一种通过模拟体内消化过程制作的粪便移植菌的培养基的方法与流程

1.本发明属于培养基制备的技术领域，尤其是指一种通过模拟体内消化过程制作的粪便移植菌的培养基的方法。


背景技术：

2.目前常用于扩培、分离粪便菌的培养基之一为mrs培养基，该配方虽然能对大部分菌有较好的扩培效果，但mrs是不可食用的培养基，在体外虽能对菌进行扩培，但在对扩培好的菌进行添加利用时，需要对残留的mrs进行离心洗涤等步骤，该步骤繁琐、对菌活有一定程度的损失、成本较高。另外，粪便移植菌是在粪便中成长的，菌群成长倾向性和生长状况与“粪便”的组成、形态有关。所以可以制造“人工粪便”专门作为移植菌的培养基，那么粪便移植菌就可以在可重复、可控的条件下生长，目前仍然没有较好的方法制造。基于以上的不足与需求，急需寻求一种制备移植菌的培养基的方法。


技术实现要素：

3.为解决上述技术问题，本发明提供了一种通过模拟体内消化过程制作的粪便移植菌的培养基的方法。在制作“粪便”的过程中，胆盐对菌的损伤作用以及进食食物的浓度经过反复研究后，对消化液进行优化，去除了消化液中的胆盐，避免了其对菌的伤害；此外，挑选出了最适的食物浓度。从而克服了无法重复性地准确生产“粪便”来培养粪便移植菌，并且解决了传统mrs培养基对粪便移植菌没有特异性的问题。
4.本发明的第一个目的在于提供一种通过模拟体内消化过程制作的粪便移植菌的培养基的方法，包括以下步骤：
5.s1：将食物与模拟胃液混合得到混合液1，将混合液1的ph值调至1.5-6.5，混合反应得到胃消化产物；所述食物选自蛋白质、糖类和矿物质中的一种或多种；
6.s2：将s1中所得胃消化产物的ph值调至预设值6.5-8.5，得到混合液2，并与模拟肠液混合，混合反应得到肠消化产物；
7.s3：将s2中所得肠消化产物进行灭菌灭活除杂，得到所述培养基。
8.在本发明的一个实施例中，步骤s1中，使用盐酸调节混合液1的ph值。
9.在本发明的一个实施例中，步骤s1中，食物与模拟胃液的质量比为1:2-2:1。
10.在本发明的一个实施例中，步骤s1中，所述模拟胃液中含有胃蛋白酶或/和胃脂肪酶，且所述胃蛋白酶含量为400-4000u/ml；所述模拟胃液的ph值为1.5-5。
11.在本发明的一个实施例中，步骤s1中，搅拌混合反应条件：搅拌、震荡、蠕动或挤压的速率为50-150rpm，反应温度为33-40℃，反应时间1-4h。
12.在本发明的一个实施例中，步骤s2中，所述模拟肠液中含有胰蛋白酶，还可以包括其他复合酶或胆盐，所述其他复合酶选自糜蛋白酶、胰脂肪酶和胰淀粉酶中的一种或多种，其中胰蛋白酶含量为150-250u/ml；所述模拟肠液的胆盐含量0-40mm，所述模拟肠液的ph值
为6.5-8.5。
13.在本发明的一个实施例中，步骤s2中，使用氢氧化钠或碳酸氢钠调节胃消化产物的ph值。
14.在本发明的一个实施例中，步骤s2中，搅拌混合反应条件：搅拌、震荡、蠕动或挤压的速率为50-150rpm，反应温度为33-40℃，反应时间1-6h。
15.在本发明的一个实施例中，步骤s2中，当所述模拟肠液含有胆盐时，则需要去除所得肠消化产物中的胆盐；去除胆盐的方法为透析、离心或过滤。
16.在本发明的一个实施例中，步骤s3中，所述灭菌灭活的条件：温度为80-121℃、时间为15-30min。
17.本发明的第二个目的在于提供所述的方法制备得到的粪便移植菌的培养基。
18.本发明的第三个目的在于提供所述的培养基在培养粪便移植菌中的应用。
19.本发明以特定浓度的脱脂牛奶作为食物，模拟体内胃肠消化过程将该牛奶进行消化，消化过程中，蛋白质被酶解成多肽及小分子氨基酸，多糖被水解成葡萄糖，这些消化产物可作为肠道菌群的营养成分。将消化后的产物直接作为培养基，用于制作标准人工粪便来培养粪便移植菌。该培养基制作的过程添加的脱脂牛奶是经过删选后特定浓度的，消化液是经过优化后的，制备得到的脱脂牛奶消化产物其营养成分与mrs相同的同时，该脱脂奶消化产物作为“人工粪便”能对某些粪菌达到高密度发酵的效果，此外能可控的促进某种菌的生长，能研究不同菌对同一“粪便”的倾向性，对菌的培养有特异性。虽然只是一个例子，但未将来的更多的“人工粪便”提出了思路。
20.本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
21.本发明采用了特定浓度的脱脂奶作为消化底物，经过消化过程得到脱脂奶的消化产物培养基或“人工粪便”，用于培养粪便移植菌，此技术具有以下优势：1、脱脂牛奶消化后的氨基酸和还原糖的营养成分与商业培养基mrs相近。2、该培养基能达到对粪便移植菌高密度发酵的效果；3、可控的促进某种菌的生长，能研究不同菌对同一“粪便”的倾向性，对菌有特异性的培养效果；4、制作过程添加的脱脂奶、酶等均为食品级原料，可直接进食，省去离心洗涤等步骤；5、该消化过程不局限于静态消化，还可以用动态消化模拟体内消化过程。
