一种河道底泥微生物活化复合菌剂及其制备方法和应用

1.本发明涉及污染水体治理技术领域，更具体地说，涉及一种河道底泥微生物活化复合菌剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.健康的城市水环境是城市可持续发展的重要保障，但随着我国经济的不断发展，大量污染物排放到水体中，超过了河流、湖泊的自净能力，导致水环境受到污染，水质恶化，严重地制约着我国社会和经济持续健康发展。水环境污染不仅不利于城市的健康发展，对居民的生活和饮用水安全等也产生极大的威胁。因此，解决水环境污染问题已成为实现城市可持续发展的关键。
3.溶解氧低，氮磷营养盐浓度较高是引发我国水体污染的主要影响因素。在过去的几十年中，各种技术，包括充氧曝气、引水、清淤疏浚、添加化学除藻剂和磷沉淀剂等已经被开发并用于修复受污染的河流，使水体污染在一定程度上得到缓解，但是这些技术存在成本高，二次污染等问题。近年来，生物修复以其低耗、高效、无二次污染等优势成为河流治理的热点技术之一。
4.微生物强化修复技术是生物修复污染河流中常用的方法，主要是利用某些特定功能的微生物降解转化河流中的污染物，来达到净化水质的目的。高效微生物菌剂在对污染水体强化修复中被广泛应用，如假单胞菌、酵母菌、光合细菌、芽孢杆菌、硝化菌和放线菌等。其中，异养硝化-好氧反硝化菌以其生长速度快，耐氧适应性强，能同时完成硝化反硝化脱氮，且对碳和氮元素污染物去除率高等优势而备受关注。
5.但目前，对于微生物菌剂修复技术普遍存在制备过程复杂、实施过程难度大等问题。采用单一菌株制备的菌剂环境适应能力差，与环境中土著微生物的竞争导致其生长缓慢，甚至出现大量死亡的现象，从而难以在天然水体中发挥原有的净化功能。


技术实现要素：

6.本发明克服了现有技术中的不足，目前微生物菌剂修复技术存在制备过程复杂、实施过程难度大的问题，提供了一种河道底泥微生物活化复合菌剂及其制备方法和应用，本发明通过对水体中土著微生物进行富集活化，获得具有高效脱氮净化功能的混合菌群，进一步提高功能菌群的环境适应性，制备出基于混合菌群的高效复合菌剂。
7.本发明的目的通过下述技术方案予以实现。
8.一种河道底泥微生物活化复合菌剂及其制备方法，按照下述步骤进行：
9.步骤1，目标河道底泥微生物活化富集培养：取目标河道底泥样品，分别接种至三种选择性富集优化培养基，对脱氮菌群进行富集优化培养，每隔24h进行氮素指标和菌液浓度od
600
值检测，当培养基中氮素浓度不再降低时，再按菌液：培养基体积比为5％，分别转接入新鲜的培养基中，转接培养三次，获得河道土著异养硝化好氧反硝化脱氮功能菌群富集培养液；
10.步骤2，功能微生物驯化培养：将生长至对数期的步骤1得到的功能菌群富集培养液分别转接到驯化培养液中，驯化培养液由选择性富集优化培养基添加不同体积比例的河水配制，实际河水添加量占总体积比为50-95％，每个驯化阶段按培养基：河水的体积比5-15％进行转接，各阶段驯化时间为2-4d后，得到驯化培养的功能菌；
11.步骤3，复合菌剂扩大培养：将步骤2中驯化培养的功能菌按菌液：培养基体积比为5％的接种量接种于培养罐中，培养至对数生长期，得到三组扩大培养的单功能菌群；
12.步骤4，功能微生物复配：将步骤3得到的三组扩大培养的单功能菌群分别置于4℃的离心机内，8000r/min条件下离心10min，获得的三组细菌菌体分别用超纯水洗涤3次后，用无菌生理盐水分别稀释上述三组细菌菌体的得到三组菌剂的菌液，三组菌剂的菌液细胞浓度od
600
值至0.5，并等体积混合上述三组菌剂的菌液，以获得河道底泥微生物活化复合菌剂。
