含VEGF纳米抗体的药物组合物及其用途的制作方法

含vegf纳米抗体的药物组合物及其用途
技术领域
1.本发明涉及生物医学或生物制药领域，更具体地涉及一种含vegf纳米抗体的药物组合物及其用途。


背景技术：

2.细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides,cpps)是一类能穿透细胞膜的短链多肽。研究发现，cpps能够与各种药物分子结合并将药物递送至细胞内。关于cpps的跨膜和细胞摄取机制，已经诸多实验和报告进行了解释，但cpps进入细胞的确切途径仍待进一步的研究。目前，研究发现人为设置的条件会影响实验结果，不同的cpps进入不同的细胞会有不同的摄取途径，cpps所带的货物也会对cpps的内化机制产生影响。值得注意的是，cpps的内化途径并不是固定不变的，许多cpps能够用多种途径完成内化。并且，cpps的内化机制还会随着自身浓度、细胞组织、携带货物的不同而产生变化。目前研究较多的穿膜肽包括：tat、penetratin、protamine、transpotan、mpg等。其中penetratin来源于果蝇触角蛋白同源结构域，是一条两亲性的穿膜肽，因为具有较好的穿膜效应而被作为一个潜在药物载体用于各种目的。penetratin序列中的阳离子氨基酸精氨酸和赖氨酸是发挥穿膜活性的不可替代的位点，如果对它们进行替换或改造会降低穿膜效应，而序列中的色氨酸、苯丙氨酸和异亮氨酸为疏水性氨基酸，可以促进肽与细胞膜脂质的相互作用。文献sgolastra f,deronde b m,sarapas j m,et al.designing mimics of membrane active proteins[j].accounts of chemical research,2013,46(12):2977-87中公开了penetratin衍生物rqikiwfqwrrmkwkk，表明疏水残基对于细胞摄取具有重要作用。中国发明专利cn101355970a公开了penetratin衍生物rqikiwfwnrrmkwkk。中国发明专利cn108976288a公开了多种penetratin衍生物的序列。文献表明，在penetratin分子中引入疏水性氨基酸能够增强penetratin衍生物对于细胞的穿透能力。
[0003]
vegf纳米抗体具有稳定性高、水溶性好、人源化简单、靶向性高、穿透性强等特点，在免疫实验、诊断与治疗中，发挥着超乎想象的巨大功能。如果将vegf纳米抗体与穿膜肽联合使用，则能提高vegf纳米抗体药物的利用率，进一步则可能开发出高药效的vegf纳米抗体抗肿瘤药物制剂以及通过滴眼式给药的vegf纳米抗体眼科制剂形式。目前尚未有高药效、低毒性的vegf纳米抗体与穿膜肽联用的药物组合物公开。
[0004]
因此，开发一种vegf纳米抗体药物组合物，提高vegf纳米抗体对细胞的摄入效果，具有较好的临床应用前景，可以为制备药效高、毒性低的vegf纳米抗体药物制剂，尤其是对于开发滴眼式药物制剂奠定良好的基础。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的在于提供一种含vegf纳米抗体的药物组合物及其用途。
[0006]
本发明的第一方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有：
[0007]
(a)抗vegf纳米抗体；
[0008]
(b)穿膜肽；和
[0009]
(c)药学上可接受的载体。
[0010]
在另一优选例中，所述抗vegf纳米抗体的互补决定区(cdr)为seq id no:1所示的cdr1、seq id no:2所示的cdr2、和seq id no:3所示的cdr3。
[0011]
在另一优选例中，所述抗vegf纳米抗体的氨基酸序列如seq id no:4所示。
[0012]
在另一优选例中，所述穿膜肽包括penetratin及其衍生物。
[0013]
在另一优选例中，所述的penetratin的氨基酸序列如seq id no:5所示。
[0014]
在另一优选例中，所述的penetratin衍生物是在seq id no:5所示氨基酸序列的基础上，添加、缺失、修饰和/或取代至少一个(如1-3个，较佳地1-2个，更佳地1个)氨基酸并保留穿膜活性的衍生多肽。
[0015]
在另一优选例中，所述的衍生多肽保留了≥80％，较佳地≥90％；更佳地≥95％的seq id no:5的所示多肽的穿膜活性。
[0016]
在另一优选例中，所述的衍生多肽与seq id no:5的相同性≥80％，较佳地≥90％；更佳地≥95％。
[0017]
在另一优选例中，所述穿膜肽的氨基酸序列如seq id no:5、seq id no:6、seq id no:7或seq id no:8所示。
[0018]
