一种香豆素衍生物及其制备方法和应用

1.本发明属于有机合成技术领域，尤其涉及一种香豆素衍生物及其制备方法和应用。


背景技术：

2.锡离子是生物体必需的微量元素之一，具有重要的生理功能，其主要的生理功能表现在抗肿瘤方面，因为锡在人体的胸腺中能够产生抗肿瘤的锡化合物，抑制癌细胞的生成。锡还促进蛋白质和核酸的合成，有利于身体的生长发育；并且组成多种酶以及参与黄素酶的生物反应，能够增强体内环境的稳定性等。荧光探针可以针对生物体内目标物的浓度、分布等信息进行实时检测。基于上述原因，设计合成性能卓越的sn
4+
荧光探针是研究的热点，对生物学、化学和临床医学等领域都具有十分重要的意义。
3.有机小分子荧光探针具有结构可修饰、成本较低、操作简单、灵敏度高、选择性好、无创可视化分析和实时监测等优点，在金属离子检测中得到广泛关注并在疾病诊断、手术导航等方面得到科研工作者的关注。荧光增强传感材料因其可以降低检测失误率，保持对复杂体系的检测准确率，可同时对不同分析物用多种检测物进行检测。但是，目前报道的sn
4+
荧光化学探针在实际应用中仍受到一些限制，如：有的合成困难、结构复杂；有的膜渗透性能欠佳；有的专一性不够，容易受其它金属离子的干扰；有的在锡离子的检测过程中需要有机溶剂的助溶，增加了检测体系毒性，限制了荧光探针在生物体系中的应用。
4.因此，有必要开发一种高灵敏度、响应迅速、低细胞毒性的sn
4+
的荧光探针化合物。


技术实现要素：

5.本发明旨在至少解决现有技术中存在的上述技术问题之一。为此，本发明提供了一种香豆素衍生物。
6.本发明还提供了一种香豆素衍生物的制备方法。
7.本发明还提供了一种香豆素衍生物的应用。
8.本发明还提供了一种荧光探针。
9.本发明的第一方面提供了一种香豆素衍生物，所述香豆素衍生物具有如式(ⅰ)所示的结构式：
10.11.本发明关于香豆素衍生物的技术方案中的一个技术方案，至少具有以下有益效果：
12.本发明的香豆素衍生物的激发和发射光谱在可见光区，用于锡离子荧光检测时具有高选择性、高灵敏度和高化学稳定性；香豆素衍生物还具有较好的水溶性，可在水环境体系中进行锡离子检测，对于细胞具有低毒性。
13.本发明的第二方面提供一种香豆素衍生物的制备方法，包括如下步骤：
14.将n-苯乙基苯并噻唑盐、4-羟基香豆素、碱和溶剂混合，在20℃～160℃下进行反应，即得香豆素衍生物，所述n-苯乙基苯并噻唑盐具有如式(ⅱ)所示的结构式：
[0015][0016]
其中，x为溴、氯或碘。
[0017]
本发明关于香豆素衍生物制备方法中的一个技术方案，至少具有以下有益效果：
[0018]
该制备方法以n-苯乙基苯并噻唑盐和4-羟基香豆素为主要原料合成荧光探针化合物，其合成步骤简单、方法操作安全、原料无毒、价格低廉。另外，该制备方法无需使用催化剂即可实现反应，降低了生产成本。
[0019]
根据本发明的一些实施方式，所述n-苯乙基苯并噻唑盐通过如下方法制备得到：将苯并噻唑和混合进行反应，即得n-苯乙基苯并噻唑盐。
[0020]
其中，x为溴、氯或碘。
[0021]
根据本发明的一些实施方式，所述n-苯乙基苯并噻唑盐与所述4-羟基香豆素的摩尔比为1：(1～2)。
[0022]
根据本发明的一些实施方式，所述碱的质量为所述n-苯乙基苯并噻唑盐质量的10～100％。
[0023]
根据本发明的一些实施方式，所述溶剂与所述n-苯乙基苯并噻唑盐的体积摩尔比为(2～5)ml：1mmol。
[0024]
根据本发明的一些实施方式，所述碱为无机碱和/或有机碱。
[0025]
根据本发明的一些实施方式，所述无机碱包括氢氧化钾、氢氧化钙或氢氧化钠中的至少一种。
[0026]
根据本发明的一些实施方式，所述有机碱包括醋酸钠、甲醇钠、叔丁醇钠、叔丁醇钾或三乙胺中的至少一种。
[0027]
根据本发明的一些实施方式，所述溶剂包括乙醇、乙酸乙酯、异丙醇、乙二醇、乙腈、甲苯、1，4-二氧六环、1，2-二氯乙烷或水中的至少一种。
[0028]
根据本发明的一些实施方式，所述反应的时间为2～16h。
[0029]
根据本发明的一些实施方式，所述反应结束后还包括提纯。
[0030]
根据本发明的一些实施方式，所述提纯为柱层析提纯。
