提供了一种调控crispr编辑系统进行基因编辑的方法，给需要的对象施用前面所述的化合物、其药学上可接受的盐、其光学异构体、其外消旋体、或其溶剂化物；或前面所述的药物组合物。
[0143]
如本文所用，“施用”是指将基因组编辑系统和/或前面所述的化合物/组合物接触、注射、分配、递送或应用于细胞或受试者。在一些实施方案中，施用是使基因组编辑系统和/或前面所述的化合物/组合物与细胞接触。在一些实施方案中，施用是将基因组编辑系统和/或前面所述的化合物/组合物递送至细胞。在一些实施方案中，施用是将基因组编辑系统和/或前面所述的化合物/组合物应用于细胞。在一些实施方案中，施用是将基因组编辑系统和/或前面所述的化合物/组合物注入细胞中。施用可在体内、离体或体外发生。向细胞施用基因组编辑系统和前面所述的化合物/组合物可以依序地进行。
[0144]
crispr编辑系统由一种或多种载体递送。
[0145]
在一些实施方案中，所述一种或多种载体选自病毒载体、质粒或ssdna。
[0146]“病毒载体”被定义为重组产生的病毒或病毒颗粒，其包含待在体内、离体或体外递送至宿主细胞中的多核苷酸。病毒载体的实例包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体、单纯疱疹病毒载体和嵌合病毒载体等。在其中基因转移由逆转录病毒载体介导的一些实施方案中，载体构建体是指包含逆转录病毒基因组或其部分的多核苷酸。
[0147]
在一些实施方案中，所述crispr编辑系统通过合成rna递送。
[0148]
在一些实施方案中，所述crispr编辑系统通过纳米制剂递送。
[0149]
本公开的一些实施方案涉及包含一种或多种载体的载体系统或载体本身。载体可设计用于在原核细胞或真核细胞中表达crispr转录物(例如核酸转录物、蛋白质或酶)。例如，crispr转录物可以在细菌细胞如大肠杆菌、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母细胞或哺乳动物细胞中表达。
[0150]
细胞可以是原代细胞、诱导多能干细胞(ipsc)、胚胎干细胞(hesc)、成体干细胞、祖细胞或细胞系。“原代细胞”是直接取自活组织并置于体外进行生长的细胞。原代细胞的群体倍增很少，并且在体外群体倍增具有有限的寿命。“干细胞”、“胚胎干细胞”和“诱导多能干细胞”是非特化且未分化的细胞，能够自我更新并且具有分化成具有特殊功能的不同类型细胞的潜力。“细胞系”包括衍生自一种细胞类型的细胞培养物或者可以无限增殖的一组相同类型的细胞。哺乳动物细胞系的非限制性实例可包括cd34细胞、293细胞、hek细胞、cho细胞、bhk细胞、cv-1细胞、jurkat细胞、hela细胞或它们的任何变体。
[0151]
在一些实施方案中，载体能够使用哺乳动物表达载体驱动哺乳动物细胞中一个或多个序列的表达。哺乳动物表达载体的实例包括pcdm8和pmt2pc。当用于哺乳动物细胞中时，表达载体的控制功能通常由一种或多种调控元件提供。例如，常用的启动子衍生自多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒、猿猴病毒40以及本文所公开的和本领域已知的其他启动子。其他启动子可包括例如ef1启动子或ef1α启动子。
[0152]
术语“编辑”等是指任何类型的工程改造、改变、修饰或调节(在每种情况下，包括但不限于通过基因敲除、基因标记、基因破坏、基因突变、基因插入、基因缺失、基因活化、基因沉默或基因敲入)。
[0153]
crispr编辑系统
[0154]
在本发明中，“基于crispr的系统”、“基于crispr的基因编辑系统”、“crispr-基因组编辑”、“crispr编辑系统”、“crispr-基因编辑”、“基于crispr-核酸内切酶的基因组编辑”等在本文中可互换使用，并且统称为基因组编辑系统，其包含一种或多种向导rna元件；以及一种或多种rna向导的核酸内切酶元件。向导rna元件包含含有与一个或多个靶基因组区域处的核苷酸序列基本上互补的核苷酸序列的靶向rna，或者含有编码靶向rna的核苷酸序列的核酸。rna向导的核酸内切酶元件包含通过向导rna元件被导向或带到靶基因组区域的核酸内切酶；或者包含编码这种核酸内切酶的核苷酸序列的核酸。这种基于crispr的基因编辑系统的实例包括基于crispr的系统，即crispr-cas系统或crispr-cpf系统。
[0155]
在本发明的具体实施方案中，crispr编辑系统选自crispr-cas系统。
[0156]
在一些实施方案中，所述crispr-cas编辑系统包括：
[0157]
至少一种向导rna元件和cas蛋白元件。
[0158]
术语“向导rna元件”、“向导rna”、“grna”、“grna分子”和“合成向导rna”可互换使用，并且是指包含与靶核酸序列杂交的靶向rna或者含有编码靶向rna的核苷酸序列的核酸的多核苷酸序列。grna的靶向rna包含靶向结构域，该靶向结构域包含与靶基因组区域处的核苷酸序列基本上互补的核苷酸序列。短语“基本上互补”意指在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50个或更多个核苷酸的区域上互补程度为至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％，或者是指两个核酸在严格条件下杂交。