13.在步骤1中，三种选择性富集优化培养基为异养硝化-好氧反硝化富集培养基、异养硝化富集优化培养基和好氧反硝化富集优化培养基。
14.异养硝化-好氧反硝化富集培养基的配比如下：柠檬酸钠6g，(nh4)2so
4 1g，kno
3 2g，k
2 hpo
4 0.3g，kh2po
4 0.2g，mgso4·
7h2o 0.2g，0.5ml微量元素浓缩液；将上述物质按照比例混合后补充蒸馏水体积为1l，调节其ph＝7.0。
15.异养硝化富集优化培养基的配比如下：柠檬酸钠4.902g，(nh4)2so
4 0.382g，k
2 hpo
4 0.3g，kh2po
4 0.2g，mgso4·
7h2o 0.05g，nacl 0.12g，feso
4 0.01g，mnso4·
h2o 0.01g；将上述物质按照比例混合后补充蒸馏水体积为1l，调节其ph＝7.0。
16.好氧反硝化富集优化培养基的配比如下：柠檬酸钠5g，kno
3 2g，k2hpo
4 0.3g，kh2po
4 0.2g，mgso4·
7h 2
o 0.05g，0.5ml微量元素浓缩液；将上述物质按照比例混合后补充蒸馏水体积为1l，调节其ph＝7.0。
17.制备得到的复合菌剂在处理污染水体时，按细菌干重0.75-1.5g/m3进行投加，操作方法：利用无菌生理盐水调节上述复合菌剂的菌液细胞浓度为od
600
＝0.5，按每升河水投加3-6ml上述复合菌剂的菌液。
18.本发明的有益效果为：本发明方法是利用选择性富集培养基直接活化富集污染水体底泥土著微生物混合菌群，通过驯化培养和进一步复配，将获得的复合菌群直接应用于污染河流的修复；本发明的复合菌剂具有环境适应能力强、污染物去除率高、菌剂制备过程简单高效等优势。
具体实施方式
19.下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。
20.本实施例提供了一种河道底泥微生物活化复合菌剂的制备方法，包括以下步骤：
21.(1)取天津市月牙河河道底泥样品5g，分别接种于装有100ml灭菌的三种选择性富集优化培养基的锥形瓶中，在20-25℃下静置培养3-4d，每隔24h进行氮素指标检测和菌液浓度od
600
值检测，当培养基中氮素浓度不再降低时，再取分别上述菌液5ml分别转接入100ml新鲜的三种选择性富集优化培养基中，转接培养三次；
22.上述三种选择性富集优化培养基为异养硝化-好氧反硝化富集培养基、异养硝化富集优化培养基和好氧反硝化富集优化培养基：
23.异养硝化-好氧反硝化富集培养基的配比如下：柠檬酸钠6g，(nh4)2so
4 1g，kno
3 2g，k
2 hpo
4 0.3g，kh2po
4 0.2g，mgso4·
7h2o 0.2g，0.5ml微量元素浓缩液；将上述物质按照比例混合后补充蒸馏水体积为1l，调节其ph＝7.0。
24.异养硝化富集优化培养基的配比如下：柠檬酸钠4.902g，(nh4)2so
4 0.382g，k
2 hpo
4 0.3g，kh2po
4 0.2g，mgso4·
7h2o 0.05g，nacl 0.12g，feso
4 0.01g，mnso4·
h2o 0.01g；将上述物质按照比例混合后补充蒸馏水体积为1l，调节其ph＝7.0。
25.好氧反硝化富集优化培养基的配比如下：柠檬酸钠5g，kno
3 2g，k2hpo
4 0.3g，kh2po
4 0.2g，mgso4·
7h 2
o 0.05g，0.5ml微量元素浓缩液；将上述物质按照比例混合后补充蒸馏水体积为1l，调节其ph＝7.0。