[0031]
根据本发明的一些实施方式，所述柱层析提纯的洗脱液为石油醚：二氯甲烷：乙酸乙酯体积比0.5～5：0～20：1的混合溶液。
[0032]
本发明的第三方面提供一种香豆素衍生物在荧光探针、高灵敏度传感器或锡离子检测器中的应用。
[0033]
根据本发明的一些实施方式，所述香豆素衍生物作为锡离子荧光探针在活细胞成像试剂制备中的应用。
[0034]
本发明的第四方面提供一种荧光探针，包含所述的香豆素衍生物；或由上述方法制备得到的香豆素衍生物。
附图说明
[0035]
图1是本发明实施例1中n-苯乙基苯并噻唑盐的核磁共振氢谱图；
[0036]
图2是本发明实施例1中n-苯乙基苯并噻唑盐的核磁共振碳谱图；
[0037]
图3是本发明实施例1的香豆素衍生物的核磁共振氢谱图；
[0038]
图4是本发明的实施例1的香豆素衍生物的核磁共振碳谱图；
[0039]
图5是本发明的实施例1的香豆素衍生物在不同金属离子条件下的荧光性能测试结果图；
[0040]
图6是验证本发明的实施例1的香豆素衍生物对锡离子的专一性的测试结果图；
[0041]
图7是本发明的实施例1的香豆素衍生物在不同sn
4+
浓度时的荧光性能测试结果图；
[0042]
图8是实施例1的香豆素衍生物的荧光强度随sn
4+
的摩尔分数变化的函数关系图；
[0043]
图9是本发明实施例1的香豆素衍生物的配位结构图；
[0044]
图10是本发明实施例1的香豆素衍生物在不同sn4+浓度时的对荧光细胞的毒性测试结果图；
[0045]
图11是本发明实施例1的香豆素衍生物溶液染色的hepg2细胞的共聚焦荧光图像，其中a为暗场；b为明场；c为a和b的叠加图像。
具体实施方式
[0046]
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0047]
本发明所采用的试剂、方法和设备，如无特殊说明，均为本技术领域常规试剂、方法和设备。
[0048]
以下实施例及对比例中采用的原料如下：
[0049]
hepg2细胞：购自上海碧云天生物技术有限公司。
[0050]
核磁共振光谱数据通过bruker avance 500mhz核磁共振谱仪来测定，以cdcl3，dmso-d6，cd3od或d6-丙酮为溶剂(以ppm为单位)，用tms(0ppm)或氯仿(7.26ppm)作为参照标准。当出现多重峰的时候，将使用下面的缩写：s(singlet，单峰)，s，s(singlet，singlet，
单峰，单峰)，d(doublet，双峰),t(triplet，三重峰)，m(multiplet，多重峰)，br(broadened，宽峰)，dd(doublet of doublets，双二重峰)，ddd(doublet of doublet of doublets，双双二重峰)，dt(doublet of triplets，双三重峰)，ddt(doublet of doublet of triplets，双双三重峰)，td(triplet of doublets，三双重峰)，br.s(broadened singlet，宽单峰)。偶合常数j，单位用赫兹(hz)表示。
[0051]
实施例1
[0052]
首先制备n-苯乙基苯并噻唑盐，其结构式和制备方法如下：
[0053][0054]
将0.945g苯并噻唑(7mmol)和1.417g的β-溴苯乙烷(7.7mmol)混合均匀，在60℃下搅拌反应12h，得粗产物；粗产物经乙醚洗涤干燥后即可得纯净的n-苯乙基苯并噻唑盐；该制备方法得产率为80％。
[0055][0056]
所得的n-苯乙基苯并噻唑盐的核磁共振氢谱和碳谱如图1和图2所示，结构表征数据如下：
[0057]
核磁共振氢谱数据：1h nmr(500mhz,dmso-d6)δ10.49(s,1h),8.55(dd,j＝8.4,1.2hz,1h),8.48(d,j＝8.5hz,1h),7.93(dd,j＝8.5,7.2,1.3hz,1h),7.86(dd,j＝8.2,7.2,1.0hz,1h),7.30
–
7.21(m,5h),5.16(dd,j＝8.2,6.7hz,2h),3.30(t,j＝7.4hz,2h).
