一株牛皮肤成纤维永生化细胞系的建立方法及应用

1.本发明涉及细胞领域，特别是涉及一株牛皮肤成纤维永生化细胞系的建立方法。


背景技术：

2.在许多实际科学研究中，常常需要体外培养时间长且性状稳定的具有“永生化”特性的细胞。细胞永生化是细胞生物学领域长久以来研究的难点和热点之一。细胞永生化(cell immortalization)是指体外培养的细胞由于自身改变或受外界条件的影响，逾越细胞的衰老期(m1期)和危机期(m2期)，始终维持端粒长度稳定，从而获得无限增殖能力的过程。一直以来，科研工作者都在试图解决这一问题。
3.对于细胞衰老和肿瘤形成等机理的不断深入研究，促使科研工作者对细胞永生化有了深入的理解。目前，能够高效建立永生化细胞系的方法，主要有以下几种。第一，化学物质致细胞癌变建立永生化细胞。第二，物理方法致细胞癌变建立永生化细胞系。第三，生物方法致细胞永生化。第四，dna致瘤病毒感染建立永生化细胞。第五，人端粒酶逆转录酶基因 (human telomerase catalytic subunit,htert)介导的细胞永生化。经过多年实践，利用这些方法使某些原本传代性差、增殖速度慢和易衰老死亡的细胞“永生化”，为基础和应用研究提供了宝贵的试验材料。上述前四种建立“永生化”细胞的方法虽有一定的优势，但均存在促使细胞恶性转化的风险和永生化效率低的特点。近年来研究报道表明将人源htert转入细胞内可以促使正常细胞跨越m1和m2这一障碍，能够保持原代细胞正常的生物学特性，核型也没有发生改变，也不会致使细胞癌变，在基础研究、临床应用和生物工程领域具有无可比拟的优势，该方法被成功的应用到多种“永生化”细胞系的建立过程。牛结节性皮肤病病毒等大型反刍动物疫病的研究需要大量的牛源永生化细胞系，但是目前还没有关于牛皮肤永生化细胞系相关研究的报道。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一株牛皮肤成纤维永生化细胞系的建立方法及应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过将htert基因整合入牛皮肤成纤维细胞基因组中，经过嘌呤霉素药物筛选，细胞亚克隆后获得一株性能稳定的牛皮肤成纤维永生化细胞株，为牛结节性皮肤病病毒等大型反刍动物疫病提供了重要的基础研究和应用研究试验材料，为相关病毒的分离培养和检测提供了重要的技术平台。
5.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
6.本发明提供一株牛皮肤成纤维永生化细胞系的建立方法，包括以下步骤：
7.步骤1：将离体的胎牛皮肤组织预处理后剪碎，用胰酶消化液消化，经过滤、离心后，收集细胞沉淀，将所述的细胞沉淀用10％fbs的dmem培养基吹散，培养，待细胞贴壁稳定后，更换新鲜培养基，得到原代牛皮肤成纤维细胞；
8.步骤2：克隆htert基因，并构建htert基因慢病毒载体，然后将所述htert基因慢病毒转导所述原代牛皮肤成纤维细胞，经培养、筛选及鉴定，得到牛皮肤成纤维永生化细胞
系。
9.优选的是，步骤1中，所述胎牛皮肤组织预处理包括以下步骤：
10.在无菌条件下取出胎牛皮肤组织，将新鲜的胎牛皮肤组织样品完全浸泡在75％酒精15-20min，之后使用5
×
三抗生理盐水浸洗3-5次，然后用 2
×
三抗pbs溶液再次清洗。
11.优选的是，步骤1中，采用质量分数为0.125％胰酶消化液消化。
12.优选的是，步骤1中，离心条件为：1000rpm/min，离心5min。
13.优选的是，步骤2中，克隆htert基因的引物为：
14.htert for：5＇－atgccgcgcgctccccgctgccgagcc－3＇；
15.htert rev：5＇－gtccaggatggtcttgaagtctgaggg－3＇。
16.优选的是，步骤2包括以下步骤：
17.s1：将克隆得到的htert基因产物连接到表达质粒pcaggs和慢病毒穿梭质粒plv-puro，得到慢病毒包装质粒；
18.s2：将所述的慢病毒包装质粒与辅助质粒混合后，转导细胞，包装慢病毒，培养、过滤，取上清液；
19.s3：用所述上清液感染原代牛皮肤成纤维细胞，用含有嘌呤霉素的培养基培养，药物筛选3天后，更换一次新的培养基，继续进行药物筛选，细胞亚克隆后得到稳定表达htert基因的牛皮肤成纤维永生化细胞系。
