一种含贝莱斯芽孢杆菌CY30的微生物菌剂及其应用的制作方法

一种含贝莱斯芽孢杆菌cy30的微生物菌剂及其应用
技术领域
1.本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种含贝莱斯芽孢杆菌cy30的微生物菌剂及其在促进甜瓜增产、提高甜瓜品质、防治甜瓜白粉病中的应用。


背景技术：

2.近年来，过量使用化肥和化学农药所导致的环境问题越来越严重，符合绿色、低碳、环保、经济要求的微生物菌剂的推广使用是绿色农业发展的必然要求。
3.白粉病由白粉菌科的真菌引起，是我国最常见的植物病害之一，属于外生性的真菌病害，只生长在叶片表面，形成灰斑，不会破坏大量细胞，但是菌种会吸取植物水分、养分，阻碍叶片生长，严重时会使植物完全停止生长。由于该病潜伏期短、发病迅速，需要频繁施药进行防控，不仅容易造成农药残留，甚至对环境和人类健康都会造成威胁。
4.氨基葡萄糖，是天然的氨基单糖，为人体关节软骨基质中合成蛋白聚糖所必需的物质，分子式c6h
13
no5，通常以n-乙酰基衍生物(如甲壳素)或以n-硫酸酯和n-乙酰-3-o-乳酸醚(胞壁酸)形式存在于微生物、动物来源的多糖和结合多糖中。我国有关氨基葡萄糖及其衍生物的研究主要研究集中在氨基葡萄糖及其衍生物对治疗骨关节炎方面。
5.现有技术中，有报道贝莱斯芽孢杆菌在黄瓜白粉病中的应用，但是不同的菌株其表现效果也必然不同，贝莱斯芽孢杆菌cy30作为一种新型生防细菌，目前仅有报道可促进茶树增产和防治茶轮斑病，对其他方面的研究尚未涉及。而且现有技术中，关于贝莱斯芽孢杆菌的微生物菌剂配方方面的研究比较少，特别是微生物菌剂的稳定性和菌体的田间定殖生长等。


技术实现要素：

6.本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种含贝莱斯芽孢杆菌cy30的微生物菌剂及其在促进甜瓜增产、提高甜瓜品质、防治甜瓜白粉病中的应用，能够提高微生物菌剂的活菌含量和存储稳定性，提高菌体在土壤中的定殖能力。
7.为实现上述目的，本发明的技术方案为一种含贝莱斯芽孢杆菌cy30的微生物菌剂，由以下重量份数的原料组成：贝莱斯芽孢杆菌cy30发酵液50-80份、氨基葡萄糖5-20份。
8.进一步地，所述贝莱斯芽孢杆菌cy30发酵液中活芽孢数为50-200亿cfu/ml。
9.进一步地，所述贝莱斯芽孢杆菌cy30发酵液的制备方法为：将贝莱斯芽孢杆菌cy30菌株活化后，接种于lb液体培养基中，在30℃、180r/min摇床振荡培养16h，得到种子液；再将种子液按2％的接种量接种至pd培养基中，在30℃、180r/min摇床振荡培养48h，直至芽孢脱落20％分离为止，终止发酵，然后用无菌水调整发酵液的菌含量，即得贝莱斯芽孢杆菌cy30发酵液。
10.进一步地，所述微生物菌剂还包括5-10份增效助剂。
11.更进一步地，所述增效助剂为水性聚氨酯乳液、纳米多糖纤维素溶液、烷基糖苷、脂肪醇聚氧乙烯醚中的一种或几种。
12.优化地，该微生物菌剂由以下重量份数的原料组成：贝莱斯芽孢杆菌cy30发酵液70份、氨基葡萄糖20份、水性聚氨酯乳液10份。
13.本发明还提供上述的含贝莱斯芽孢杆菌cy30的微生物菌剂在促进甜瓜增产中的应用。
14.本发明还提供上述的含贝莱斯芽孢杆菌cy30的微生物菌剂在提高甜瓜品质中的应用。
15.本发明还提供上述的含贝莱斯芽孢杆菌cy30的微生物菌剂在防治甜瓜白粉病中的应用。