26.经富集优化培养，获得三种具有良好脱氮效果的河道土著脱氮功能菌群富集培养液，其中，异养硝化-好氧反硝化混合菌群(h)对氨氮、硝酸盐氮和总氮的去除率分别为69.11％、99.06％和84.86％；异养硝化混合菌群(y)对氨氮和总氮除效率达82.60％和81.41％；好氧反硝化混合菌群(f)对硝酸盐氮和总氮的去除率达到99.62％和98.23％；
27.(2)将生长至对数期的优化培养的上述三组混合菌群分别转接到分别利用选择性富集优化培养基和实际河水合成的驯化培养液中，按表1所示驯化步骤和相应的驯化条件进行驯化，所有的试验均在装有100ml驯化培养液的250ml的锥形瓶中进行，置于20-25℃条件下静置培养；
28.表1驯化培养步骤及驯化条件
29.步骤驯化培养液配比接种量(％)时间(d)步骤1优化培养基100％52步骤2优化培养基：河水50％:50％52步骤3优化培养基：河水30％:70％103步骤4优化培养基：河水15％:85％103步骤5优化培养基：河水5％:95％154
30.本实施例中，菌群在逐步驯化过程中，驯化培养液中各氮素去除率变化情况如表2-4所示：
31.表2异养硝化-好氧反硝化混合菌群驯化过程脱氮效果
32.氮素去除率(％)步骤1步骤2步骤3步骤4步骤5nh
4+-n69.1145.9248.757.3261.38no
3--
n99.06100100100100tn84.8621.3256.6781.1281.56
33.表3异养硝化混合菌群驯化过程脱氮效果
34.氮素去除率(％)步骤1步骤2步骤3步骤4步骤5nh
4+-n82.682.5265.566.0278.57tn81.4181.0656.0565.6169.39
35.表4好氧反硝化混合菌群驯化过程脱氮效果
36.氮素去除率(％)步骤1步骤2步骤3步骤4步骤5no
3--
n99.62100100100100
tn98.2397.0890.0885.2183.49
37.相比三组混合菌群在优化培养基中的氮素去除效果，脱氮菌群在驯化培养液中的脱氮率有所降低，但仍显示出一定的氮素去除效果，说明菌群在逐步驯化过程中，成功淘汰适应能力弱的菌株，最终能够适应低浓度营养物质河水环境；
38.(3)将成功驯化培养的三组混合脱氮功能菌，按混合脱氮功能菌与新鲜培养液体积比为5％的接种量接种于装有新鲜培养液的培养罐中，在室温20-25℃条件下静置培养至对数生长期，分别得到三组混合脱单功能菌的菌液；
39.(4)功能微生物复配：将扩大培养的上述三组混合脱单功能菌的菌液，在4℃下离心，8000r/min离心10min，弃去上清液，分别得到三组细菌菌体，将得到的三组细菌菌体分别用超纯水洗涤、离心，如此方式反复洗涤3次后，将洗涤后的三组细菌菌体用无菌生理盐水稀释，得到三组菌剂的菌液，三组菌剂的菌液的细胞浓度为0d
600
＝0.5，并将上述三组菌剂的菌液等体积混合后，得到异养硝化好氧反硝化复合菌剂h+y+f；
40.(5)再取天津市月牙河实际河水，按每升河水投加3ml上述复合菌剂的菌液，以未使用本发明的复合菌剂的河水为空白样，按国家检测标准对氮素进行检测，其中，tn采用碱性过硫酸钾消解-紫外分光光度法、nh
4+-n采用纳氏试剂比色法、no
3--
n采用紫外分光光度法、no
2--
n采用n-(1-萘基)-乙二胺光度法进行测定，加入复合菌剂的菌液的样品和空白样均在4℃、8000r/min下离心10min后，用0.45um滤膜过滤上清液后进行测定，经过72h的检测，加入复合菌剂的菌液的样品，使得实际河水中nh
4+-n、no
3--
n、no
2--
n和tn的浓度分别由1.974、1.622、0.031和3.661降低至0.278、0.301、0.006和0.751mg/l，较空白对照组相比，去除率分别提高了39.26％、57.27％、64.52％和53.98％。
