蓖麻蚕SSR分子标记及其应用

蓖麻蚕ssr分子标记及其应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学和蚕品种鉴别技术领域，具体涉及蓖麻蚕ssr分子标记及其应用，适用于蓖麻蚕的遗传多样性研究、种质鉴定及亲缘关系分析。


背景技术：

2.ssr分子标记标记技术应用至今，凭借其多态性高、标记数量丰富以及低成本已经成为最为普及且成熟的分子标记技术。如今它被广泛应用于生物遗传多样性、遗传图谱构建、遗传分析以及分子标记辅助育种等许多研究领域中。传统的以构建基因组文库建立ssr标记的方法由于费时耗力且效率不高，局限了ssr标记的应用。目前，利用微卫星搜索工具从基因测序得到大量dna序列中查找ssr位点已成为开发微卫星标记最为便捷、有效的方式。
3.蓖麻蚕(philosamia cynthia ricini)又称木薯蚕、印度蚕，是一种具有多化性，在适宜的环境条件下无滞育期的吐丝类经济昆虫。16世纪就已经被印度人驯化饲养，20世纪前后被引进到20多个国家与地区进行饲养繁殖，40年代被引进到我国东北、华东和华南等地。蓖麻蚕是广食性昆虫，除了摄食蓖麻叶外，还可食用木薯、臭椿和马桑等叶片。蓖麻蚕具有发育较快、易饲养、抗病性强、蚕体健壮、背光群集等优点，已经成为我国仅次于家蚕和柞蚕的第三大经济昆虫，亦可作为良好的遗传研究素材。针对蓖麻蚕开展的研究还相对比较少，仅有报道采用issr方法在几个品种中检测遗传多样性的分析，但issr标记存在重复性差等缺点，目前未见有利用蓖麻蚕dna序列开发ssr标记的报道。针对蓖麻蚕开展标记选择，用于品种分子甄别，尤其是在生产优良品种的应用显得尤为迫切需要。