16.本发明的含贝莱斯芽孢杆菌cy30的微生物菌剂，各组分之间搭配合理，而且常温短时间放置后，活菌数增殖显著，具有较好的经济效益和实际应用价值。氨基葡萄糖是生物体内许多多糖的基本组成单位，是合成双歧因子的重要前体，在生物体内具有许多重要功能，不仅能促进贝莱斯杆菌cy30芽孢的萌发，增强芽孢杆菌的活性，而且其本身有抗菌作用、能够抑制杂菌的生长，同时可以激发植物自身的免疫反应，从而使植物获得抗逆性。增效剂可以增加微生物菌剂的黏附性和保湿性，可以提高贝莱斯杆菌cy30的定殖成活率和微生物菌剂的利用率。本发明的微生物菌剂各组成相互作用配合，配置成一定浓度的稀释液对甜瓜进行叶喷或灌根，能有效地促进甜瓜的生长和预防白粉病。
17.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
18.(1)本发明提供的含贝莱斯芽孢杆菌cy30的微生物菌剂，可促进贝莱斯芽孢杆菌cy30的增殖和成活率，保证微生物菌剂的有效性和稳定性，同时可以在短时间内大幅提高微生物菌剂的活菌含量，对贝莱斯芽孢杆菌cy30的高效培养和实际应用具有重要意义；
19.(2)本发明的微生物菌剂作用于甜瓜上，可显著促进甜瓜的生长和增产、提升甜瓜的品质，同时对甜瓜白粉病具有良好的防治效果。
附图说明
20.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
21.图1为本发明实验4中清水对照区和微生物菌剂1处理区正常植株上甜瓜品质对比图(左边为清水对照区的甜瓜，右边为和微生物菌剂1处理区的甜瓜)；
22.图2为本发明实验4中清水对照区和微生物菌剂1处理区正常植株上甜瓜重量对比图(左边为清水对照区的甜瓜，右边为和微生物菌剂1处理区的甜瓜)。
具体实施方式
23.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
24.实施例1
25.本实施例提供一种含贝莱斯芽孢杆菌cy30的微生物菌剂，由以下重量份数的原料组成：贝莱斯芽孢杆菌cy30发酵液70份、氨基葡萄糖20份、水性聚氨酯乳液10份。
26.上述微生物菌剂的制备方法为：
27.(1)将贝莱斯芽孢杆菌cy30菌株活化后，接种于lb液体培养基中，在30℃、180r/min摇床振荡培养16h，作发酵用的种子液；其中，贝莱斯芽孢杆菌cy30的保藏编号为：cctcc no:m2018710；
28.(2)将cy30菌株种子液按2％的接种量接种至pd培养基中，在30℃、180r/min摇床振荡培养48h，直至芽孢脱落20％分离为止，终止发酵，然后用无菌水调整发酵液的菌含量为50-200亿cfu/ml，即得贝莱斯芽孢杆菌cy30发酵液；
29.(3)往上述所得的贝莱斯芽孢杆菌cy30发酵液中加入氨基葡萄糖，常温下混匀，待其全部溶解以后，按上述的重量份数，加入灭菌后的水性聚氨酯乳液，混匀后检测分装。
30.实施例2
31.本实施例提供一种含贝莱斯芽孢杆菌cy30的微生物菌剂，由以下重量份数的原料组成：贝莱斯芽孢杆菌cy30发酵液80份、氨基葡萄糖15份、烷基糖苷5份。其制备方法同实施例1。
32.实施例3
33.本实施例提供一种含贝莱斯芽孢杆菌cy30的微生物菌剂，由以下重量份数的原料组成：贝莱斯芽孢杆菌cy30发酵液50份、氨基葡萄糖5份、烷基糖苷5份。其制备方法同实施例1。
34.下面通过实验对本发明的微生物菌剂的功效进行研究。
35.实验1不同物料对贝莱斯芽孢杆菌cy30发酵液的影响
36.1.1实验
37.将按实施例1中方法制得的贝莱斯芽孢杆菌cy30发酵液与不同的处理物料(酵母肽、复合氨基酸、酶解寡肽en69a、酶解海藻多糖en63、氨基葡萄糖、极细链格孢激活蛋白)按质量比4:1在常温下混匀，以加等量无菌水的贝莱斯芽孢杆菌cy30发酵液为对照，每个处理设置3个重复，25℃下密封存储，每隔5d对其活菌数进行检测(采用稀释涂平板法)，比较不同处理与无菌水对照菌落数的差异，观察各处理物料对贝莱斯芽孢杆菌cy30活菌数的影响，结果见表1、表2。