[0159]
向导rna元件还可包含能够与靶向rna杂交的激活rna或含有编码激活rna的核苷酸序列的核酸。激活rna和靶向rna可经由接头环序列分离或融合为单个核酸，以形成单个grna分子。grna分子可包含许多结构域。例如，此类grna例如从5'至3'包含：靶向结构域(其与靶核酸互补)、第一互补结构域、连接结构域、第二互补结构域(与第一互补结构域互补)、近端结构域和任选的尾部结构域。
[0160]“第一互补结构域”与第二互补结构域具有基本互补性，并且可以在至少一些生理条件下形成双链区域。
[0161]“连接结构域”用于将单分子grna的第一互补结构域与第二互补结构域连接。连接结构域可以共价或非共价地连接第一互补结构域和第二互补结构域。
[0162]“近端结构域”的长度可为3-25个核苷酸，或者长度可为5-20个核苷酸。近端结构域可与天然存在的近端结构域共享同源性或由其衍生。
[0163]“尾部结构域”可以不存在，或者长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。尾部结构域可包含彼此互补并且在至少一些生理条件下形成双链区域的序列。
[0164]
向导rna元件可以与rna向导的核酸内切酶元件的核酸内切酶诸如cas核酸内切酶形成复合物(“grna/核酸酶复合物”)。grna/核酸酶复合物的实例是下文关于基于crisr的系统所述的crispr复合物。在一些实施方案中，crispr复合物包含与靶向rna复合的rna向导的核酸内切酶系统的核酸内切酶。在一些实施方案中，crispr复合物包含与靶向rna和激活rna复合的rna向导的核酸内切酶系统的核酸内切酶。
[0165]
靶向rna的靶向结构域促进grna/核酸酶复合物特异性靶向或归巢至靶核苷酸序列。在一些实施方案中，靶向结构域可为10-30bp，诸如15-25bp、18-22bp或20bp。
[0166]
用于设计grna的方法是本领域已知的，包括用于选择、设计和验证靶结构域的方法。
[0167]
在一些实施方案中，可使用rna向导的核酸内切酶，诸如cas酶(例如，ii型cas9蛋白)。在一些实施方案中，也可使用这种cas酶的修饰形式。
[0168]
在一些实施方案中，可使用来自除酿脓链球菌(s.pyogenes)和嗜热链球菌(s.thermophiles)之外的菌种的cas9蛋白。可获得并在本文中使用的另外的cas9蛋白菌种包括：燕麦食酸菌(acidovorax avenae)、胸膜肺炎放线杆菌(actinobacilluspleuropneumoniae)、产琥珀酸放线杆菌(actinobacillus succinogenes)、猪放线杆菌(actinobacillus suis)、放线菌属某种(actinomyces sp.)、cycliphilusdenitrificans、少食氨基单胞菌(aminomonas paucivorans)、蜡状芽孢杆菌(bacilluscereus)；史氏芽孢杆菌(bacillus smithii)、苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)、拟杆菌属某种(bacteroides sp.)、blastopirellula marina、
慢生根瘤菌属某种(bradyrhizobium sp.)、侧孢短芽孢杆菌(brevibacillus laterosporus)、结肠弯曲菌(campylobacter coli)、空肠弯曲菌(campylobacter jejuni)、海鸥弯曲菌(campylobacter lari)、candidatus puniceispirillum、解纤维梭菌(clostridiumcellulolyticum)、产气荚膜梭菌(clostridium perfingens)、拥挤棒状杆菌(corynebacterium accolens)、细长棒状杆菌(corynebacterium dolichum)、马氏棒状杆菌(corynebacterium matruchotii)、恒雄芝氏沟鞭藻玫瑰杆菌(dinoroseobactershibae)、细长真杆菌(eubacterium dolichum)、γ变形菌(gamma proteobacterium)、重氮营养葡糖醋杆菌(gluconacetobacter diazotrophicus)、haemoplzilus parainfluenzae、生痰嗜血杆菌(haemophilus sputorum)、加拿大螺杆菌(helicobacter canadensis)、同性恋螺杆菌(helicohacter cinaedi)、鼬鼠螺杆菌(helicobacter mustelae)、营养泥杆菌(llyobacter polytropus)、金格氏杆菌(kingella kingae)、卷曲乳杆菌(lactobacilluscrispatus)、伊氏李斯特菌(listeria ivanovii)、单核细胞增多性李斯特菌(listeriamonocytogenes)、李斯特氏菌科菌(listeriaceae bacterium)、甲基孢囊菌属某种(methylocystis sp.)