20.优选的是，s2中，辅助质粒包括vsv-g和pxpax2，所述慢病毒包装质粒：vsv-g：pxpax2为2:1:2。
21.优选的是，s3中嘌呤霉素的浓度为0.5μg/ml。
22.本发明还提供所述的建立方法构建的牛皮肤成纤维永生化细胞系。
23.本发明还提供所述的牛皮肤成纤维永生化细胞系在构建反刍动物疫病细胞模型中的应用。
24.本发明公开了以下技术效果：
25.本发明将htert基因整合入牛皮肤成纤维细胞基因组中，启动htert 并使其表达，经过嘌呤霉素抗性筛选和细胞亚克隆后，获得了一株表型良好的牛皮肤成纤维永生化细胞株。经过间接免疫荧光、蛋白免疫印迹和细胞流式等多种实验方法验证，该细胞株细胞生长特性良好，生物特性稳定，便于培养传代，具备了“永生化”特性。本发明填补了牛皮肤永生化细胞系研究的空白，为牛结节性皮肤病病毒等大型反刍动物疫病提供了重要的基础研究和应用研究试验材料，为相关病毒的分离培养和检测提供了重要的技术平台。
附图说明
26.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
27.图1为本发明htert pcr扩增结果及亚细胞定位观察；a：扩增产物电泳检测结果；marker：dna分子质量(dl5000)，htert：htert pcr产物； b：htert亚细胞定位的观察结果；
28.图2为本发明不同传代次稳转htert牛皮肤成纤维细胞系的形态学观察结果；
29.图3为本发明稳转htert基因的第50代htert-csf的鉴定结果；a： htert间接免疫荧光的观察结果；b：htert蛋白免疫印迹的分析结果；
30.图4为本发明htert-csf流式分析结果；a：htert-csf和mock细胞流式单独分析结果；b：htert-csf和mock细胞流式合并分析结果；
31.图5为本发明htert-csf的染色体核型分析结果；
32.图6为lsdv感染htert-csf病变观察。
具体实施方式
33.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
34.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
35.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
36.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本技术说明书和实施例仅是示例性的。
37.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
38.实施例1一株牛皮肤成纤维永生化细胞系的建立方法
39.1、原代成纤维细胞的分离培养
40.在无菌超净台中取出胎牛皮肤组织，将新鲜的胎牛皮肤组织样品完全浸泡在75％酒精中，15min。然后，使用5
×
三抗生理盐水，浸洗3次，用 2
×
三抗pbs溶液，再次清洗，用无菌手术剪剪成细小的组织块，再用无菌镊子将皮肤组织拨散，随后将其放置在盛有0.125％胰酶消化液的细胞培养瓶中，置于磁力水平旋转仪器，室温消化1-2小时。消化完毕后，将组织消化液用100μm细胞滤网过滤，将滤液收集于无菌离心管中，随后置于离心机1000rpm/min，离心5min，取少许细胞放置于显微镜先观察细胞形态，按照1：9的比例，用无血清冻存液重悬细胞沉淀，冻存液-80℃冰箱中。取少许细胞用10％fbs的dmem培养基吹散，放置于t75细胞培养瓶中，待其贴壁稳定后，次日更换新鲜培养基，观察记录细胞生长情况。
41.2、htert基因的分子克隆
42.基于pubmed数据库中的htert序列(genbank基因登录号： nm_198253)，以人源cdna为模板，采用seq id no:1/seq id no:2特异性引物对(表1)，对tert基因进行扩增，pcr扩增反应体系(50μl)：cnda 模板2μl；htert for(10μm)，2μl；htert rev(10μm)2μl；
43.phanta max super-fidelity dna polymerase(诺唯赞高保真dna聚合酶)1μl；dntp mix(10mm)1μl；2