38.实验中各物料的来源如下：
39.酵母肽，由安琪酵母股份有限公司提供；复合氨基酸，由交城县田丰肥业有限公司提供；酶解寡肽en69a、酶解海藻多糖en63，由苏州汉德瑞生物工程有限公司提供；氨基葡萄糖，cas：3416-24-8，采购自西安维珍生物科技有限公司；极细链格孢激活蛋白，采购自河北中保绿农作物科技有限公司。
40.1.2结果与讨论
41.表1不同物料对贝莱斯芽孢杆菌cy30活菌数的影响
[0042][0043]
表2不同物料与贝莱斯芽孢杆菌cy30复配的稳定性
[0044][0045]
表1和表2表明，将不同的物料与贝莱斯芽孢杆菌cy30发酵液进行复配后，对贝莱斯芽孢杆菌cy30活菌数会产生直接的影响。其中，处理1的活菌数下降最明显，说明酵母肽对贝莱斯芽孢杆菌cy30具有明显的抑制作用；而处理5的活菌数比无菌水的对照增加了约3-4倍，说明氨基葡萄糖对贝莱斯芽孢杆菌cy30的成活率和增殖有明显的促进作用。说明本发明的微生物菌剂在贝莱斯芽孢杆菌cy30发酵液中加入氨基葡萄糖，可以促进贝莱斯杆菌cy30芽孢的萌发，增强芽孢杆菌的活性。
[0046]
实验2增效助剂对贝莱斯芽孢杆菌cy30活菌数和黏附性的影响
[0047]
2.1增效助剂的添加对贝莱斯芽孢杆菌cy30活菌数的影响
[0048]
将70份贝莱斯芽孢杆菌cy30发酵液和20份氨基葡萄糖，在常温下溶解搅拌均匀后，加入10份增效剂，室温下混合均匀后，即得到待检测微生物菌剂。
[0049]
以添加等量无菌水的为空白对照样，添加4种不同增效助剂的为待检测微生物菌剂，在25℃下密封存，定期检测活菌数，检测结果见表3。其中纳米多糖纤维素溶液型号为hpc851，由阿尔法生物科技研究院(广州)有限公司提供。
[0050]
表3不同增效助剂对贝莱斯芽孢杆菌cy30活菌数的影响
[0051][0052]
2.2增效助剂的添加对贝莱斯芽孢杆菌cy30微生物菌剂黏附性的影响
[0053]
将上面制备的待检测微生物菌剂用去无菌水稀释500倍备用；剪取一定大小面积的甘蓝叶片(正方形s＝2
×
2cm)，称取叶片的质量(m1)，用镊子夹持叶片分别放入待检测微生物菌剂稀释液中浸泡5秒后垂直取出，待无药液滴下时称量其质量(m2)，则待检测微生物菌剂的最大持留量rm＝(m2-m1)/2s(mg/cm2)，每个处理重复三次，三次结果取平均值即为待测液的平均持留量rm，实测结果如表4所示。
[0054]
表4不同增效助剂对贝莱斯芽孢杆菌cy30微生物菌剂的黏附性影响
[0055][0056]
2.3结果与讨论
[0057]
从表3和表4可以看出，4种增效助剂对贝莱斯芽孢杆菌cy30的活菌数无明显影响，但是可以明显增加微生物菌剂的黏附性，在实际使用中有利于提高贝莱斯芽孢杆菌cy30微生物菌剂的利用率，减少微生物菌剂的流失，其中，水性聚氨酯乳液的效果最佳。
[0058]
实验3含贝莱斯芽孢杆菌cy30的微生物菌剂在土壤中的定殖实验
[0059]
3.1微生物菌剂1与ck对照样的制备
[0060]
含贝莱芽孢杆菌cy30的微生物菌剂1的制备：将70份贝莱斯芽孢杆菌cy30发酵液(活菌数71亿cfu/ml)和20份氨基葡萄糖，在常温下溶解搅拌均匀后，加入10份水性聚氨酯
乳液，室温下混合均匀后，即得到微生物菌剂1(检测活菌数57亿cfu/ml)。
[0061]
ck对照样：将贝莱斯芽孢杆菌cy30发酵液(活菌数71亿cfu/ml)与无菌水按质量比4:1混合均匀，即得ck对照样(检测活菌数56亿cfu/ml)。
[0062]