[0058]
碳谱数据：
13
c nmr(126mhz,dmso-d6)δ165.15,140.49,136.84,131.92,130.08,129.41,129.07,128.90,127.56,125.82,117.82,53.71,34.92.
[0059]
实施例1提供一种香豆素衍生物，(e)-3-(3-苯乙基苯并噻唑-2(3h)-亚基)苯并二氢吡喃-2,4-二酮，其结构式如式(ⅰ)所示，制备方法如下：
[0060][0061]
取上述制备得到的0.319g n-苯乙基苯并噻唑盐(1mmol)、0.243g 4-羟基香豆素
(1.5mmol)、0.032g naoh(n-苯乙基苯并噻唑盐质量的10％)、1ml乙酸乙酯混合均匀，在80℃下搅拌反应8小时，得到粗产物；粗产物经过柱层析提纯即得到香豆素衍生物；该制备方法的产率为86％。
[0062]
结构确认：所得的香豆素衍生物的核磁共振氢谱和碳谱如图3和图4所示，结构表征数据如下：
[0063]
核磁共振氢谱数据：1h nmr(500mhz，cdcl3)δ8.12(dd,j＝8.1，1.7hz，1h)，7.86(dd，j＝8.0，1.1hz，1h)，7.69(d，j＝8.4hz，1h)，7.58(qd,j＝7.6，1.5hz，2h)，7.49(t，j＝7.6hz，1h)，7.31
–
7.27(m，3h)，7.08
–
7.01(m，3h)，6.84(dd，j＝7.2，2.2hz，2h)，5.03(t，j＝7.2hz，2h)，3.01(t，j＝7.1hz，2h)。
[0064]
碳谱数据：
13
c nmr(126mhz，cdcl3)δ175.62，171.26，161.45，153.72，139.79，136.39，133.38，129.97，128.67，128.44，127.67，127.20，126.27，126.04，123.72，122.73，120.78，116.61，114.67，94.23，53.16，34.36。
[0065]
高分辨质谱(电喷雾电离质谱)：c
24h18
no3s[m+h]
+
的理论计算值：400.1002；测试数据：400.0998。
[0066]
实施例2
[0067]
实施例2提供一种香豆素衍生物，(e)-3-(3-苯乙基苯并噻唑-2(3h)-亚基)苯并二氢吡喃-2,4-二酮，制备方法包括以下步骤：
[0068]
将0.319g n-苯乙基苯并噻唑盐(1mmol)、0.244g 4-羟基香豆素(1.5mmol)、0.135g的koh(n-苯乙基苯并噻唑盐质量的50％)、2ml甲苯混合均匀，20℃下搅拌反应24小时，得到粗产物；粗产物经过柱层析提纯即得到香豆素衍生物；该制备方法的产率为63％，其表征结果与实施例1相同。
[0069]
实施例3
[0070]
实施例3提供一种香豆素衍生物，(e)-3-(3-苯乙基苯并噻唑-2(3h)-亚基)苯并二氢吡喃-2,4-二酮，制备方法包括以下步骤：
[0071]
将0.160g n-苯乙基苯并噻唑盐(0.5mmol)、0.162g 4-羟基香豆素(1mmol)、0.160g的naco3(n-苯乙基苯并噻唑盐质量的100％)、2.5ml乙腈混合均匀，80℃下搅拌反应2小时，得到粗产物；粗产物经过柱层析提纯即得到香豆素衍生物；该制备方法的产率为54％，其表征结果与实施例1相同。
[0072]
实施例4
[0073]
实施例4提供一种香豆素衍生物，(e)-3-(3-苯乙基苯并噻唑-2(3h)-亚基)苯并二氢吡喃-2,4-二酮，制备方法包括以下步骤：
[0074]
将0.239g n-苯乙基苯并噻唑盐(0.75mmol)、121g 4-羟基香豆素(0.75mmol)、0.179g的ca(oh)2(n-苯乙基苯并噻唑盐质量的75％)、3ml乙醇混合均匀，70℃下搅拌反应5小时，得到粗产物；粗产物经过柱层析提纯即得到香豆素衍生物；该制备方法的产率为56％，香豆素衍生物的表征结果与实施例1相同。
[0075]
实施例5
[0076]
实施例5提供一种香豆素衍生物，(e)-3-(3-苯乙基苯并噻唑-2(3h)-亚基)苯并二氢吡喃-2,4-二酮，制备方法包括以下步骤：