在另一优选例中，所述穿膜肽的氨基酸序列如seq id no:7所示。
[0019]
在另一优选例中，所述的药物组合物含有：
[0020]
(a)氨基酸序列如seq id no:4所示的抗vegf纳米抗体；
[0021]
(b)氨基酸序列如seq id no:7所示的穿膜肽；和
[0022]
(c)药学上可接受的载体。
[0023]
在另一优选例中，所述的抗vegf纳米抗体与穿膜肽的摩尔比例为1:20至10:1，较佳地为1:10至2：1，更佳地为1:5至1:1。
[0024]
在另一优选例中，所述的抗vegf纳米抗体与穿膜肽的摩尔比例为1:3至1:1。
[0025]
在另一优选例中，所述的抗vegf纳米抗体与穿膜肽的总含量为组合物的1～99wt％，更佳地为5～90wt％。
[0026]
在另一优选例中，所述药物组合物的剂型包括冻干制剂、液体制剂。
[0027]
在另一优选例中，所述药物组合物的剂型包括注射剂(如眼周和眼内注射剂)、眼药水、眼用凝胶或眼药膏。
[0028]
在另一优选例中，所述药物组合物的剂型包括缓释型或非缓释型剂型。
[0029]
在另一优选例中，所述的药物组合物还可含有其他药物活性成分，较佳地，含有治疗癌症或眼部疾病的活性成分。
[0030]
本发明的第二方面，提供了一种本发明第一方面所述的药物组合物的用途，用于制备治疗vegf相关疾病或病症的药物。
[0031]
在另一优选例中，所述的vegf相关疾病或病症包括癌症或眼部疾病。
[0032]
在另一优选例中，所述的癌症包括但不限于：乳腺癌、肺癌、食管癌、胃癌、大肠癌、肺癌、甲状腺癌、鼻咽癌、或其组合。
[0033]
在另一优选例中，所述的眼部疾病为新生血管相关的眼部疾病。
[0034]
在另一优选例中，所述的眼部疾病包括但不限于：年龄相关性黄斑变性、糖尿病性
视网膜病变、视网膜静脉阻塞、病理性近视、新生血管性青光眼、或其组合。
[0035]
本发明的第三方面，提供了一种本发明第一方面所述的药物组合物的制备方法，包括步骤：
[0036]
(i)分别提供抗vegf纳米抗体和穿膜肽，
[0037]
(ii)将所述的抗vegf纳米抗体与穿膜肽进行物理混合，从而得到一混合物，和
[0038]
(iii)在适合制备药物的条件下，将所述混合物与药学上可接受的载体混合，从而制得所述的药物组合物。
[0039]
在另一优选例中，在步骤(ii)中，可以先将所述的抗vegf纳米抗体与药学上可接受的任一载体进行预混合，从而得到第一预混合物，再将第一预混合物与所述穿膜肽进行物理混合，从而得到所述混合物。
[0040]
在另一优选例中，在步骤(ii)中，可以先将所述的穿膜肽与药学上可接受的任一载体进行预混合，从而得到第二预混合物，再将第二预混合物与所述抗vegf纳米抗体进行物理混合，从而得到所述混合物。
[0041]
在另一优选例中，在步骤(ii)中，可以分别将所述的抗vegf纳米抗体和穿膜肽与药学上可接受的任一载体进行预混合，从而得到第一预混合物和第二预混合物，再将所述的第一预混合物与第二预混合物进行物理混合，从而得到所述混合物。
[0042]
本发明的第四方面，提供了一种药盒，所述药盒含有：
[0043]
(i)第一容器，以及装于该第一容器中的活性成分(a)抗vegf纳米抗体，或含有活性成分(a)的药物；
[0044]
(ii)第二容器，以及装于该第二容器中的活性成分(b)穿膜肽，或含有活性成分(b)的药物；以及
[0045]
(iii)说明书，所述说明书中记载了联合给予活性成分(a)和活性成分(b)从而治疗vegf相关疾病或病症的说明。
[0046]
在另一优选例中，所述的第一容器和第二容器中的药物是含活性成分(a)的单方制剂以及含活性成分(b)的单方制剂。
[0047]
本发明的第五方面，提供了一种治疗vegf相关疾病或病症的方法，所述的方法包括步骤：
[0048]
(i)给需要的对象施用活性成分(a)抗vegf纳米抗体和活性成分(b)穿膜肽，或者施用本发明第一方面所述的药物组合物。
[0049]
在另一优选例中，所述的施用包括同时施用或先后施用。
[0050]
在另一优选例中，所述的对象包括人和非人哺乳动物。
[0051]
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
[0052]
图1显示了穿膜肽penetratin及其突变体结合vegf纳米抗体的穿膜效果。结果表明：penetratin-mut2与vegf纳米抗体混合后能够有效穿透细胞膜，将vegf纳米抗体带入细胞内，其穿膜效果显著优于野生型penetratin-wt及突变体penetratin-mut 1。
[0053]
图2a和图2b显示了不同vegf抗体与穿膜肽混合物在不同类型细胞中的渗透效果。结果表明：vegf纳米抗体与penetratin-mut2混合后对于多种细胞的渗透穿膜效果显著优于市售单抗eylea与penetratin-mut2混合物；且随着penetratin-mut2浓度的提高，vegf纳米抗体对各类型细胞的摄入效果显著提高。