×
phanta max buffer 25μl； ddh2o 17μl。
44.pcr反应程序：95℃3min，1个循环；95℃15s，56℃15s， 72℃3min,30个循环；72℃5min，1个循环。pcr扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明已经成功克隆得到htert基因(见图1a)。
45.然后，利用带有pcaggs和plv-puro同源臂的seq id no:3/seq idno:4和seq id no:5/seq id no:6引物对(表1)，扩增上述htert目的片段，后将胶回收产物，利用诺唯赞clon express同源重组试剂盒，按照 1:2的比例，分别与真核表达质粒pcaggs和慢病毒穿梭质粒plv-pur连接，将测序比对正确的阳性质粒，分别命名为：pcaggs-htert和plv-puro
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htert。同时，如图1b，间接免疫荧光的结果也表明htert真核表达质粒已经成功构建且表达定位于细胞核内部。
46.表1pcr引物
[0047][0048]
3、htetr慢病毒转导牛原代皮肤细胞及嘌呤霉素药物筛选
[0049]
将慢病毒包装质粒plv-htert、vsv-g和pxpax2，按照质量比2:1:2的比例，转染293t细胞(大约80％融合度)，进行慢病毒包装。培养至24h，收取细胞上清，将所得上清1500rpm/min离5min，0.45μm过滤器滤掉细胞残渣。用100μl包装成功的慢病毒培养上清，转导原代牛皮肤成纤维细胞(primary cow skin fibroblasts cell line,primary csf)，同时设立细胞阴性对照。用含有嘌呤霉素的10％dmem培养基培养(浓度0.5 μg/ml)，药物筛选3天后，更换一次新的培养基，药物筛选5天左右。待阴性对照细胞，全部死亡后，将存活的细胞更换到6孔细胞板中继续药物筛选培养。将经过三次药物筛选的细胞，在96孔板中进行细胞亚克隆，待细胞长成单一克隆细胞株后，扩大培养冻存，用于后续验证。
[0050]
本试验中通过亚克隆成功的筛选得到一株阳性克隆细胞株，命名为 htert-csf，传至50代细胞仍然呈现长条梭状，细胞生长状态良好，活力较为旺盛(见图2)。
[0051]
4、htert稳转细胞系的鉴定
[0052]
为了验证htert的稳定表达情况，间接免疫荧光结果表明(图3a)：第50代htert-csf细胞100％呈现htert阳性，htert均位于细胞核内部，表明htert已经整合到牛皮肤成纤
维细胞的基因组上并持续稳定表达。同时，如图3b，蛋白免疫印迹的结果也表明：htert基因在第50代细胞 htert-csf中仍然高效表达。
[0053]
为了进一步验证htert稳定表达情况，对第50代的htert-csf细胞内的htert进行流式分析。如图4，相比较与原代皮肤成纤维细胞(绿色曲线)，第50代htert-csf细胞(红色曲线)出现了明显的峰迁移，表明 htert在细胞内高效稳定表达。
[0054]
接下来，为了证明稳转htert并没有改变原代牛皮肤成纤维细胞的染色体核型，将第50代的htert-csf细胞进行染色体核型分析，以便确定 htert-csf细胞的染色体数目及倍性，了解各染色体的形态特征。选择染色体形态良好、比较分散，且染色清晰的图像进行观察并计数(图5)。根据染色体形态和着丝粒位置将染色体排列起来，发现htert-csf细胞的染色体数目为60条(2n＝60)，核型并没有发现明显异常。
[0055]
实施例2牛结节性皮肤病病毒感染htert-csf病变观察
[0056]
牛结节性皮肤病(lumpy skin disease，lsd)又被俗称为牛结节疹、牛结节性皮炎或牛疙瘩皮肤病，是由痘病毒科羊痘病毒属中的成员牛结节性皮肤病病毒(lumpy skin disease virus，lsdv)引起的一种牛的急性、亚急性传染病。目前，还缺少针对该疫病的特异性疫苗和较好的治疗方法与手段。为了推进针对lsdv 感染致病的分子机制研究，我们将1
×
108tcid50 lsdv接种含有无血清 dmem6孔板，接种2小时后，更换含有10％fbs的dmem培养基，然后逐日观察htert-csf细胞病变情况。