附图说明
22.为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
23.图1是本发明实施例1中制备粪便移植菌的培养基的方法流程图。
24.图2是本发明实施例1中脱脂牛奶消化产物的还原糖浓度与mrs的对比图。
25.图3是本发明实施例1中脱脂牛奶消化产物的氨基酸浓度与mrs的对比图。
26.图4是本发明实施例1中脱脂牛奶消化产物对粪便菌x实现高密度发酵的效果图。
27.图5是本发明实施例1中脱脂牛奶消化产物对不同粪便菌的特异性效果图。
28.图6是本发明实施例2中含不同浓度葡萄糖的脱脂牛奶消化产物对粪便菌x的培养效果图。
29.图7是本发明实施例3中含葡萄糖及无机盐的脱脂牛奶消化产物对不同粪便菌的培养效果图。
具体实施方式
30.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
31.实施例1
32.将脱脂牛奶与模拟胃液(含水、盐酸和胃蛋白酶，ph＝3，胃蛋白酶浓度4000u/ml)1:1混合，将ph调节至3，在100rpm、37℃下反应2h模拟胃消化，将胃消化产物ph调至7，与模拟肠液(含水和胰酶，ph＝7，其中胰蛋白酶浓度200u/ml)1:1混合，在100rpm、37℃下反应2h模拟肠消化，将肠消化产物经过121℃、15min高温灭菌灭活去除杂菌，得到粪便移植菌的培养基。
33.将所得粪便移植菌的培养基与mrs培养基进行对比，其还原糖、氨基酸含量如图2-3所示；以1％接种量接种粪便移植菌至消化前后的脱脂奶消化产物中，37℃下培养24h，活菌数变化情况、不同粪便移植菌(x、y、z)在该产物的生长情况分别如图4-5所示，从图2和图3中可以看出还原糖和氨基酸含量与mrs相近，图4可以看出活菌数也有一个数量级的提高，能实现对菌的高密度发酵，此外，图5能明显看到不同粪便菌在同一脱脂牛奶消化产物的“人工粪便”中的不同倾向性，换言之，该脱脂牛奶“人工粪便”对不同菌有相应的特异性。
34.实施例2
35.将脱脂牛奶与葡萄糖混合液和与模拟胃液(ph＝3，胃蛋白酶浓度4000u/ml)1:1混合，将ph调节至3，在100rpm、37℃下反应3h模拟胃消化，将胃消化产物ph调至7，与模拟肠液(ph＝7，胰酶浓度200u/ml)1:1混合，在100rpm、37℃下反应2h模拟肠消化，将肠消化产物经过121℃、15min高温灭菌灭活去除杂菌，得到粪便移植菌的培养基。
36.将所得粪便移植菌的培养基与mrs培养基进行对比，以1％接种量接种粪便移植菌x至消化后的消化产物中，37℃下培养24h，生长情况分别如图6所示，从图中能明显看到葡萄糖的脱脂牛奶消化产物提升了对菌x的培养效果，仍然能实现对菌的高密度发酵。
37.实施例3
38.将脱脂牛奶与葡萄糖及矿物质混合液(最终消化产物含k
+
0.4％、hpo
42-0.2％、c6h7o
7-0.2％、nh
4+
0.6％、ch3coo-5％、na
+
10％、so
42-0.025％、mg
2+
0.02％、mn
2+
0.005％)、与模拟胃液(ph＝3，胃蛋白酶浓度4000u/ml)1:1混合，将ph调节至2，在100rpm、37℃下反应2h模拟胃消化，将胃消化产物ph调至7，与模拟肠液(ph＝7，胰酶浓度200u/ml)1:1混合，在100rpm、37℃下反应2h模拟肠消化，将肠消化产物经过121℃、15min高温灭菌灭活去除杂菌，得到粪便移植菌的培养基。
39.将所得粪便移植菌的培养基与mrs培养基进行对比，以1％接种量接种粪便移植菌x、y、z至消化后的消化产物中，37℃下培养24h，生长情况分别如图7所示，从图7中能明显看到含矿物质的消化产物提升了对菌x的y的培养效果，该效果与mrs没有明显区别；此外，不同粪便菌在同消化产物的“人工粪便”中的不同倾向性，换言之，该“人工粪便”对不同菌有相应的特异性。
40.实施例4
41.将脱脂牛奶与模拟胃液(ph＝5，胃蛋白酶浓度200u/ml)1:1混合，将ph调节至5，在150rpm、35℃下反应1h模拟胃消化，将胃消化产物ph调至7，与模拟肠液(ph＝7，胰酶浓度150u/ml)1:1混合，在50rpm、35℃下反应2h模拟肠消化，将肠消化产物经过80℃、30min高温
灭菌灭活去除杂菌，得到粪便移植菌的培养基。
42.实施例5
43.将脱脂牛奶与模拟胃液(ph＝2，胃蛋白酶浓度2000u/ml)1:1混合，将ph调节至2，在150rpm、39℃下反应1h模拟胃消化，将胃消化产物ph调至7，与模拟肠液(ph＝8，胰酶浓度250u/ml)1:1混合，在150rpm、39℃下反应2h模拟肠消化，将肠消化产物经过80℃、30min高温灭菌灭活去除杂菌，得到粪便移植菌的培养基。
44.显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