41.将复合菌剂按每升河水投加3ml投加至模拟河水中，经过72h后检测，对nh
4+-n、no
3-n和tn的去除率可达79.06％、74.69％和72.35％。
42.在nh
4+-n、no
3--
n和tn初始溶度分别为5.79、0.28和6.08mg/l的受污水冲击河道水体中，按每升河水投加3ml复合菌剂并结合0.4l/min(空气计)的连续曝气，在24h内对nh
4+-n、no
3--
n和tn的去除率最高达42.31％、38.73％和41.83％。
43.以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种河道底泥微生物活化复合菌剂，其特征在于：按照下述步骤进行：步骤1，目标河道底泥微生物活化富集培养：取目标河道底泥样品，分别接种至三种选择性富集优化培养基，对脱氮菌群进行富集优化培养，每隔24h进行氮素指标和菌液浓度od
600
值检测，当培养基中氮素浓度不再降低时，再按菌液：培养基体积比为5％，分别转接入新鲜的培养基中，转接培养三次，获得河道土著异养硝化好氧反硝化脱氮功能菌群富集培养液；步骤2，功能微生物驯化培养：将生长至对数期的步骤1得到的功能菌群富集培养液分别转接到驯化培养液中，驯化培养液由选择性富集优化培养基添加不同体积比例的河水配制，实际河水添加量占总体积比为50-95％，每个驯化阶段按培养基：河水的体积比5-15％进行转接，各阶段驯化时间为2-4d后，得到驯化培养的功能菌；步骤3，复合菌剂扩大培养：将步骤2中驯化培养的功能菌按菌液：培养基体积比为5％的接种量接种于培养罐中，培养至对数生长期，得到三组扩大培养的单功能菌群；步骤4，功能微生物复配：将步骤3得到的三组扩大培养的单功能菌群分别置于4℃的离心机内，8000r/min条件下离心10min，获得的三组细菌菌体分别用超纯水洗涤3次后，用无菌生理盐水分别稀释上述三组细菌菌体的得到三组菌剂的菌液，三组菌剂的菌液细胞浓度od
600
值至0.5，并等体积混合上述三组菌剂的菌液，以获得河道底泥微生物活化复合菌剂。2.根据权利要求1所述的一种河道底泥微生物活化复合菌剂，其特征在于：在步骤1中，三种选择性富集优化培养基为异养硝化-好氧反硝化富集培养基、异养硝化富集优化培养基和好氧反硝化富集优化培养基。3.根据权利要求2所述的一种河道底泥微生物活化复合菌剂，其特征在于：异养硝化-好氧反硝化富集培养基的配比如下：柠檬酸钠6g，(nh4)2so
4 1g，kno
3 2g，k
2 hpo40.3g，kh2po
4 0.2g，mgso4·
7h2o 0.2g，0.5ml微量元素浓缩液；将上述物质按照比例混合后补充蒸馏水体积为1l，调节其ph＝7.0。4.根据权利要求2所述的一种河道底泥微生物活化复合菌剂，其特征在于：异养硝化富集优化培养基的配比如下：柠檬酸钠4.902g，(nh4)2so
4 0.382g，k
2 hpo
4 0.3g，kh2po
4 0.2g，mgso4·
7h2o 0.05g，nacl 0.12g，feso
4 0.01g，mnso4·
h2o 0.01g；将上述物质按照比例混合后补充蒸馏水体积为1l，调节其ph＝7.0。5.根据权利要求2所述的一种河道底泥微生物活化复合菌剂，其特征在于：好氧反硝化富集优化培养基的配比如下：柠檬酸钠5g，kno
3 2g，k2hpo
4 0.3g，kh2po
4 0.2g，mgso4·
7h 2
o 0.05g，0.5ml微量元素浓缩液；将上述物质按照比例混合后补充蒸馏水体积为1l，调节其ph＝7.0。6.一种河道底泥微生物活化复合菌剂的制备方法，其特征在于：按照下述步骤进行：步骤1，目标河道底泥微生物活化富集培养：取目标河道底泥样品，分别接种至三种选择性富集优化培养基，对脱氮菌群进行富集优化培养，每隔24h进行氮素指标和菌液浓度od