技术实现要素：

4.发明目的：本发明要解决的技术问题是基于蓖麻蚕基因组全序列信息，在基因组水平上筛选ssr分子标记，为种质资源保存和分子标记辅助育种提供技术支撑。本发明首先利用生物信息学方法，检测蓖麻蚕ssr位点，开发出扩增良好、多态性丰富的蓖麻蚕ssr分子标记，建立蓖麻蚕ssr扩增技术体系，并将其应用于蓖麻蚕种质资源的遗传多样性研究及dna指纹图谱构建。
5.技术方案：为解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
6.蓖麻蚕ssr分子标记，所述ssr分子标记的核苷酸序列如seq id no:1～15所示。
7.进一步地，所述ssr分子标记的引物如seq id no:16～45所示。
8.上述蓖麻蚕ssr分子标记在蓖麻蚕的品种鉴定、种质资源多样性分析、核心种质建立和分子标记辅助育种中的应用。
9.上述蓖麻蚕ssr分子标记在应用时的pcr反应体系和pcr反应程序如下：
10.pcr反应总体系25μl：2.5μl的10
×
pcr buffer，2μl的dntp(2.5mmol/l)，各自1μl的上、下游引物(10mmol/l)，0.3μl dna聚合酶，1μl dna模板(500ng/μl)，加入ddh2o定容到反应终体积25μl。
11.pcr扩增在bio rad t100 thermal cycler上进行，反应条件设为95℃预变性3min，95℃变性30s，退火30s(退火温度根据引物的不同而定)，72℃延伸30s；共35个循环，72℃再延伸5min，最后反应终止于12℃。取5μl pcr扩增产物，进行1％琼脂糖凝胶电泳初筛。
12.引物序列、重复基序、片段大小及退火温度详细见表1。
13.表1 ssr分子标记引物序列、退火温度及扩增条带
[0014][0015][0016]
蓖麻蚕基因组共155条scaffolds，总共碱基长度450 479 495bp，最大的scaffold长度为33 970 159bp，平均长度为2 906 319bp，gc含量为34.3％。用misa软件在基因组序列中检索发现存在186 790个ssr位点，gssr位点在基因组中总的发生频率为0.04％，平均每2.4kb出现1个gssr。为了提高gssr标记开发的准确性和通用性，对检索得到的含gssr位点的序列与蓖麻蚕品种b7基因组数据进行了同源比对，筛选到7 036个具有多态性的gssr位点。分段随机挑选28对ssr利用primer premier 6.0软件，对ssr重复基序前后序列进行评估并设计保守引物。引物在生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成，在20份蓖麻蚕种质资源中进行扩增检测。琼脂糖凝胶电泳检测发现，ssr中28对引物有3对引物出现无扩增条带或非特异性条带，其余25对聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,pcr)扩增产物均与目的条带一致，可作为候选标记进行进一步实验，有效扩增率达到89.3％。选取
稳定扩增的特异性引物添加荧光标记，利用全自动毛细管核酸测序仪在20份蓖麻蚕种质资源中进行多态性性检测，最终获得15对扩增效率高、多态性丰富的ssr引物，gssr_p61，gssr_p173，gssr_p3547，gssr_p507，gssr_p3446，gssr_p1556，gssr_p3555，gssr_p3410，gssr_p3729，gssr_p3411，gssr_p3888，gssr_p3840，gssr_p6165，gssr_p3765，gssr_p6101。
[0017]
有益效果：
[0018]
本发明公开的15对ssr引物具有扩增效率高、多态性丰富的优点，有利于种质资源鉴定及基因标记开发等应用。
附图说明
[0019]
图1：6101在b1中的扩增峰图；
[0020]
图2：6101在b13中的扩增峰图；
[0021]
图3：3888在b13中的扩增峰图；
[0022]
图4：3888在b1中的扩增峰图；
[0023]
图5：6165在b1中的扩增峰图；
[0024]
图6：6165在b2中的扩增峰图。
具体实施方式：
[0025]
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
[0026]
为详细说明本发明蓖麻蚕ssr标记的技术内容、构造特征，结合以下实施方式进一步说明。
[0027]
1.蓖麻蚕分子标记的开发方法
[0028]
1.1蓖麻蚕dna序列中ssr位点的筛选
[0029]
使用misa软件搜寻ssr位点，查找标准参数设置为单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸与六核苷酸，最少重复次数分别为10、6、5、5、5与5。通过搜寻，获得含ssr位点的序列。
[0030]
1.2蓖麻蚕ssr引物的设计与合成
[0031]
利用primer premier 6.0软件，对ssr重复基序前后100bp左右序列进行评估并设计引物。ssr位点与侧翼序列的距离大约在50-300bp之间，引物序列的长度在18-27bp之间，gc含量为40％-60％，退火温度50-65℃之间，扩增产物的长度在80-300bp，尽量避免出现二聚体、发夹结构、错配等。引物设计完成后，委托生工生物工程(上海)有限责任公司合成。
[0032]
1.3蓖麻蚕ssr引物的筛选
[0033]
1.3.1普通pcr反应
[0034]
pcr反应总体系25μl：2.5μl的10
×
pcr buffer，2μl的dntp(2.5mmol/l)，各自1μl的上、下游引物(10mmol/l)，0.3μl dna聚合酶，1μl dna模板(500ng/μl)，加入ddh2o定容到反应终体积25μl。pcr扩增在bio rad t100 thermal cycler上进行。反应条件设为95℃预变性3min，95℃变性30s，退火30s(退火温度根据引物的不同而定)，72℃延伸30s；共35个循环，72℃再延伸5min，最后反应终止于12℃。取5μl pcr扩增产物，进行1％琼脂糖凝胶电泳
初筛。
[0035]
1.3.2荧光引物pcr扩增
[0036]
pcr反应总体系为25μl：2.5μl的10
×
taq buffer(with mgcl2)，1μl的dntp(mix,10μm)，各自1μl的上、下游引物(10μm,引物的5'端带有hex或6-fam荧光素)，0.5μl taq酶(5u/μl)，1μl dna模板(20～50ng/μl)，加入ddh2o定容到反应终体积25μl。pcr扩增在美国abi的verititm 96well pcr仪上进行，反应条件设为95℃预变性3min，94℃变性30s，60℃退火30s(退火温度根据引物的不同而定)，72℃延伸30s，先进行10个循环；94℃变性30s，55℃退火30s(退火温度根据引物的不同而定)，72℃延伸30s，再进行35个循环，72℃再延伸5min，最后反应终止于12℃。
[0037]
1.3.3全自动毛细管核算分析仪检测
[0038]
取96孔反应板，使用记号笔标明板名、实验日期，制作电子版短片段重复序列(short tandem repeat,str)检测表，并自动生成上机表。使用连续加样器，吸取990μl hidi和10μl liz500的混合物，加入到96孔反应板中，每孔10μl，将96孔板置于平板离心机中，1 200rmp离心15s。使用12排10μl排枪，对照str检测表，在96孔板对应的孔中加入1μl的样品，将96孔板置于平板离心机中，1 200rmp离心15s。使用封板膜密封96孔板，振荡，将96孔板置于平板离心机中，1 200rmp离心30s，置于pcr仪。变性程序为98℃，5min，不加热热盖，程序结束后立即将96孔板置于冰水混合物上急速冷却。将96孔板置于平板离心机中，1200rmp离心15s，使用美国abi 3730xl设备检测str样本。并且由genemapper v3.7软件自动生成各位点在每个样品上的图谱文件，根据峰值图获取产物片段大小。
[0039]
1.4数据统计与分析
[0040]
使用convert(version 1.31)软件转化数据格式，利用pop-gene(version 1.32)与pic-calc软件软件计算各基因座等位基因数(na)、有效等位基因数(ne)、观测杂合度(ho)、期望杂合度(he)、多态信息含量(pic)、近交系数(fis)以及香农(shannon)信息指数(i)等指标，并检验多态性位点等位基因频率是否偏离哈温平衡(hardy-weinberg equilibrium,hwe)。使用structrue 2.3.4软件对群体的基因型进行贝叶斯聚类分析，检测蓖麻蚕群体潜在的遗传结构。使用powermarker v3.25软件对蓖麻蚕种质进行遗传距离(nei,1983)与聚类分析(1 000次bootstrap method检验)。
[0041]
本发明的15个ssr标记可用于蓖麻蚕种质资源的遗传多样性分析、分子指纹图谱构建等，具有很好的多态性、重复性，是一种可靠有效的分子标记。
[0042]
以上所述仅为本发明体系优化示例，不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利所做的等同变化，仍属于本发明所涵盖的范围。
[0043]
表1. 15个ssr引物多态性条带扩增情况
[0044][0045][0046]
表2微卫星位点的遗传多样性与hardy-welnberg平衡检验
[0047][0048]
①
观察到等位基因数。
[0049]
②
有效等位基因数。
[0050]
③
观测杂合度。
[0051]
④
期望杂合度。
[0052]
⑤
多态信息含量。
[0053]
⑥
近交系数。
[0054]
⑦
香农指数。
[0055]
⑧
hardy-weinberg平衡卡方检验p值，*：p＜0.050，**：p＜0.010。

