一种组织培养植物种质安全运输装置和保存方法

1.本发明涉及病毒检测技术领域，具体涉及一种基于真空包装和酶标板的组织培养植物种质安全运输装置和保存方法。


背景技术：

2.植物的组织培养是与细胞全能性理论建立起来的植物无性、离体繁殖技术，是现代生物技术的重要组成部分，被广泛应用于植物的培养和快速繁殖、基础研究、植物种质资源的保存、无毒良种的创制、突变体的筛选、人工种子的制作、作物种质创新、种质交换和基因工程等各个方面。
3.与原位保存和异地保存相比，种质资源的离体保存具有环境更稳定、更节省空间、繁殖效率更高、更方便交换等特点。植物组织培养是植物种质资源离体保存的常用手段，延缓生长是植物种质中期保存中常用的方法。该方法通过调节试管苗生长环境因子或生长培养基配方，以达到减缓植株生长速率，延长继代时间，节省劳动力的目的。培养环境的调控主要包括对温度和光照的调控，而生长培养基配方的调节主要包括渗透剂和植物激素（或生长调节剂）组成和浓度的筛选等。目前，延缓生长已经广泛地应用于濒危植物和农作物种质的中期保存上。由于外植体在延缓生长条件下生活力和生长速率显著低于常规水平，因此理论上可以减少被保存作物的培养空间，而当前由于这些种质被培养在普通组培瓶中，其空间占用率与常规组织培养无异。真空技术已经广泛应用于食物的保鲜，其原理在于降低内包装内氧气的含量，以达到抑制微生物生长的作用。空气是植物生长的要素之一，减少空气含量可有效降低植物的新陈代谢和生命活力。
4.为提高透光率和循环使用次数，外植体通常在玻璃试管或玻璃瓶中培养，这些装置在种质交换时易碎，导致材料污染或资源丢失，另外，由于这类容器内部空间较大，即便在塑料瓶中，在运输颠簸中也容易发生培养物的颠倒、破碎和培养基混合等情况，降低材料的繁殖系数，增加材料的污染风险。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题是针对上述不足提供一种基于真空包装和酶标板的组织培养植物种质安全运输装置和保存方法，同时检测结果的可靠性。
6.为实现上述目的，本发明提供了一种基于真空包装和酶标板的组织培养植物种质安全运输装置和保存方法。
7.一种组织培养植物种质安全运输装置，利用酶标板保存组织培养植物种质，再对酶标板进行真空包装，具体如下：（1）将合适体积的无菌试管苗栽植在含有培养基的酶标板每孔中；（2）酶标板盖上盖装入真空包装袋中；（3）将真空包装袋抽真空密封。
8.优选的，所述酶标板为无菌酶标板。
9.所述真空袋选用家用真空袋，可不灭菌。
10.一种组织培养植物种质安全运输和保存的方法，利用真空和延缓生长培养基在酶标板中保存和运输作物种质资源，操作方法如下：（1）对马铃薯、甘薯和生姜离体器官表面消毒，建立无菌试管苗；（2）在无菌酶标板中加入 300 μl 100 mg/l ccc100 培养基，所述 ccc100培养基为矮壮素（chlormequat chloride，ccc）+ 1/4ms培养基 + 35 g 蔗糖 + 8 g 琼脂，ph = 5.8 培养基；（3）ccc100 凝固后栽植适宜体积的外植体；（4）将盖上盖的酶标板放入家用真空袋中抽真空密封后放入10℃ 中黑暗下保存60 d；（5）取出植物材料定植于普通 ms 培养基上，在普通组织培养环境下培养30 d，测定成活和生长情况;（6）将该装置用快递以陆运的方式寄往其它城市。
11.上述步骤（1）中，建立无菌试管苗的方法如下：切取长度为 1 cm 长，带叶芽的马铃薯茎段、甘薯茎段，以及带芽点的生姜块茎，在流水下冲洗 12 h, 材料转入灭菌的三角瓶中，在超净工作台中向已灭菌且转入材料的三角瓶中加 75% 乙醇摇晃消毒 30 s，灭菌纯水涮洗 10 s, 加入 20% 次氯酸钠溶液表面消毒 15或20 min，灭菌纯水涮洗 10 s，该步骤重复 3 次，外植体在灭菌滤纸上吸干水分，转移至 ms 培养基上于培养温度 24