[0077]
将0.080g n-苯乙基苯并噻唑盐(0.25mmol)、0.081g 4-羟基香豆素(0.5mmol)、
0.08g的三乙胺(n-苯乙基苯并噻唑盐质量的10％)、3ml水混合均匀，100℃下搅拌反应16小时，得到粗产物；粗产物经过柱层析提纯即得香豆素衍生物；该制备方法的产率为59％，其表征结果与实施例1相同。
[0078]
实施例6
[0079]
实施例6提供一种香豆素衍生物，(e)-3-(3-苯乙基苯并噻唑-2(3h)-亚基)苯并二氢吡喃-2,4-二酮，制备方法包括以下步骤
[0080]
将0.255g n-苯乙基苯并噻唑盐(0.8mmol)、0.162g 4-羟基香豆素(1mmol)、0.127g的naoh(n-苯乙基苯并噻唑盐质量的50％)、4ml乙二醇混合均匀，160℃下搅拌反应12小时，得到粗产物；粗产物经过柱层析提纯即得到香豆素衍生物；该制备方法的产率为68％，其表征结果与实施例1相同。
[0081]
实施例2～6中的n-苯乙基苯并噻唑盐的结构式和制备方法与实施例1相同。
[0082]
性能测试
[0083]
配制探针溶液：配置浓度为100μm的实施例1的(e)-3-(3-苯乙基苯并噻唑-2(3h)-亚基)苯并二氢吡喃-2,4-二酮的甲醇溶液，即为探针溶液，常温保存。
[0084]
配制金属离子溶液：所述金属离子包括：fe
2+
、mg
2+
、cu
+
、cu
2+
、ni
2+
、mn
2+
、co
2+
、li
+
、k
+
、ba
2+
、cd
2+
、ca
2+
、hg
2+
、al
3+
、fe
3+
和sn
4+
；其溶液分别由对应的盐酸盐制备。分别称取一定量的金属盐，溶于10ml蒸馏水中，配制成10-2
mol/l的金属离子溶液，保存备用。
[0085]
荧光性能测试
[0086]
实验例1
[0087]
待测液配制：取0.5ml配制的探针溶液和0.5ml配制的不同金属离子溶液，与4ml ch3oh-h2o(v:v＝1:1)溶液混合，得到不同金属离子的待测液。
[0088]
空白液配制：取0.5ml配制的探针溶液与2.5ml水和2ml甲醇溶液混合。
[0089]
利用荧光光谱对待测液的荧光强度进行分析，分析结果如图5所示。
[0090]
由图5可知，待测液中，当金属离子为fe
2+
、mg
2+
、cu
+
、cu
2+
、ni
2+
、mn
2+
、co
2+
、li
+
、k
+
、ba
2+
、cd
2+
、ca
2+
、hg
2+
、al
3+
、fe
3+
时，其荧光强度有不同程度变化。但sn
4+
待测液的荧光强度出现明显的荧光衰减(各待测液统一标记为“香豆素衍生物+m”，f0为空白液荧光，f为待测液荧光，测量在254nm波长处的紫外吸收，f与f0的比例作为强度变化)。
[0091]
实验例2
[0092]
为了进一步验证该香豆素衍生物对锡离子的专一性，进行了竞争实验。将sn
4+
溶液(10μm)与相同浓度的上述其他任意一种金属离子溶液一并加入配制好的的探针溶液中，分别测试其它竞争离子对香豆素衍生物sn
4+
选择性的影响，测试结果如图6所示(各测试液统一标记为“香豆素衍生物+m+sn”)。可以看出，加入其它竞争离子前后，该香豆素衍生物对sn
4+
的检测几乎没有变化，说明设计的香豆素衍生物探针对sn
4+
具有很强的选择性，能满足实际应用需求。
[0093]
实验例3
[0094]
在配制好的探针溶液中添加不同浓度的sn
4+
，测试其荧光性能，以确定该香豆素衍生物的sn
4+
检测范围及检测限。测试结果如图7所示，sn
4+
浓度依次为0、5
×
10-9
m、5
×
10-8
m、5
×
10-6
m、5
×
10-5
m、6
×
10-5
m、7
×
10-5
m、8
×
10-5
m、9
×
10-5
m、1
×
10-4
m，而荧光强度从上到下对应依次减弱，表明该荧光探针化合物的荧光强度随着sn
4+
浓度的增加逐渐减弱，当sn
4+
浓度
达到1
×
10-4
m时，该化合物的荧光强度出现了大幅度的衰减。该化合物对sn