[0054]
图3a和图3b显示了vegf纳米抗体与穿膜肽混合物对不同类型细胞的毒性。结果表明：低剂量组(9μm)vegf纳米抗体、penetratin-mut2、penetratin-mut3、vegf纳米抗体/penetratin-mut2混合物(3:1)、vegf纳米抗体/penetratin-mut3混合物(3:1)对五种类型细胞基本无毒副作用作用；而高剂量组(90μm)vegf纳米抗体/penetratin-mut2混合物对结肠腺癌细胞ht29、乳腺癌细胞mcf7细胞表现出轻微毒性作用，高剂量组(90μm)vegf纳米抗体/penetratin-mut3混合物对结肠腺癌细胞ht29、乳腺癌细胞mcf7细胞表现出明显毒性作用。其中，vegf纳米抗体与穿膜肽混合物的剂量(9μm或90μm)为混合物中纳米抗体的含量。
具体实施方式
[0055]
本发明人经过广泛而深入地研究，经过大量的筛选，首次意外地发现一种vegf纳米抗体与穿膜肽经简单物理混合形成的药物组合物。实验表明，本发明的药物组合物能够有效穿透细胞膜，穿膜肽能够将vegf纳米抗体有效带入细胞内；本发明的vegf纳米抗体与穿膜肽混合后，对多种细胞的渗透穿膜效果显著优于市售单抗eylea(即vegf常规单抗)与穿膜肽的混合物；本发明vegf纳米抗体药物组合物在低剂量时无细胞毒性，在高剂量时只有轻微毒性，安全性非常高。
[0056]
具体地，本发明提供了一种vegf纳米抗体药物组合物，能够有效穿透细胞膜，显著促进vegf纳米抗体细胞膜穿透性；本发明vegf纳米抗体药物组合物能够有效渗透癌细胞、角膜细胞，且随着穿膜肽浓度的提高，vegf纳米抗体对细胞的摄入效果显著提高。
[0057]
术语
[0058]
如本文所用，术语“本发明vegf纳米抗体”、“本发明的纳米抗体”、“抗vegf纳米抗体”、“vegf纳米抗体”具有相同的含义，可互换使用，均指特异性识别和结合于vegf(包括人vegf)的纳米抗体。在优选的实施方式中，本发明vegf纳米抗体的氨基酸序列如seq id no:4所示。
[0059]
如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(l)和两个相同的重链(h)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(vh)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(vl)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
[0060]
如本文所用，术语“单域”、“vhh”、“纳米抗体(nanobody)”、“重链抗体”(single domain antibody,sdab，或纳米抗体nanobody)具有相同的含义并可互换使用，指克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的纳米抗体(vhh)，它是具有完整功能的最小的抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(ch1)的抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的纳米抗体(vhh)。
[0061]
如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(cdr)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(fr)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个fr区，它们大致上呈b-折叠构型，由形成连接环的三个cdr相连，在某些情况下可形成部分b折叠结构。每条链中的cdr通过fr区紧密地靠在一起并与另一链的cdr一起形成了抗体的抗原结合部位(参见kabat等,nih publ.no.91-3242,卷i，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
[0062]
该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码dna杂交的dna所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
[0063]
在本发明中，“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个、2个或1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表a进行氨基酸替换而产生。