ꢀ±ꢀ
2℃，光照强度 45μe s
−
1 m
−
2（冷白光荧光灯管），光照周期为 16 h 光照/8 h黑暗环境；每3周继代一次。
12.上述步骤（2）中，利用灭菌的移液枪头，在培养基温度为 60-65℃ 时，在无菌酶标板孔中加入 300 μl 100 mg/l ccc100 培养基，凝固后备用；上述步骤（3）中的外植体采用：切取 5 mm 长的带一个叶片的马铃薯茎段、5 mm 长带一个叶柄，但不带叶片的甘薯茎段、以及 5 mm
2 生姜微型块茎，接种至酶标板孔中的培养基上。
13.上述步骤（4）中的家用真空袋中可不灭菌。
14.上述步骤（5）中的ms培养基为普通ms+35 g蔗糖+8 g琼脂，ph = 5.8培养基。
15.上述步骤（6）中，在无缓冲包装的情况下，将该装置用快递以陆运的方式寄往其它城市，收货后观察培养装置，无漏气、包装损坏和植物样本移位等情况发生。
16.本发明将外植体定植于酶标板中并封存于真空袋中，可显著减少被保存材料占用的空间，同时降低环境空气含量、维持酶标板内湿度以达到进延缓外植体生长和维持外植体生命活力的目的。另外，与常规组织培养容器相比，结合酶标板和真空包装的装置更耐储运和颠簸。
17.本发明的有益效果：（1）显著减少植物延缓生长保存所占用的空间和所需培养基，显著降低种质资源中期保存的人力物力。
18.（2）耐储运和颠簸，可用于个人携带、长途旅行、物流运输等种质交换途径，有效解决组织培养中玻璃培养瓶、试管培养管易碎，培养材料易损坏和污染等问题。
附图说明
19.图1是ms培养基培养前、后的外植体以及培养60d后的植株以及死亡对照。图中a：培养前马铃薯茎段；b：培养后产生愈伤的马铃薯茎段；c：培养后的正常马铃薯茎段；d：培养前的甘薯外植体；e：培养后的甘薯茎段；f：培养前的、带芽点的生姜块茎；g：培养后的生姜植株；h-j：马铃薯、甘薯和生姜死亡对照。实线箭头指愈伤组织；虚线箭头指新生芽点；白色实心箭头指新生根。
20.图2是基于真空和酶标板的植物延缓生长培养体系的操作流程。图中a：向酶标板孔中加入ccc100培养基；b：在孔中定植马铃薯、甘薯和生姜外植体；c：接种后的酶标板培养装置；d：利用家用真空机对酶标板抽真空；e：制作完毕的培养装置；f：外植体在酶标板和真空包装下在10℃黑暗的冷藏柜中保存。比例尺代表2mm。
21.图3是恢复生长30d后再生植株与对照植株形态对比。图中a：对照马铃薯植株；b：恢复生长后马铃薯试管苗；c：对照甘薯植株；d：恢复生长后甘薯试管苗；e：对照生姜植株；f：恢复生长后生姜试管苗。
具体实施方式
22.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
23.实施例1马铃薯、甘薯和生姜试管苗的建立实验操作方法具体如下：（1）切取萌发伸长的马铃薯和甘薯茎段并剪为1cm带一个叶腋的茎段，切取同样长度的带芽点的生姜块茎；（2）茎节段在流动水下冲洗12h，材料转入灭菌的三角瓶中，在超净工作台中向已灭菌且转入材料的三角瓶中加75%乙醇摇晃消毒30s，灭菌纯水涮洗10s；（3）已经配置好的20%次氯酸钠溶液，对外植体消毒15或20min，期间不停摇晃以保证外植体的表面与溶液充分接触；（4）双蒸水冲洗表面消毒后的茎段至少3次，每次10s；（5）吸干残留水分后转入ms培养基。
24.继代培养基为普通的ms培养基，高压灭菌121℃20min。试管植株培养在24
±
2℃下，培养间光照强度为45μes
−1m