技术特征：
1.蓖麻蚕ssr分子标记，其特征在于，所述ssr分子标记的核苷酸序列如seq id no:1～15所示。2.根据权利要求1所述的蓖麻蚕ssr分子标记，其特征在于，所述ssr分子标记的引物如seq id no:16～45所示。3.权利要求1或2所述蓖麻蚕ssr分子标记在蓖麻蚕的品种鉴定、种质资源多样性分析、核心种质建立和分子标记辅助育种中的应用。

技术总结
本发明公开了一种蓖麻蚕SSR分子标记及其应用，属于分子生物学和蚕品种鉴别技术领域。本发明通过分析蓖麻蚕基因组序列获得了基因组SSR分子标记位点信息，并设计合成了15对扩增效率高、多态性丰富的SSR引物。以20份蓖麻蚕种质为材料构建了蓖麻蚕SSR指纹图谱。根据本发明建立的方法，利用PCR扩增和电泳检测技术即可完成SSR标记的检测，可用于蓖麻蚕种质资源的鉴定，在DNA水平揭示各品系的遗传变异，亦可进行特异性标记的开发和应用。可进行特异性标记的开发和应用。可进行特异性标记的开发和应用。


技术研发人员：李刚 梁帅 徐安英 钱荷英 刘明珠
受保护的技术使用者：江苏科技大学
技术研发日：2022.02.14
技术公布日：2022/5/25