600
值检测，当培养基中氮素浓度不再降低时，再按菌液：培养基体积比为5％，分别转接入新鲜的培养基中，转接培养三次，获得河道土著异养硝化好氧反硝化脱氮功能菌群富集培养液；步骤2，功能微生物驯化培养：将生长至对数期的步骤1得到的功能菌群富集培养液分别转接到驯化培养液中，驯化培养液由选择性富集优化培养基添加不同体积比例的河水配
制，实际河水添加量占总体积比为50-95％，每个驯化阶段按培养基：河水的体积比5-15％进行转接，各阶段驯化时间为2-4d后，得到驯化培养的功能菌；步骤3，复合菌剂扩大培养：将步骤2中驯化培养的功能菌按菌液：培养基体积比为5％的接种量接种于培养罐中，培养至对数生长期，得到三组扩大培养的单功能菌群；步骤4，功能微生物复配：将步骤3得到的三组扩大培养的单功能菌群分别置于4℃的离心机内，8000r/min条件下离心10min，获得的三组细菌菌体分别用超纯水洗涤3次后，用无菌生理盐水分别稀释上述三组细菌菌体的得到三组菌剂的菌液，三组菌剂的菌液细胞浓度od
600
值至0.5，并等体积混合上述三组菌剂的菌液，以获得河道底泥微生物活化复合菌剂。7.根据权利要求1所述的一种河道底泥微生物活化复合菌剂的制备方法，其特征在于：在步骤1中，三种选择性富集优化培养基为异养硝化-好氧反硝化富集培养基、异养硝化富集优化培养基和好氧反硝化富集优化培养基。8.根据权利要求7所述的一种河道底泥微生物活化复合菌剂的制备方法，其特征在于：异养硝化-好氧反硝化富集培养基的配比如下：柠檬酸钠6g，(nh4)2so
4 1g，kno
3 2g，k
2 hpo
4 0.3g，kh2po
4 0.2g，mgso4·
7h2o 0.2g，0.5ml微量元素浓缩液；将上述物质按照比例混合后补充蒸馏水体积为1l，调节其ph＝7.0；异养硝化富集优化培养基的配比如下：柠檬酸钠4.902g，(nh4)2so
4 0.382g，k
2 hpo
4 0.3g，kh2po
4 0.2g，mgso4·
7h2o 0.05g，nacl 0.12g，feso
4 0.01g，mnso4·
h2o 0.01g；将上述物质按照比例混合后补充蒸馏水体积为1l，调节其ph＝7.0；好氧反硝化富集优化培养基的配比如下：柠檬酸钠5g，kno32g，k2hpo
4 0.3g，kh2po
4 0.2g，mgso4·
7h 2
o 0.05g，0.5ml微量元素浓缩液；将上述物质按照比例混合后补充蒸馏水体积为1l，调节其ph＝7.0。9.如权利要求1-6任一所述的一种河道底泥微生物活化复合菌剂在生物修复污染河流上的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：制备得到的复合菌剂在处理污染水体时，按细菌干重0.75-1.5g/m3进行投加，操作方法：利用无菌生理盐水调节上述复合菌剂的菌液细胞浓度为od
600
＝0.5，按每升河水投加3-6ml上述复合菌剂的菌液。

技术总结
本发明提供一种河道底泥微生物活化复合菌剂及其制备方法和应用，目标河道底泥微生物活化富集培养、功能微生物驯化培养、复合菌剂扩大培养和功能微生物复配。本发明通过对水体中土著微生物进行富集活化，获得具有高效脱氮净化功能的混合菌群，进一步提高功能菌群的环境适应性，制备出基于混合菌群的高效复合菌剂。剂。


技术研发人员：李茹莹 贾明智 刘玉佳
受保护的技术使用者：天津大学
技术研发日：2020.11.23
技术公布日：2022/5/25