−2（冷白光荧光灯管），光照周期设置为16h光照/8h黑暗。每3周为一个继代周期。
25.实施例2筛选适宜的培养条件（1）在无菌酶标板中每孔装载300μlms培养基；（2）待冷却后，取5mm长的带一个叶片的马铃薯茎段、5mm长带一个叶柄，但不带叶片的甘薯茎段、以及5mm2生姜微型块茎，接种至酶标板孔中的培养基上；（3）酶标板盖上盖后放入真空袋中抽真空，分别设置以下处理：
①
于24℃+16h光照中培养60d;
②
于24℃+黑暗中培养60d;
③
于10℃+16h光照中培养60d;
④
于10℃+黑暗中培养60d;
⑤
于4℃+16h光照中培养60d;
⑥
于4℃+黑暗中培养60d。
26.（4）处理完成后统计植株的成活率和新组织再生率（表1），表明于10℃+黑暗中
61/4ms+ccc100mg/l+35g蔗糖+7g琼脂，ph=5.8 aba表示脱落酸（abscisic acid）；b9代表比九（daminozide）；ccc代表多效唑（chlormequat chloride）。
29.（3）在含激素的延缓生长培养基组培瓶中培养 1 cm 马铃薯/甘薯试管苗茎段, 以及 1 cm
2 生姜块茎，培养环境同普通组织培养环境；（4）处理 30 d 后，对组培瓶中植株进行存活率和再生率的统计；（5）结果整理见表3。
30.表3 延缓生长培养处理样本存活率和再生率的统计每个实验重复 3 次，每个重复至少 10 棵外植体。数据利用one way anova在p 《 0.05上分析。
31.（6）将新配置的 300 μl 6 号培养基（即 ccc100）装载入灭菌的酶标板，按前文所述方法接种马铃薯、甘薯和生姜，酶标板真空密封后保存于 10℃ 黑暗中 60 d （步骤见图2）, 成活率和再生率见表4。
32.表4 植株在 ccc100、真空和 10℃ 黑暗条件下培养60 d中的成活率和再生率
植物类型成活率（%）新组织再生率（%）马铃薯100.00
±
0.000.00
±
0.00甘薯100.00
±
0.006.67
±
0.00生姜75.34
±
6.780.00
±
0.00每个实验重复3次，每个重复至少10棵外植体。数据利用onewayanova在p《0.05上分析。
33.实施例4比较再生植株的生长形态差异（1）将真空密封，装载ccc100培养基的酶标板内、黑暗10℃条件下培养60d的外植体取出；（2）样本转移至ms培养基上，在上述常规培养条件下恢复生长30d；（3）成活材料再生率为100%；（4）比较延缓生长培养处理前的植株与再生植株的形态，分析该培养条件对植物形状稳定性的影响。恢复生长的植株表现出较慢的生长势，其中生姜分蘖较多（图3）。实施例5耐运输和颠簸性的检测（1）将真空密封的、带有植物材料的酶标板在无缓冲包装的情况下放入纸箱快递盒；（2）通过汽车陆运的方式分别既往广州市白云区、沈阳市浑南区、北京市昌平区和七台河市桃山区（表5）；（3）快递到货后，检查装置是否完整，真空密封是否漏气，运输过程中并未出现密封袋破损、植物样本脱离、颠倒、破碎或与培养基混合的状态。
34.表5耐运输和颠簸性检测运单详情寄出单号寄出到达地yt6303669102525广东省广州市白云区黄庄南路观赏植物种质资源圃75853845991528辽宁省沈阳市浑南区营城子大街99-1号14门9886429762337北京市北京市昌平区北京农学院科技综合楼9886429709918黑龙江省七台河市桃山区景丰家园

技术特征：