[0064]
表a
[0065]
最初的残基代表性的取代优选的取代ala(a)val；leu；ilevalarg(r)lys；gln；asnlysasn(n)gln；his；lys；argglnasp(d)gluglucys(c)sersergln(q)asnasnglu(e)aspaspgly(g)pro；alaalahis(h)asn；gln；lys；argargile(i)leu；val；met；ala；pheleuleu(l)ile；val；met；ala；pheilelys(k)arg；gln；asnargmet(m)leu；phe；ileleuphe(f)leu；val；ile；ala；tyrleupro(p)alaalaser(s)thrthrthr(t)sersertrp(w)tyr；phetyrtyr(y)trp；phe；thr；serpheval(v)ile；leu；met；phe；alaleu
[0066]
药物组合物
[0067]
本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物含有(a)抗vegf纳米抗体；(b)穿膜肽；和(c)药学上可接受的载体。
[0068]
本发明所述药物组合物中的“活性成分”是指抗vegf纳米抗体和穿膜肽，穿膜肽能够将vegf纳米抗体有效带入细胞内，可用于治疗vegf相关的癌症和眼部疾病。
[0069]“安全有效量”指的是：活性成分的量足以明显改善病情或症状，而不至于产生严重的副作用。本发明的药物组合物在使用时，极大多数病例一般每天应用的总剂量应低于(或少数病例等于或略大于)各个单药的每天常用剂量，当然，所用的活性成分的有效剂量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而有所变化。
[0070]“药学上可接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、糖醇、表面活性剂、粉剂、ph调节剂、抑菌剂、防腐剂、增稠剂、稳定剂、营养剂及其组合。
[0071]
药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。本发明的药物组合也可以被制成粉剂用于雾化吸入。
[0072]
在本发明中，所述药物组合物可通过视网膜下或玻璃体内注射向眼睛施用。一种优选的剂型是注射剂。
[0073]
本发明药物组合物还可与其他治疗剂，如治疗癌症或眼部疾病的治疗剂一起使用。
[0074]
应用
[0075]
如上所述，本发明的纳米抗体药物组合物有广泛生物应用价值和临床应用价值，其应用涉及到与vegf相关的疾病的诊断和治疗、基础医学研究、生物学研究等多个领域。一个优选的应用是用于针对vegf的临床诊断和靶向治疗，包括vegf相关的癌症和眼部疾病。
[0076]
本发明还提供了用本发明的药物组合物对vegf相关疾病或病症进行治疗的方法，包括给需要的对象施用活性成分(a)抗vegf纳米抗体和活性成分(b)穿膜肽，或者施用本发明第一方面所述的药物组合物。
[0077]
当本发明两种活性成分被用于上述用途时，可与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合，如溶剂、稀释剂等，而且可以用如下形式口服给药：片剂、丸剂、胶囊、可分散的粉末、颗粒或悬浮液(含有如约0.05-5％悬浮剂)、糖浆(含有如约10-50％糖)、和酏剂(含有约20-50％乙醇)，或者以无菌可注射溶液或悬浮液形式(在等渗介质中含有约0.05-5％悬浮剂)进行非肠胃给药。例如，这些药物制剂可含有与载体混合的约0.01-99％，更佳地约为0.1％-90％(重量)的活性成分。
[0078]
本发明的两种活性成分或药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：眼内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、口服、瘤内或局部给药。优选的给药途径包括口服给药、眼内给药或静脉内给药。
[0079]
本发明的主要优点包括：
[0080]
(a)本发明vegf纳米抗体药物组合物能够有效穿透细胞膜，能够显著促进vegf纳米抗体细胞膜穿透性。
[0081]
(b)本发明vegf纳米抗体药物组合物能够有效渗透癌细胞、角膜细胞，且随着穿膜肽浓度的提高，vegf纳米抗体对细胞的摄入效果显著提高。
[0082]
(c)本发明vegf纳米抗体药物组合物在低剂量时无细胞毒性，在高剂量时只有轻微毒性。
[0083]