3.2实验
[0063]
选取一定量的沙土，除去石块、根茎、大颗粒状等杂物，晒干后用研钵粉碎，过筛后混合均匀；在烧杯中装入600g过筛后的沙土，121℃下灭菌30min，然后放入30℃培养箱中48h，再次121℃下灭菌30min后冷却，备用；
[0064]
将微生物菌剂1或ck对照样分别稀释200倍、400倍和600倍，取稀释液100ml倒入上述装有600g沙土的烧杯中，让菌剂在沙土中自由扩散，然后放入25℃培养箱或室外(平均温度23.5℃，最低温度6℃，最高温度25℃)，每隔5d补加100ml无菌水；每次用中空管垂直取土样，检测贝莱斯芽孢杆菌cy30的活菌数和成活率，结果如表5。成活率的计算方法如下：
[0065]
成活率＝成活数量
÷
初始数量
×
100％，其中初始数量为第一天实测活菌数量。
[0066]
表5含贝莱斯芽孢杆菌cy30的微生物菌剂在土壤中的定殖实验
[0067][0068]
3.3结果与讨论
[0069]
由表5可知，贝莱斯芽孢杆菌cy30发酵液在接种的沙土中定殖20d的成活率为52.8％-66.9％，而微生物菌剂1在接种的沙土中20d后的成活率为177.0％-196.6％，即该微生物菌剂1提高了贝莱斯芽孢杆菌cy30在沙土中的成活率和增殖能力。
[0070]
实验4含贝莱斯芽孢杆菌cy30微生物菌剂对甜瓜的作用效果测定
[0071]
4.1供试药剂：
[0072]
实验3中含贝莱斯芽孢杆菌cy30的微生物菌剂1；
[0073]
实验3中ck对照样；
[0074]
37％苯醚甲环唑wdg(对照药剂)；
[0075]
4.2试验设置：试验共设置6个处理，分别为微生物菌剂1的稀释500倍液、微生物菌剂1的稀释300倍液、微生物菌剂1的稀释100倍液、ck对照样、37％苯醚甲环唑wdg1000倍液、清水。每个处理喷施6棵甜瓜，3次重复。按常规栽培管理技术进行田间日常管理，将供试药
剂分别在甜瓜移栽定植后7d、定植后14d、定植后21d喷施。
[0076]
4.3试验地点：新疆塔城121团场
[0077]
4.4作用效果调查：
[0078]
施药前调查甜瓜白粉病病情指数。3次施药结束15d后，调查甜瓜白粉病防效和促生效果。
[0079]
白粉病病情分级按以下标准进行：
[0080]
0级：无病斑；
[0081]
1级：病斑面积占整个叶面积的5％以下；
[0082]
3级：病斑面积占整个叶面积的6％～15％；
[0083]
5级：病斑面积占整个叶面积的16％-25％；
[0084]
7级：病斑面积占整个叶面积的26％～50％；
[0085]
9级：病斑面积占整个叶面积的51％以上。
[0086]
防治效果统计
[0087]
病情指数＝∑(各级病叶数
×
相对级数值)/(调查总叶数
×
9)
×
100；
[0088]
防治效果(％)＝[1-(ck0×
pt1)/(ck1×
pt0)]
×
100，，式中ck0为空白对照区药前病情指数，ck1为空白对照区药后病情指数，pt0为药剂处理区药前病情指数，pt1为药剂处理区药后病情指数。
[0089]
表6不同处理防治甜瓜白粉病效果表
[0090]
处理防治前病情指数防治后病情指数防效(％)微生物菌剂1500倍液5.3912.2671.33微生物菌剂1300倍液5.3711.6972.56微生物菌剂1100倍液5.5411.2274.47ck对照样4.5320.3643.3437％苯醚甲环唑wdg1000倍液6.8910.2681.23清水3.5728.320.00
[0091]
4.5结果与讨论
[0092]