、发孢甲基弯曲菌(methylosinus trichosporium)、羞怯动弯杆菌(mobiluncus mulieris)、杆状奈瑟氏菌(neisseria bacilliformis)、灰色奈瑟氏菌(neisseria cinerea)、浅黄奈瑟氏菌(neisseria flavescens)、乳糖奈瑟氏菌(neisserialactamica)、奈瑟氏菌属某种(neisseria sp.)、沃氏奈瑟氏菌(neisseria wadsworthii)、亚硝化单胞菌属某种(nitrosomonas sp.)、食清洁剂细小棒菌(parvibaculumlavamentivorans)、多杀巴斯德菌(pasteurella multocida)、phascolarctobacteriumsuccinatutells、蒲桃雷尔氏菌(ralstonia syzygii)、沼泽红假单胞菌(rhodopseudomonas palustris)、小红卵菌属某种(rhodovulum sp.)、米氏西蒙斯氏菌(simonsiella muelleri)、鞘氨醇单孢菌属某种(sphingomonas sp.)、sporolactobacillus vineae、路邓葡萄球菌(staphylococcus lugdunensis)、链球菌属某种(streptococcus sp.)、罕见小球菌属某种(subdoligranulum sp.)、运动替斯崔纳菌(tistrella mobilis)、密螺旋体属某种(treponema sp.)或艾森虹蝴肾杆菌(verminephrobacter eiseniae)。
[0169]
在一些实施方案中，基于crispr的系统的一种或多种元件衍生自包含内源crispr系统的特定生物体，诸如酿脓链球菌、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、土拉弗朗西斯菌(francisella tularensis)、普雷沃菌属某种(prevotella sp.)、氨基酸球菌属某种(acidaminococcus sp.)和毛螺菌属某种(lachnospiraceae sp.)。通常，基于crispr的在本发明中，系统通过促进在靶基因组区域或靶序列(在内源crispr系统的上下文中也称为原型间隔序列)的位点处形成crispr复合物的元件来表征。在形成crispr复合物的上下文中，“靶序列”是指向导序列被设计成与其具有基本互补性的序列，其中靶序列与向导序列之间的杂交促进crispr复合物的形成。不一定需要完全互补，只要有足够的互补性引起杂交并促进crispr复合物的形成即可。靶序列可包含任何多核苷酸，诸如dna或rna多核苷酸。在一些实施方案中，靶序列位于细胞的细胞核或细胞质中。在一些实施方案中，靶序列可以在真核细胞的细胞器诸如线粒体或叶绿体内。
[0170]
在一些实施方案中，基于crispr的系统是crispr-cas9系统。crispr-cas9系统的靶向rna包含crispr靶向rna(crrna)，并且crispr-cas 9系统的激活rna包含反式激活
crispr rna(tracrna)。crispr-cas9系统的cas蛋白元件采用cas9蛋白。crrna和tracrrna可以分开或经由接头环序列组合成单个rna构建体。这种组合的rna构建体被称为单向导rna(sgrna；或向导rna)。
[0171]
编辑一个或多个靶基因组区域的试剂盒
[0172]
本发明提供了用于编辑一个或多个靶基因组区域的试剂盒，所述试剂盒包括：
[0173]
1)第一容器，以及位于第一容器内的基因编辑抑制剂，所述的基因编辑抑制剂是前面所述的化合物、或其药学上可接受的盐、或其光学异构体或其外消旋体、或其溶剂化物；或前面所述的组合物；
[0174]
2)第二容器，以及位于第二容器内的crispr编辑系统试剂。
[0175]
在一些实施方案中，基于crispr的基因组编辑系统包括crispr序列、反式激活cr(tracr)序列、向导序列和cas核酸内切酶或者它们的任何组合。向细胞施用spcas9抑制剂之后，hdr基因组编辑效率得到提高。
[0176]
在一些实施方案中，crispr编辑系统包括含有crispr序列的rna(crrna)、含有反式激活cr(tracr)序列的rna(tracrrna)和cas核酸内切酶或者它们的任何组合。
[0177]
在一些实施方案中，crispr编辑系统包括crispr序列、向导序列和cas核酸内切酶或者它们的任何组合。
[0178]
调控基因编辑的化合物和基因组编辑系统、试剂盒及其组合物的使用
[0179]
特定基因组区域精确改变的基因组编辑具有很大的治疗潜力。
[0180]
在一些实施方案中，本文提供了修饰一种或多种基因或蛋白质的表达的方法，所述方法包括向包含一个或多个靶基因组区域的一个或多个细胞施用本文所述的基因组编辑系统和cas9抑制剂，其中基因组编辑系统与靶基因的一个或多个靶基因组区域的核酸相互作用，导致编辑一个或多个靶基因组区域，并且其中编辑修饰与靶基因相关的下游基因和/或蛋白质的表达。
[0181]