下面的具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如(sambrook和russell等人，分子克隆：实验室手册(molecular cloning-a laboratory manual)(第三版)(2001)cshl出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0084]
通用材料
[0085]
实施例中所用的穿膜肽penetratin是利用参考文献《sgolastra f,deronde b m,sarapas j m,et al.designing mimics of membrane active proteins[j].accounts of chemical research,2013,46(12):2977-87》所制备得到，其突变体参考文献《中国发明专利cn101355970a》、《sgolastra f,deronde b m,sarapas j m,et al.designing mimics of membrane active proteins[j].accounts of chemical research,2013,46(12):2977-87》、《中国发明专利cn108976288a》所制备得到。
[0086]
vegf纳米抗体为申请人自主研发的结合vegf的纳米抗体，氨基酸序列如seq id no:4所示。实施例中用作对照的单抗eylea是本领域结合vegf的常规单抗，购自拜耳(中国)有限公司。
[0087]
实施例1穿膜肽penetratin及其突变体结合vegf纳米抗体的穿膜效果
[0088]
将恶性黑色素瘤细胞a375细胞消化，完全培养基中和后离心去上清，用新鲜的培养基重悬细胞，接种至6孔板，每孔5e5个细胞，培养24h；提前将三种穿膜肽penetratin-wt(氨基酸序列如seq id no:5所示)、penetratin-mut1(氨基酸序列如seq id no:6所示)、penetratin-mut2(氨基酸序列如seq id no:7所示)与vegf纳米抗体(氨基酸序列如seq id no:4所示)混合，室温放置1天；第二天弃去细胞培养上清液，dmem空白培养基洗涤2遍，再加入含穿膜肽/抗体混合物的dmem培养基(加入的dmem培养基中含有9um的纳米抗体，各穿膜肽与抗体的摩尔比为3:1)，继续培养4h；再用含0.02mg/ml肝素钠的10mm pbs洗2次，弃上清并加入胰酶消化细胞，收集细胞转移至96孔板，加入固定液室温放置20min；随后用pbs清洗细胞，加入甲醇孵育10min；pbs洗涤细胞2次，加入稀释的生物素化的羊抗vegf多抗(1:500稀释使用)，室温孵育20min，pbs洗涤细胞一次，加入稀释的sa-pe荧光抗体；pbs洗涤细胞后用流式细胞仪检测pe信号。
[0089]
结果如图1所示，penetratin-mut2与vegf纳米抗体混合后能够有效穿透细胞膜，将vegf纳米抗体带入细胞内，其穿膜效果显著优于野生型penetratin-wt及突变体penetratin-mut 1。
[0090]
实施例2不同vegf抗体与穿膜肽混合物在不同类型细胞中的渗透效果
[0091]
分别将恶性黑色素瘤细胞a375、结肠腺癌细胞ht29、肺癌细胞h1299、乳腺癌细胞mcf7、角膜上皮细胞hcec五种细胞消化，完全培养基中和后离心去上清，用新鲜的培养基重悬细胞，接种至6孔板，5e5/ml个细胞每孔，培养24h；提前按照不同摩尔比例将penetratin-mut2分别与vegf纳米抗体、市售单抗eylea混合，室温放置1天；第二天弃去细胞培养上清
液，dmem空白培养基洗涤2遍，再加入含穿膜肽/抗体混合物的dmem培养基(加入的dmem培养基中含有9um的抗体，穿膜肽与抗体的摩尔比为1:1、2:1或3:1)，继续培养4h；再用含0.02mg/ml肝素钠的10mm pbs洗2次，弃上清并加入胰酶消化细胞，收集细胞转移至96孔板，加入固定液室温放置20min；随后用pbs清洗细胞，加入甲醇孵育10min；pbs洗涤细胞2次，对于vegf纳米抗体组加入稀释的生物素化的羊抗vegf多抗(1:500稀释使用)，室温孵育20min，pbs洗涤细胞一次，加入稀释的sa-pe荧光抗体；对于市售单抗eylea组加入1：200稀释的goat anti human igg-pe抗体；pbs洗涤细胞后用流式细胞仪检测pe信号。
[0092]
结果如图2a和图2b所示，vegf纳米抗体与penetratin-mut2混合后对于多种细胞的渗透穿膜效果显著优于市售单抗eylea与penetratin-mut2混合物；且随着penetratin-mut2浓度的提高，vegf纳米抗体对各类型细胞的摄入效果显著提高。
[0093]
实施例3vegf纳米抗体与穿膜肽混合物对不同类型细胞的毒性
[0094]