技术特征：
1.一种通过模拟体内消化过程制作的粪便移植菌的培养基的方法，其特征在于，包括以下步骤：s1：将食物与模拟胃液混合得到混合液1，将混合液1的ph值调至1.5-6.5，混合反应得到胃消化产物；所述食物选自蛋白质、糖类和矿物质中的一种或多种；s2：将s1中所得胃消化产物的ph值调至预设值6.5-8.5，得到混合液2，并与模拟肠液混合，混合反应得到肠消化产物；s3：将s2中所得肠消化产物进行灭菌灭活除杂，得到所述培养基。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s1中，食物与模拟胃液的质量比为1:2-2:1。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s1中，所述模拟胃液中含有胃蛋白酶或/和胃脂肪酶，且所述胃蛋白酶含量为400-4000u/ml；所述模拟胃液的ph值为1.5-5。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s1中，混合反应条件：搅拌、震荡、蠕动或挤压的速率为50-150rpm，反应温度为33-40℃，反应时间1-4h。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s2中，所述模拟肠液中含有胰蛋白酶，还可以包括其他复合酶或胆盐，所述其他复合酶选自糜蛋白酶、胰脂肪酶和胰淀粉酶中的一种或多种，其中胰蛋白酶含量为150-250u/ml；所述模拟肠液的胆盐含量0-40mm，所述模拟肠液的ph值为6.5-8.5。6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s2中，混合反应的条件：搅拌、震荡、蠕动或挤压的速率为50-150rpm，反应温度为33-40℃，反应时间为1-6h。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s2中，当所述模拟肠液含有胆盐时，则需要去除所得肠消化产物中的胆盐；去除胆盐的方法为透析、离心或过滤。8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤s3中，所述灭菌灭活的条件：温度为80-121℃、时间为15-30min。9.权利要求1-8中任一项所述的方法制备得到的粪便移植菌的培养基。10.权利要求9中所述的培养基在培养粪便移植菌中的应用。

技术总结
本发明涉及一种通过模拟体内消化过程制作的粪便移植菌的培养基的方法。本发明所述的方法具体为：S1：将食物与模拟胃液混合得到混合液1，将混合液1的pH值调至预设值，搅拌混合反应得到胃消化产物；所述食物选自蛋白质、糖类和矿物质一种或两种以上；S2：将S1中所得胃消化产物的pH值调至预设值得到混合液2，并与模拟肠液混合，搅拌混合反应得到肠消化产物；S3：将S2中所得肠消化产物进行灭菌灭活除杂，得到所述培养基。从而克服了无法重复性地准确生产“粪便”来培养粪便移植菌，并且解决了传统MRS培养基对粪便移植菌没有特异性的问题。MRS培养基对粪便移植菌没有特异性的问题。MRS培养基对粪便移植菌没有特异性的问题。


技术研发人员：陈晓东 王娟 吕禾 丛海花 廖振锴
受保护的技术使用者：陈晓东
技术研发日：2022.03.15
技术公布日：2022/5/25