编辑一个或多个靶基因组区域包括细胞基因组的任何种类的遗传操纵或工程改造。一个或多个靶基因组区域的编辑可包括由一种或多种核酸内切酶进行的细胞中基因组区域的插入、缺失或替换。基因组区域包含细胞中的遗传物质，例如dna、rna、多核苷酸和寡核苷酸。细胞中的基因组区域还包含细胞中包含的线粒体或叶绿体的基因组。
[0182]
cas9抑制剂可以是任何cas9抑制剂。cas9抑制剂可以是引起cas9抑制的任何化合物或物质。cas9抑制剂可以是化合物、小分子、抗体或核苷酸序列。在一些实施方案中，cas9抑制剂是由结构式lxh0307和lxh0308表示的化合物。
[0183]
在一些实施方案中，本文提供了治疗患有需要编辑受试者细胞中的一个或多个靶基因组区域的疾病或病状的受试者的方法，所述方法包括向一个或多个细胞施用基因组编辑系统和cas9抑制剂。
[0184]
在一些实施方案中，本文提供的方法用于修饰途径中的基因、rna分子、蛋白质、蛋白质组或下游蛋白质的表达。这种修饰可用于治疗获得性的或遗传性的或由于衰老过程引起的疾病、功能障碍、异常的生理稳态。如本文所用，术语“修饰”包括调节、增强、减少、增加、插入、缺失、敲除、敲入等。
[0185]
本领域的技术人员应当理解，获得性的或遗传性的或以其他方式获得的疾病涉及包括参与基因或蛋白质功能在内的稳态机制的失调。为此，技术人员可以使用本文提供的
方法来调节、修饰、增强、减少或提供受试者中的其他方面的基因功能。
[0186]
修饰细胞中基因的表达和随后的蛋白质表达可通过本文提供的方法来实现，例如通过在外显子、内含子、转录起始位点、启动子区域、增强子区域、沉默子区域、绝缘子区域、抗阻抑因子、翻译后调控元件、多腺苷酸化信号(例如最小poly a)、保守区域、转录因子结合位点或它们的任何组合的任一者中特异性编辑(例如，置换、插入或缺失，它们的任何组合)核酸序列来实现。
[0187]
在一些实施方案中，本文提供的方法、试剂盒和组合物用于治疗患有癌症的受试者。治疗患有癌症或癌症相关病症的受试者的方法包括向受试者的细胞施用cas9抑制剂和基因组编辑系统。cas9抑制剂和基因组编辑系统的施用可以是体内的或离体的。
[0188]
癌症可以是任何类型的癌症。癌症包括实体瘤，诸如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、肾癌、胃癌、结肠癌、睾丸癌、头颈癌、胰腺癌、脑癌、黑素瘤和其他组织器官肿瘤，以及血细胞癌，诸如淋巴瘤和白血病，包括急性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、t细胞淋巴细胞白血病和b细胞淋巴瘤。癌症可包括黑素瘤、白血病、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、淋巴瘤、神经胶质瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病，以及胰腺癌、乳腺癌、甲状腺癌、卵巢癌、子宫癌、睾丸癌、垂体癌、肾癌、胃癌、食道癌和直肠癌。
[0189]
在一些实施方案中，本文提供的试剂盒和组合物用于治疗患有以下癌症中的任一种或多种的受试者：急性淋巴细胞白血病(all)、急性髓性白血病、肾上腺皮质癌、aids相关癌症、aids相关淋巴瘤、肛门癌、附件癌、星形细胞瘤、儿童小脑或大脑基底细胞癌、胆管癌、肝外(见胆管癌)膀胱癌、骨肿瘤、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、脑干胶质瘤、脑癌、小脑星形细胞瘤脑肿瘤、大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤脑肿瘤、室管膜瘤脑肿瘤、成神经管细胞瘤脑肿瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤脑肿瘤、视觉传导通路和下丘脑神经胶质瘤脑肿瘤、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌、伯基特氏淋巴瘤、类癌肿瘤、儿童类癌肿瘤、胃肠道原发灶不明癌、原发性中枢神经系统淋巴瘤、儿童小脑星形细胞瘤、儿童大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、宫颈癌、儿童期癌症、软骨肉瘤、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性骨髓增生性病症、结肠癌、皮肤t细胞淋巴瘤、促纤维增生性小圆细胞肿瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、上皮样血管内皮瘤(ehe)、食道癌、尤文氏肿瘤家族的尤文氏肉瘤、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼内黑色素瘤(眼癌)、成视网膜细胞瘤(眼癌)、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道间质瘤(gist)、颅外、性腺外或卵巢生殖细胞瘤、妊娠滋养细胞肿瘤、脑干的胶质瘤、胶质瘤、儿童大脑星形细胞瘤胶质瘤、儿童视觉传导通路和下丘脑神经胶质瘤、胃类癌、毛细胞白血病、