分别将恶性黑色素瘤细胞a375、结肠腺癌细胞ht29、肺癌细胞h1299、乳腺癌细胞mcf7、角膜上皮细胞hcec五种细胞消化，完全培养基中和后离心去上清，用新鲜的培养基重悬细胞，按照2e4/孔铺至96孔板中，37℃，5％co2培养24h；弃上清，分别以100ul/孔的量加入含vegf纳米抗体、penetratin-mut2、penetratin-mut3(氨基酸序列如seq id no:8所示)、penetratin-mut2/vegf纳米抗体混合物(3:1)、penetratin-mut3/vegf纳米抗体混合物(3:1)(按照图3所示数据调整了vegf纳米抗体和穿膜肽的顺序，请复核)的dmem培养基，继续培养4h，37℃，5％co2；弃上清，完全培养基洗涤细胞一次，加入新的完全培养基100ul/孔，继续培养24h；每孔加入cck8 10ul，37℃孵育4h，酶标仪读数od450。
[0095]
结果如图3a和图3b所示，低剂量组(9μm)vegf纳米抗体、penetratin-mut2、penetratin-mut3、penetratin-mut2/vegf纳米抗体混合物(3:1)、penetratin-mut3/vegf纳米抗体混合物(3:1)对五种类型细胞基本无毒副作用作用；而高剂量组(90μm)vegf纳米抗体/penetratin-mut2混合物对五种细胞表现出轻微毒性作用，高剂量组(90μm)vegf纳米抗体/penetratin-mut3混合物对五种细胞表现出明显毒性作用。
[0096]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。

技术特征：
1.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有：(a)抗vegf纳米抗体；(b)穿膜肽；和(c)药学上可接受的载体。2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述抗vegf纳米抗体的互补决定区(cdr)包括seq id no:1所示的cdr1、seq id no:2所示的cdr2、和seq id no:3所示的cdr3。3.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述抗vegf纳米抗体的氨基酸序列如seq id no:4所示。4.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述穿膜肽包括penetratin及其衍生物。5.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述穿膜肽的氨基酸序列如seq id no:7、seq id no:5、seq id no:6或seq id no:8所示。6.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有：(a)氨基酸序列如seq id no:4所示的抗vegf纳米抗体；(b)氨基酸序列如seq id no:7所示的穿膜肽；和(c)药学上可接受的载体。7.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型包括注射剂、眼药水、眼用凝胶或眼药膏。8.一种权利要求1所述的药物组合物的用途，其特征在于，用于制备治疗vegf相关疾病或病症的药物。9.一种权利要求1所述的药物组合物的制备方法，其特征在于，包括步骤：(i)分别提供抗vegf纳米抗体和穿膜肽，(ii)将所述的抗vegf纳米抗体与穿膜肽进行物理混合，从而得到一混合物，和(iii)在适合制备药物的条件下，将所述混合物与药学上可接受的载体混合，从而制得所述的药物组合物。10.一种药盒，其特征在于，所述药盒含有：(i)第一容器，以及装于该第一容器中的活性成分(a)抗vegf纳米抗体，或含有活性成分(a)的药物；(ii)第二容器，以及装于该第二容器中的活性成分(b)穿膜肽，或含有活性成分(b)的药物；以及(iii)说明书，所述说明书中记载了联合给予活性成分(a)和活性成分(b)从而治疗vegf相关疾病或病症的说明。

技术总结
本发明提供了含VEGF纳米抗体的药物组合物及其用途。具体地，本发明提供了一种药物组合物，其含有VEGF纳米抗体，穿膜肽和药学上可接受的载体。本发明的药物组合物能够有效穿透细胞膜，所含有的穿膜肽能够显著促进VEGF纳米抗体的细胞膜穿透性。本发明的药物组合物能够有效渗透癌细胞、角膜细胞，随着穿膜肽浓度的提高，VEGF纳米抗体对细胞的摄入效果显著提高，且在高剂量时只有轻微毒性，具有非常好的安全性。安全性。


技术研发人员：万亚坤 朱敏 盖军伟 李光辉 沈晓宁
受保护的技术使用者：上海洛启生物医药技术有限公司
技术研发日：2020.11.23
技术公布日：2022/5/25