[0057]
结果如图6所示，发现lsdv感染后的第一天，就有细胞变圆、细胞间隙变宽和细胞皱缩等病理变化，随着感染时间的延长，其特异性的病理变化逐渐加强。表明本发明的中建立的htert-csf细胞系是一种良好的lsdv 感染细胞模型，为研究lsdv感染致病的分子机制提供了良好平台。
[0058]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

技术特征：
1.一株牛皮肤成纤维永生化细胞系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：将离体的胎牛皮肤组织预处理后剪碎，用胰酶消化液消化，经过滤、离心后，收集细胞沉淀，将所述的细胞沉淀用10％fbs的dmem培养基吹散，培养，待细胞贴壁稳定后，更换新鲜培养基，得到原代牛皮肤成纤维细胞；步骤2：克隆htert基因，并构建htert基因慢病毒载体，然后将所述htert基因慢病毒转导所述原代牛皮肤成纤维细胞，经培养、筛选及鉴定，得到牛皮肤成纤维永生化细胞系。2.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，步骤1中，所述胎牛皮肤组织预处理包括以下步骤：在无菌条件下取出胎牛皮肤组织，将新鲜的胎牛皮肤组织样品完全浸泡在75％酒精15-20min，之后使用5
×
三抗生理盐水浸洗3-5次，然后用2
×
三抗pbs溶液再次清洗。3.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，步骤1中，采用质量分数为0.125％胰酶消化液消化。4.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，步骤1中，离心条件为：1000rpm/min，离心5min。5.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，步骤2中，克隆htert基因的引物为：htert for：5＇－atgccgcgcgctccccgctgccgagcc－3＇；htert rev：5＇－gtccaggatggtcttgaagtctgaggg－3＇。6.根据权利要求1所述的建立方法，其特征在于，步骤2包括以下步骤：s1：将克隆得到的htert基因产物连接到表达质粒pcaggs和慢病毒穿梭质粒plv-puro，得到慢病毒包装质粒；s2：将所述的慢病毒包装质粒与辅助质粒混合后，转导细胞包装慢病毒，培养、过滤，取上清液；s3：用所述上清液感染原代牛皮肤成纤维细胞，用含有嘌呤霉素的培养基培养，药物筛选3天后，更换一次新的培养基，继续进行药物筛选，经细胞亚克隆后得到稳定表达htert基因的牛皮肤成纤维永生化细胞系。7.根据权利要求6所述的建立方法，其特征在于，s2中，辅助质粒包括vsv-g和pxpax2，所述慢病毒包装质粒：vsv-g：pxpax2为2:1:2。8.根据权利要求6所述的建立方法，其特征在于，s3中嘌呤霉素的浓度为0.5μg/ml。9.根据权利要求1-8任一项所述的建立方法构建的牛皮肤成纤维永生化细胞系。10.根据权利要求9所述的牛皮肤成纤维永生化细胞系在构建反刍动物疫病细胞模型中的应用。

技术总结
本发明公开了一株牛皮肤成纤维永生化细胞系的建立方法及应用，属于细胞领域。所述建立方法包括：步骤1：将胎牛皮肤组织预处理后剪碎，用胰酶消化液消化，经过滤、离心后，收集细胞沉淀，将所述的细胞沉淀用10％FBS的DMEM培养基吹散，培养，待细胞贴壁稳定后，更换新鲜培养基，得到原代牛皮肤成纤维细胞；步骤2：克隆hTERT基因，并构建hTERT基因慢病毒载体，然后将所述hTERT基因慢病毒转导所述原代牛皮肤成纤维细胞，经培养、筛选、鉴定，得到牛皮肤成纤维永生化细胞系。本发明为牛结节性皮肤病病毒等大型反刍动物疫病提供了重要的基础研究和应用研究试验材料，为相关病毒的分离培养和检测提供了重要的技术平台。测提供了重要的技术平台。测提供了重要的技术平台。


技术研发人员：任善会 孙跃峰 陈豪泰 王相伟 殷相平
受保护的技术使用者：中国农业科学院兰州兽医研究所
技术研发日：2022.02.14
技术公布日：2022/5/25