1.一种组织培养植物种质安全运输装置，其特征在于：利用酶标板保存组织培养植物种质，再对酶标板进行真空包装，具体如下：（1）将合适体积的无菌试管苗栽植在含有培养基的酶标板每孔中；（2）酶标板盖上盖装入真空包装袋中；（3）将真空包装袋抽真空密封。2.根据权利要求1所述的组织培养植物种质安全运输装置, 其特征在于：所述酶标板为无菌酶标板。3.根据权利要求1所述的组织培养植物种质安全运输装置, 其特征在于：所述真空袋选用家用真空袋，可不灭菌。4.一种组织培养植物种质安全运输和保存的方法，其特征在于：利用真空和延缓生长培养基在酶标板中保存和运输作物种质资源，操作方法如下：（1）对马铃薯、甘薯和生姜离体器官表面消毒，建立无菌试管苗；（2）在无菌酶标板中加入 300 μl 100 mg/l ccc100 培养基，所述 ccc100培养基为矮壮素（chlormequat chloride，ccc）+ 1/4ms培养基 + 35 g 蔗糖 + 8 g 琼脂，ph = 5.8 培养基；（3）ccc100 凝固后栽植适宜体积的外植体；（4）将盖上盖的酶标板放入家用真空袋中抽真空密封后放入 10℃ 中黑暗下保存60 d；（5）取出植物材料定植于普通 ms 培养基上，在普通组织培养环境下培养30 d，测定成活和生长情况；（6）将该装置用快递以陆运的方式寄往其它城市。5.根据权利要求 4 所述的组织培养植物种质安全运输和保存方法, 其特征在于：步骤（1）中，建立无菌试管苗的方法如下：切取长度为 1 cm 长，带叶芽的马铃薯茎段、甘薯茎段，以及带芽点的生姜块茎，在流水下冲洗 12 h, 材料转入灭菌的三角瓶中，在超净工作台中向已灭菌且转入材料的三角瓶中加 75% 乙醇摇晃消毒 30 s，灭菌纯水涮洗 10 s, 加入 20% 次氯酸钠溶液表面消毒 15或20 min，灭菌纯水涮洗 10 s，该步骤重复 3 次，外植体在灭菌滤纸上吸干水分，转移至 ms 培养基上于培养温度 24
ꢀ±ꢀ
2℃，光照强度 45μe s
−
1 m
−
2，光照周期为 16 h 光照/8 h 黑暗环境；每3周继代一次。6.根据权利要求 4 所述的组织培养植物种质安全运输和保存方法, 其特征在于：步骤（2）中，利用灭菌的移液枪头，在培养基温度为 60-65℃ 时，在无菌酶标板孔中加入 300 μl 100 mg/l ccc100 培养基，凝固后备用。7.根据权利要求 4 所述的组织培养植物种质安全运输和保存方法, 其特征在于：步骤（3）中的外植体采用：切取 5 mm 长的带一个叶片的马铃薯茎段、5 mm 长带一个叶柄，但不带叶片的甘薯茎段、以及 5 mm
2 生姜微型块茎，接种至酶标板孔中的培养基上。8.根据权利要求 4 所述的组织培养植物种质安全运输和保存方法, 其特征在于：步骤（4）中的家用真空袋中不灭菌。9.根据权利要求 4 所述的组织培养植物种质安全运输和保存方法, 其特征在于：步骤（6）中，在无缓冲包装的情况下，将该装置用快递以陆运的方式寄往其它城市。

技术总结
本发明公开了一种组织培养植物种质安全运输装置和保存方法，包括以下步骤：建立马铃薯、甘薯和生姜试管苗；筛选延缓生长培养基；在酶标板中加载培养基并移栽外植体；对酶标板进行真空包装并保存于低温黑暗环境；测定样本再生率；测试该装置耐运输性。本发明建立了基于真空包装和酶标板的组织培养植物种质安全运输装置和保存方法，该方法占用极少空间，马铃薯、甘薯植物材料的成活率均为100%，生姜植物材料的成活率为75.34%，成活材料再生率为100%，再生植株形态与保存前无异，可安全携带和运输。本发明的有益效果在于：显著节省植物种质资源离体保存的人力物力，且该装置耐储运耐颠簸，可显著提高种质交换和运输的安全性。可显著提高种质交换和运输的安全性。


技术研发人员：李经纬 何敏 张万萍 黄廷敏 徐秀红
受保护的技术使用者：贵州大学
技术研发日：2022.03.14
技术公布日：2022/5/25