头颈癌、心脏肿瘤、肝细胞(肝)癌、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、儿童下丘脑和视觉传导通路胶质瘤、眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌(内分泌胰腺)、卡波西肉瘤、肾癌(肾细胞癌)、喉癌、白血病、急性淋巴细胞白血病(又称急性淋巴细胞性白血病)、急性髓性白血病(又称急性骨髓性白血病)、慢性淋巴细胞白血病(又称慢性淋巴细胞性白血病)、慢性髓细胞性白血病(又称慢性骨髓白血病)、多毛细胞白血病、唇癌和口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌(原发性)、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、淋巴瘤、艾滋病相关淋巴瘤、皮肤t细胞淋巴瘤伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金(除霍奇金之外的所有淋巴瘤的旧分类)淋巴瘤、原发性中枢神经系统巨球蛋白血症、男性乳腺癌、骨恶性纤维组织细胞瘤/骨肉瘤、成神经管细胞瘤、儿童黑色素瘤、眼内(眼)黑色素瘤、merkel细胞癌、间皮瘤、成人恶性间皮瘤、儿童原发灶隐匿转移性鳞状颈癌、口腔癌、多发性内分泌肿瘤综合征多发性骨髓瘤/浆细胞瘤、蕈样肉芽肿、
骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增生性疾病、骨髓性白血病、慢性粒细胞白血病、成人急性髓性白血病、儿童多发性急性骨髓瘤(骨髓癌)、骨髓增生性病症、慢性粘液瘤、鼻腔癌和鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、少突神经胶质瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌(表面上皮-间质瘤)、卵巢生殖细胞瘤、卵巢低度恶性潜在肿瘤、胰腺癌、胰岛细胞胰腺癌、鼻窦癌和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体星形细胞瘤、松果体生殖细胞瘤、松果体母细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤、垂体腺瘤、浆细胞瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性中枢神经系统性淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌(肾癌)、肾盂和输尿管癌、移行细胞癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、尤文肿瘤家族肉瘤、卡波西肉瘤、软组织肉瘤、子宫肉瘤、s
é
zary综合征、皮肤癌(非黑色素瘤)、皮肤癌(黑色素瘤)、merkel细胞皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌-见皮肤癌(非黑色素瘤)、原发灶隐匿转移性鳞状颈癌、胃癌、幕上原始神经外胚层肿瘤、皮肤t细胞淋巴瘤(蕈样肉芽肿和s
é
zary综合征)、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、妊娠滋养细胞肿瘤、成人未知原发部位癌、儿童未知原发部位癌、输尿管和肾盂移行细胞癌、尿道癌、子宫癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、阴道癌、视觉传导通路和下丘脑神经胶质瘤、外阴癌、巨球蛋白血症或肾母细胞瘤(肾癌)。
[0190]
在一些实施方案中，本文提供的方法、试剂盒或组合物用于治疗患有遗传性病症的受试者。治疗患有遗传性疾病或病状或遗传性病症的受试者的方法包括向受试者的细胞施用cas9抑制剂和基因组编辑系统cas9抑制剂和基因组编辑系统的施用可以是体内的或离体的。
[0191]
遗传性病症可以由染色体区域中的突变或复制(例如，由点突变、缺失、插入、移码、染色体复制或缺失)引起。遗传性病症可以是任何遗传性病症。术语“遗传性病症”或“遗传性疾病”包括受试者基因组中引起或可能引起疾病的遗传性或获得性突变。
[0192]
在一些实施方案中，遗传性病症包括但不限于22q11.2缺失综合征、angelman综合征、卡纳万病、charcot-marie-tooth病、色盲、猫叫综合征、唐氏综合征、杜氏肌营养不良症、血色病、血友病、klinefelter综合征、多发性神经纤维瘤、苯丙酮尿症、多囊性肾病、prader-willi综合征、镰状细胞病、脊髓性肌萎缩症、脊髓性肌萎缩症、tay-sachs病、特纳综合征、血红蛋白病或它们的任何组合。
[0193]
如本文所用，“治疗”或“缓和”或“改善”可互换使用。这些术语是指用于获得有益或期望结果的方法，包括但不限于治疗有益效果和/或预防有益效果。所谓治疗有益效果意指治疗中对一种或多种疾病、病状或症状的任何治疗相关的改善或作用。对于预防有益效果，可将组合物施用于有发展特定疾病、病状或症状风险的受试者，或施用于报告疾病的一种或多种生理症状的受试者，即使所述疾病、病状或症状尚未表现出来。这些术语还意指对哺乳动物例如人的疾病的治疗，包括(a)抑制疾病，即阻止或防止其发展；(b)缓解疾病，即引起疾病状态消退；或(c)治愈疾病。