从表6可以看出，微生物菌剂1的100倍液、300倍液、500倍液对甜瓜白粉病有较好防治效果，从定植后7d开始共施药三次，防治效果分别为74.47％、72.56％、71.33％，而ck对照样防效只有43.34％，说明本发明的微生物菌剂1对贝莱斯芽孢杆菌cy30防治白粉病效果有明显的提升。
[0093]
同时分别摘取清水对照区和微生物菌剂1处理区正常植株上大小相同的4个甜瓜(纵长约25cm)，对比其品质发现差异明显：清水对照区瓜瓤层厚度平均36mm，重量约1.4kg，微生物菌剂1处理区瓜瓤层厚度平均55mm，重量约1.9kg，如图1所示；微生物菌剂1处理区的甜瓜比清水区单个增重0.5kg，折算增产26.3％，如图2所示；说明本发明的微生物菌剂1能够用于促进甜瓜增产以及提高甜瓜品质。
[0094]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种含贝莱斯芽孢杆菌cy30的微生物菌剂，其特征在于，由以下重量份数的原料组成：贝莱斯芽孢杆菌cy30发酵液50-80份、氨基葡萄糖5-20份。2.如权利要求1所述的一种含贝莱斯芽孢杆菌cy30的微生物菌剂，其特征在于：所述贝莱斯芽孢杆菌cy30发酵液中活芽孢数为50-200亿cfu/ml。3.如权利要求1所述的一种含贝莱斯芽孢杆菌cy30的微生物菌剂，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌cy30发酵液的制备方法为：将贝莱斯芽孢杆菌cy30菌株活化后，接种于lb液体培养基中，在30℃、180r/min摇床振荡培养16h，得到种子液；再将种子液按2％的接种量接种至pd培养基中，在30℃、180r/min摇床振荡培养48h，直至芽孢脱落20％分离为止，终止发酵，然后用无菌水调整发酵液的菌含量，即得贝莱斯芽孢杆菌cy30发酵液。4.如权利要求1所述的一种含贝莱斯芽孢杆菌cy30的微生物菌剂，其特征在于：所述微生物菌剂还包括5-10份增效助剂。5.如权利要求4述的一种含贝莱斯芽孢杆菌cy30的微生物菌剂，其特征在于：所述增效助剂为水性聚氨酯乳液、纳米多糖纤维素溶液、烷基糖苷、脂肪醇聚氧乙烯醚中的一种或几种。6.如权利要求5所述的一种含贝莱斯芽孢杆菌cy30的微生物菌剂，其特征在于：所述微生物菌剂由以下重量份数的原料组成：贝莱斯芽孢杆菌cy30发酵液70份、氨基葡萄糖20份、水性聚氨酯乳液10份。7.权利要求1-6任一项所述的含贝莱斯芽孢杆菌cy30的微生物菌剂在促进甜瓜增产中的应用。8.权利要求1-6任一项所述的含贝莱斯芽孢杆菌cy30的微生物菌剂在提高甜瓜品质中的应用。9.权利要求1-6任一项所述的含贝莱斯芽孢杆菌cy30的微生物菌剂在防治甜瓜白粉病中的应用。

技术总结
本发明涉及微生物的开发与应用技术领域，具体涉及一种含贝莱斯芽孢杆菌CY30的微生物菌剂，由以下重量份数的原料组成：贝莱斯芽孢杆菌CY30发酵液50-70份、氨基葡萄糖5-20份；本发明还提供上述的含贝莱斯芽孢杆菌CY30的微生物菌剂在促进甜瓜增产、提高甜瓜品质、防治甜瓜白粉病中的应用。本发明提供的含贝莱斯芽孢杆菌CY30的微生物菌剂，可促进贝莱斯芽孢杆菌CY30的增殖和成活率，保证微生物菌剂的有效性和稳定性，同时可以在短时间内大幅提高微生物菌剂的活菌含量，对贝莱斯芽孢杆菌CY30的高效培养和实际应用具有重要意义；且本发明的微生物菌剂作用于甜瓜上，可显著促进甜瓜的生长和增产、提升甜瓜的品质，同时对甜瓜白粉病具有良好的防治效果。有良好的防治效果。有良好的防治效果。


技术研发人员：田密 潘哲群 陈娇 尹骁 刘方英 杨婷 桑安国 林春鸿 黄大野 曹春霞
受保护的技术使用者：武汉楚强生物科技有限公司
技术研发日：2022.03.15
技术公布日：2022/5/25