4+
检测范围从5
×
10-9
m到9
×
10-5
m，其检测限为5
×
10-9
m，表明该化合物对sn
4+
的检测能力较好，具有较高的实际应用价值。
[0095]
实验例4
[0096]
为了进一步确认探针与金属离子之间的作用机理，我们利用job’s plot进行了初步分析。具体操作方法如下：在保证总浓度恒定的情况下(10μm)，测试探针和金属离子不同摩尔比时在426nm的荧光发射光谱，并根据结果绘制荧光强度随sn
4+
摩尔分数变化的函数关系图，如图8所示。
[0097]
由图8可知，当锡离子的摩尔分数达到0.3时，出现一处拐点，说明锡离子与香豆素衍生物之间是以1：2的关系进行配位的。根据以上结果，我们推测一个可能的配位结构(图9中所示的结构式)。
[0098]
实验例5
[0099]
为了探究探针在使用过程中对荧光细胞的毒性，我们做了细胞成像和细胞毒性实验。选用mtt法来评价探针的毒性，不同浓度的探针对hepg2细胞在37℃时的细胞存活率的影响如图10所示。显而易见，随着探针浓度的增加，并没有明显的细胞毒性响应(细胞存活率≥80％)。这说明探针在实际应用的条件下，对荧光细胞成像显示了较低的毒性。
[0100]
接下来，通过倒置荧光显微镜检查荧光探针化合物的活细胞染色能力。选择激发波长为426nm时，在37℃下用10μm荧光探针溶液对hepg2细胞染色15分钟，观察到的细胞内荧光情况如图11所示。亮场实验表明在整个成像过程中，细胞是真实存在的。显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

技术特征：
1.一种香豆素衍生物，其特征在于，所述香豆素衍生物具有如式(ⅰ)所示的结构式：2.根据权利要求1所述的香豆素衍生物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将n-苯乙基苯并噻唑盐、4-羟基香豆素、碱和溶剂混合，在20℃～160℃下进行反应，即得香豆素衍生物，所述n-苯乙基苯并噻唑盐具有如式(ⅱ)所示的结构式：其中，x为溴、氯或碘。3.根据权利要求2所述的香豆素衍生物的制备方法，其特征在于，所述n-苯乙基苯并噻唑盐与所述4-羟基香豆素的摩尔比为1：(1～2)。4.根据权利要求2所述的香豆素衍生物的制备方法，其特征在于，所述碱的质量为所述n-苯乙基苯并噻唑盐质量的10～100％。5.根据权利要求2所述的香豆素衍生物的制备方法，其特征在于，所述溶剂与所述n-苯乙基苯并噻唑盐的体积摩尔比为(2～5)ml：1mmol。6.根据权利要求2所述的香豆素衍生物的制备方法，其特征在于，所述碱为无机碱和/或有机碱；优选地，所述无机碱包括氢氧化钾、氢氧化钙或氢氧化钠中的至少一种；优选地，所述有机碱包括醋酸钠、甲醇钠、叔丁醇钠、叔丁醇钾或三乙胺中的至少一种。7.根据权利要求2所述的香豆素衍生物的制备方法，其特征在于，所述溶剂包括乙醇、乙酸乙酯、异丙醇、乙二醇、乙腈、甲苯、1，4-二氧六环、1，2-二氯乙烷或水中的至少一种。8.根据权利要求2所述的香豆素衍生物的制备方法，其特征在于，所述反应的时间为2～16h。9.根据权利要求1所述的香豆素衍生物在荧光探针、高灵敏度传感器或锡离子检测器中的应用。优选地，所述香豆素衍生物作为锡离子荧光探针在活细胞成像试剂制备中的应用。10.一种荧光探针，其特征在于，包含权利要求1所述的香豆素衍生物；或者包含由权利要求2～8任一项所述方法制备得到的香豆素衍生物。

技术总结
本发明提供一种香豆素衍生物及其制备方法和应用。该香豆素衍生物的具有如式(Ⅰ)所示的结构式：本发明的香豆素衍生物的激发和发射光谱在可见光区，用于锡离子荧光检测时具有高选择性、高灵敏度和高化学稳定性；香豆素衍生物还具有较好的水溶性，可在水环境体系中进行锡离子检测，对于细胞具有低毒性。可以用于对锡离子的荧光检测。可以用于对锡离子的荧光检测。可以用于对锡离子的荧光检测。


技术研发人员：陈修文 徐盛挻 师建毅 蔡泽淳 廖楚仪 范永博 朱忠智
受保护的技术使用者：五邑大学
技术研发日：2022.02.14
技术公布日：2022/5/25