[0194]
在实施方案中，通过施用cas9抑制剂和基因组编辑系统来靶向特定的转录后控制调节子以调节、修饰、增强或降低活性。
[0195]
在一些实施方案中，通过施用cas9抑制剂和基因组编辑系统来调节、增强或降低与细胞周期相关的遗传途径的活性。
[0196]
在一些实施方案中，通过向细胞施用cas9抑制剂和基因组编辑系统，调节、增强或降低与血管生成相关的基因的活性。
[0197]
在一些实施方案中，通过向细胞施用cas9抑制剂和基因组编辑系统，调节、增强或降低与线粒体功能相关的遗传途径和/或基因的活性。
[0198]
在一些实施方案中，与dna损伤或基因组不稳定性相关的遗传途径和/或基因的活性被调节、增强或降低。
[0199]
在一些实施方案中，编码哺乳动物转录因子的基因被调节、增强、减少或提供给细胞。
[0200]
在一些实施方案中，细胞是患病的或携带突变体的细胞。可操纵这些细胞以治疗疾病，例如纠正突变或改变细胞的表型，例如抑制癌细胞的生长。例如，细胞与本文描述的一种或多种疾病或病状相关。
[0201]
以下结合附图对本技术的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本技术，并不用于限制本技术。
[0202]
实施例1小分子化合物的合成
[0203]
一、环加成反应
[0204]
1、将乙醛酸乙酯(20.4g，110mmol)和4-溴苯胺(17g，100mmol)加入到200ml的甲苯溶液中，然后再加入10g mgso4，在0℃下搅拌30分钟；
[0205]
2、将1-叔丁氧羰基-2，3-二氢吡咯(17g，100mmol)加入到60ml甲苯中，在0℃下加入三氟甲基磺酸钪；
[0206]
3、将步骤1和步骤2的反应液加在一起，室温搅拌6h；
[0207]
4、乙酸乙酯/水萃取，旋干，称重29.75g，产率68％。
[0208][0209]
二、手性分离
[0210]
1、柱层析pe:ea＝6％，得到2-p1，白色固体17g，产率57％。
[0211]
2、柱层析pe:ea＝8％-15％，得到2-p2，无色油状8.5g，产率29％。
[0212][0213]
三、suzuki偶联
[0214]
1、将2-p1(17g，40mmol)，2-氟苯硼酸(6.7g，48mmol)，k3po4(25.4g，120mmol)溶于二氧六环中(70ml)，然后加入xphos-pd-g3(3.2g，4mmol)，110℃回流反应20h；
[0215]
2、抽滤，旋干；
[0216]
3、柱层析(pe:ea＝14％)，旋干得到白色固体3-p1 13g，产率73％。
[0217][0218]
四、羧酸还原
[0219]
1、将3-p1(13g，28mmol)溶于100ml thf中，然后在0℃下，缓慢滴加溶于甲醇(1ml)的libh4(1.8g，88mmol)，反应2h，接着室温反应15h；最后加入1n hcl；
[0220]
2、乙酸乙酯/水萃取，旋干；
[0221]
3、柱层析(dcm:meoh＝4％)，旋干得到白色固体4-p1 10.5g，产率90％。
[0222][0223]
五、脱boc保护
[0224]
1、将10.5g 4-p1(26mmol)加入到40ml hcl/et2o中，常温下搅拌6h；
[0225]
2、旋干反应液，用pe(2
×
50ml)，dcm(2
×
50ml)，n-hexane(2
×
100ml)的混合液洗两次；
[0226]
3、抽滤，旋干得到黄色固体5-p1 7.9g，产率99％。
[0227][0228]
六、磺酰化反应
[0229]
6.1lxh0307的制备
[0230]
将5-p1(280mg，1mmol)加入到10ml dcm中，然后在冰浴0℃下，缓慢滴加et3n，使5-p1充分溶解，随后再滴加丹酰氯(270mg,1mmol)，搅拌反应0.5h；反应完毕，加水(10ml)淬灭；dcm/w萃取，旋干；柱层析pe:ea＝50％，旋干得黄色荧光固体lxh0307，100mg，产率20％。
[0231]
6.2lxh0308的制备
[0232]
将5-p1(280mg，1mmol)加入到10ml dcm中，然后在冰浴0℃下，缓慢滴加et3n，使5-p1充分溶解，随后再滴加2-甲氧基苯磺酰氯(270mg,1mmol)，搅拌反应0.5h；反应完毕，加水
(10ml)淬灭；dcm/w萃取，旋干；柱层析pe:ea＝50％，旋干得淡黄色固体lxh0307 180mg，产率37％。
[0233]
6.3 6-p1-1的制备
[0234]
1、将5-p1(150mg，1mmol)加入到10mldcm中，然后在0℃下，缓慢滴加et3n，使5-p1充分溶解，随后再滴加对甲苯磺酰氯(190mg，1mmol)，反应30分钟；
[0235]
2、反应完毕，加入10ml水淬灭；
[0236]
3、二氯甲烷/水萃取，旋干；
[0237]
4、柱层析：石油醚：乙酸乙酯＝10％，旋干得到白色固体6-p1，181mg，产率80％。
[0238]
七、手性柱分离
[0239]
6-p1手性制备液相分离得到6-p1-1。
[0240]
实施例2小分子化合物的有效性验证
[0241]
使用inovogen公司的cas9体外酶切试剂盒检测cas9体外酶切活性，评价合成的lxh0307、lxh0308与6-p1-1小分子化合物对cas9蛋白的剪切效率的影响。实验步骤按试剂盒说明书进行。
[0242]
1、cas9切割反应：
[0243]
按照说明书配置cas9体外切割反应缓冲液，吹吸混合均匀，进行反应；
[0244]
反应程序：37℃30min；85℃10min。
[0245]
2、产物检测
[0246]
1)在反应体系中加入5μlcleaner，混匀。55℃孵育5min；
[0247]
2)取5μl进行凝胶电泳检测，并进行统计。
[0248]
3、结果
[0249]
结果如图1所示，与对照组dmso相比，化合物lxh0307、lxh0308明显抑制了cas9蛋白的剪切效率，且抑制效率明显高于6-p1-1。
[0250]
以上结合附图详细描述了本技术的优选实施方式，但是，本技术并不限于上述实施方式中的具体细节，在本技术的技术构思范围内，可以对本技术的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本技术的保护范围。
[0251]
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本技术对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0252]
此外，本技术的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本技术的思想，其同样应当视为本技术所公开的内容。

技术特征：
1.一种调控基因编辑的化合物，其特征在于，所述化合物具有式(i)所述的结构：其中，所述r是芳香环，所述芳香环可以被0、1、2或3个取代基r1取代，所述取代基r1独立地选自卤代、cn、c
1-c
4-烷基、c
1-c
4-卤代烷基、c
3-c
4-环烷基、or2、nr2r3；每个r2和r3独立地是h、c
1-c4烷基或或c
1-c
4-卤代烷基；优选地，所述芳香环是苯环或萘；优选地，所述r2和r3独立地是h、c
1-c4烷基；优选地，所述化合物的结构如下所示：2.一种制备权利要求1所述的化合物的方法，其特征在于，所述方法包括：1)使用溴苯胺、乙醛酸乙酯，和boc-二氢吡咯反应合成化合物2-p；2)使用柱层析方法分离得到化合物2-p1和2-p2；3)将化合物2-p1与2-氟苯硼酸进行suzuki偶联反应生成化合物3-p1；4)将化合物3-p1进行羧酸还原反应生成化合物4-p1；5)化合物4-p1在酸性条件下脱boc生成化合物5-p1；6)将化合物5-p1进行磺酰化反应生成lxh0307和lxh0308。优选地，步骤1)合成化合物2-p的方法如下：将乙醛酸乙酯和4-溴苯胺加入到甲苯溶液中，然后加入mgso4搅拌得到反应液1；将boc-二氢吡咯加入甲苯溶液中，然后加入三氟甲基磺酸钪反应得到反应液2；将反应液1和反应液2加在一起反应，萃取旋干；优选地，在0℃下搅拌得到反应液1；优选地，在0℃下加入三氟甲基磺酸钪；优选地，萃取试剂为乙酸乙酯/水；优选地，步骤2)柱层析中的洗脱剂选自pe和ea；优选地，pe:ea为6％时分离得到2-p1；优选地，步骤3)suzuki偶联反应的催化试剂为xphos-pd-g3；优选地，步骤3)suzuki偶联反应的碱性试剂为k3po4；优选地，步骤3)suzuki偶联反应的过程如下：将2-p1、2-氟苯硼酸、k3po4溶于二氧六环中，然后加入xphos-pd-g3，110℃回流反应；优选地，步骤3)还包括使用柱层析分离得到3-p1；
优选地，柱层析的洗脱剂选自pe和ea；优选地，pe:ea为14％时分离得到3-p1；优选地，步骤4)羧酸还原反应的过程如下：将3-p1溶于thf中，缓慢滴加还原剂溶液进行反应；优选地，所述还原剂为libh4；优选地，所述还原剂溶液为libh4的甲醇溶液；优选地，反应条件为0℃反应2h，然后进行室温反应15h；优选地，反应结束后加入酸；优选地，所述酸为hcl；优选地，步骤4)还包括对反应液进行萃取；优选地，萃取试剂为乙酸乙酯/水；优选地，步骤4)还包括使用柱层析分离得到4-p1；优选地，柱层析的洗脱剂选自dcm和meoh；优选地，dcm：meoh为4％；优选地，步骤5)脱boc的过程如下：将4-p1加入到hcl/et2o中常温进行反应；优选地，步骤5)中还包括对反应液进行旋干，洗涤；优选地，洗涤试剂为pe、dcm和正己烷的混合溶液；优选地，所述5-p1为黄色固体；优选地，步骤6)进行磺酰化反应的步骤如下：将5-p1加入到dcm中，缓慢滴加et3n，使5-p1充分溶解，随后再滴加磺酰化试剂进行反应；优选地，所述磺酰化试剂选自丹酰氯、2-甲氧基苯磺酰氯；优选地，于0℃下缓慢滴加et3n；优选地，所述步骤6)还包括将反应液进行淬灭；优选地，所述步骤6)还包括对淬灭后的反应液进行萃取；优选地，萃取试剂为二氯甲烷/水；优选地，步骤6)还包括柱层析步骤；优选地，柱层析的洗脱剂选自pe和ea；优选地，洗脱剂pe和ea的比例为50％。3.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1所述的化合物、其药学上可接受的盐、其光学异构体、其外消旋体、或其溶剂化物；或权利要求2所述的方法制备的化合物或中间体；优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。4.一种调控crispr编辑系统进行基因编辑的方法，其特征在于，给需要的对象施用权利要求1所述的化合物、其药学上可接受的盐、其光学异构体、其外消旋体、或其溶剂化物；或权利要求3所述的药物组合物。5.一种编辑一个或多个靶基因组区域的方法，其特征在于，向包含一个或多个基因组区域的一个或多个细胞施用
1)crispr编辑系统；和2)权利要求1所述的化合物、其药学上可接受的盐、其光学异构体、其外消旋体、或其溶剂化物；或权利要求3所述的药物组合物；优选地，crispr编辑系统在先施用于所述一个或多个细胞中；优选地，所述一个或多个细胞是培养的细胞；优选地，所述一个或多个细胞是生物体内的体内细胞；优选地，所述一个或多个细胞是来自生物体的离体细胞；优选地，所述crispr编辑系统为crispr-cas编辑系统；优选地，1)和2)经由不同途径施用；优选地，1)和2)经由相同途径施用；优选地，所述crispr编辑系统由一种或多种载体递送；优选地，所述一种或多种载体选自病毒载体、质粒或ssdna；优选地，所述病毒载体选自逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体和/或单纯疱疹病毒载体；优选地，所述crispr编辑系统通过合成rna递送；优选地，所述crispr编辑系统通过纳米制剂递送。6.一种试剂产品，其特征在于，包括：1)第一试剂，所述的第一试剂为基因编辑抑制剂，所述的基因编辑抑制剂是权利要求1所述的化合物、或其药学上可接受的盐、或其光学异构体或其外消旋体、或其溶剂化物；和2)第二试剂，所述的第二试剂是进行crispr基因编辑的试剂；优选地，所述第二试剂包括选自下组的一种或多种试剂：1)cas9核酸酶、cas9核酸酶的编码序列、或表达cas9核酸酶的载体、或组合；2)grna、crrna、或用于产生所述grna或crrna的载体；3)用于同源定向修复的模板：单链核苷酸序列或质粒载体。7.一种用于编辑一个或多个靶基因组区域的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：1)第一容器，以及位于第一容器内的基因编辑抑制剂，所述的基因编辑抑制剂是权利要求1所述的化合物、或其药学上可接受的盐、或其光学异构体或其外消旋体、或其溶剂化物；或权利要求3所述的组合物；2)第二容器，以及位于第二容器内的crispr编辑系统试剂；优选地，所述crispr编辑系统为crispr-cas编辑系统；优选地，所述crispr-cas编辑系统包括：至少一种向导rna元件和cas蛋白元件；优选地，所述向导rna元件包含：1)含有与所述一个或多个靶基因组区域处的核苷酸序列基本上互补的核苷酸序列的靶向rna，或含有编码所述靶向rna的核苷酸序列的核酸；2)以及含有能够与所述靶向rna杂交的核苷酸序列的激活rna，或含有编码所述激活rna的核苷酸序列的核酸；优选地，所述cas蛋白为cas9蛋白；优选地，所述cas9蛋白为spcas9蛋白；优选地，其中所述crispr编辑系统包含或包装在一种或多种载体中；
优选地，所述一种或多种载体选自病毒载体、质粒或ssdna；优选地，所述病毒载体选自逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体和/或单纯疱疹病毒载体。8.权利要求1所述的化合物、权利要求3所述的药物组合物、权利要求6所述的试剂产品或权利要求7所述的试剂盒在调控基因组编辑中的应用；优选地，所述基因组编辑针对致病基因、肿瘤相关基因(如致癌基因)、免疫相关基因(如与自身免疫相关的基因)、视觉相关基因、听觉相关、代谢相关、病毒感染相关、遗传疾病相关基因；优选地，所述基因组编辑采用的是crispr编辑系统；优选地，所述crispr编辑系统选自crispr-cas编辑系统。9.权利要求1所述的化合物、权利要求3所述的药物组合物、权利要求6所述的试剂产品或权利要求7所述的试剂盒在制备治疗疾病的药物中的应用；优选地，所述疾病选自癌症或遗传性病症。10.权利要求1所述的化合物、权利要求3所述的药物组合物、权利要求6所述的试剂产品或权利要求7所述的试剂盒在构建疾病模型中的应用；优选地，所述疾病模型为细胞疾病模型或动物疾病模型；优选地，所述疾病模型用于筛选治疗疾病的药物。

技术总结
本发明公开了LXH0307、LXH0308作为基因编辑的小分子抑制剂及其应用，LXH0307、LXH0308具有更强抑制基因编辑活性的能力。本发明同时提供了LXH0307、LXH0308的合成方法以及包含LXH0307、LXH0308的组合物、试剂产品和试剂盒及其应用。及其应用。及其应用。


技术研发人员：李慧艳 吴敏 何新华 宋增庆 张学敏 李爱玲 周涛 张宇程
受保护的技术使用者：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
技术研发日：2022.03.16
技术公布日：2022/5/25