一种诱导ipsc分化为心肌细胞的方法与流程

1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种诱导ipsc分化为心肌细胞的方法。


背景技术：

2.目前治疗心脏疾病的终末发展阶段—心力衰竭的最后手段仍为移植。然而，因供体资源严重短缺而导致很多患者在等待中死亡。ipsc-cm方法的出现为这一现状带来新希望，其主要长期目标是转变临床上从供体获得心肌组织治疗受损心脏这一现状。
3.胚胎早期心血管系统发育相关的基因调控网络是心肌分化的理论基础。近10年致力于干细胞心肌分化的研究多采用阶段特异性激活或抑制不同的信号通路，通过调控重现上述心肌发育的关键节点实现最终分化的目的。用于心肌分化的干细胞有两种培养方式，一种是形成 eb(embryoid body)球，一种是单层培养的多潜能干细。后者也有铺基质胶培养干细胞和通mef 饲养层培养干细胞两种方法。早期的培养体系以ksr(knockout ser-um replacement)作为基础培养体系，分化过程中添加bmp4，fgf2，activin a等因子促进分化。随后，培养体系更换为 rpmi 1640和b27添加剂，并且简化培养体系将因子调控信号通路转换为小分子调控。培养体系逐渐向无动物源成分且成分明确、简单、高效的方向转变，这主要为临床心肌移植的最终目标打下基础。
4.然而，目前上述诱导ipsc分化为心肌细胞的方法分化时间长，分化效率仍然较低。


技术实现要素：

5.本发明提供的一种诱导ipsc分化为心肌细胞的方法，旨在解决上述背景技术中存在的问题。
6.为了实现上述技术目的，本发明主要采用以下技术方案：
7.一种诱导ipsc分化为心肌细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
8.s1 ipsc细胞培养：将ipsc克隆在包被过matrigel的培养皿中培养，待回合度达70％～80％时，吸走干细胞培养基,然后进行洗涤、传代培养，37℃孵育3～5min；
9.s2诱导ipsc分化为心肌细胞：使用干细胞培养基培养ipsc生长至80％后，使用混合培养基培养，诱导ipsc分化呈中胚层前体细胞，然后再用抑制剂培养基培养，将细胞分化成类似心肌前体细胞，最后再用维持培养基培养，得到心肌细胞；
10.所述混合培养基为含有chir99021和白术内酯ⅱ的基础培养基，所述基础培养基为含b27 添加剂、laa2p的rpmi 1640培养基；
11.所述抑制剂培养基为含有wnt-c59的基础培养基；
12.所述维持培养基为基础培养基。
13.本发明中，所述步骤s1中，经过孵育培养后，还加入新鲜的干细胞培养基，吹打成细胞悬液，按1:4～1:8接种在96孔培养板中培养，放在生物安全柜中，盖上盖子，室温下静置1 小时，使培养板完全、均匀地包被matrigel，然后将细胞置于5％co2的37℃恒温培养箱培养，关闭摇床盖子，控制摇摆速度≤200r/min。
14.本发明中，所述步骤s1中，包被过matrigel的培养皿为采用1：150～250稀释的matrigel 工作液完全覆盖培养皿，并于37℃静置过夜。
15.优选的，所述步骤s1中，采用无钙镁的pbs溶液洗涤。
16.本发明中，所述步骤s1中，使用0.5mmol/l edta传代培养，培养时轻轻摇动培养瓶，使edta铺满所有细胞表面，待细胞层略有松动，肉眼可观察到“薄膜”现象时，倒掉edta，再继续作用2-3分钟，轻轻摇动，细胞层可随残留的edta呈片状从瓶壁上脱落下来，当通过显微镜下发现细胞回缩变圆，细胞间隙增大时，应立即终止消化，然后再加入完全培养基5ml，用吸管反复吹打瓶壁上的细胞，吹打时按顺序进行，以确保所有瓶壁均吹打到，吹打时动作轻柔，不要用力过大，避免出现泡沫和细胞的机械损伤；最后用计数板计数，计算细胞的浓度，并用完全培养基调整适当的细胞浓度后再分瓶培养。
17.作为本发明的进一步改进，所述步骤s2中，混合培养基中，chir99021的浓度为 4.6～5.8μmol/l，白术内酯ⅱ的浓度为5.3～6.3mol/l，所述基础培养基为含有2％的b27添加剂、 64μg/l laa2p的rpmi 1640培养基。
18.优选的，所述抑制剂培养基中，wnt-c59的浓度为1～3μmol/l。
19.进一步的，所述混合培养基的培养时间为48h，所述抑制剂培养基的培养时间为48h，所述维持培养基培养时，需每两天换液直至心肌开始搏动。
20.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明提供的诱导ipsc分化为心肌细胞的方法，通过chir99021和白术内酯ⅱ的作用，可以促进多能诱导干细胞，即ipsc细胞分化至类似中胚层阶段的细胞。再使用wnt-c59抑制wnt信号通路，将细胞分化至类似心肌前体细胞阶段，随后维持培养直至心肌细胞成熟，发育为具有特征性电生理信号的、可跳动的心肌细胞。具有分化时间短(3天即可见分化出跳动的心肌细胞)，分化效率高(7天分化效率高达85％)的优点。
具体实施方式
21.下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
22.实施例1
23.诱导ipsc分化为心肌细胞的方法
24.s1 ipsc细胞培养：采用1:150稀释的matrigel工作液完全覆盖培养皿，并于37℃静置过夜，将ipsc克隆在包被过matrigel的培养皿中培养,待回合度达70％～80％时，吸走干细胞培养基, 然后采用无钙镁的pbs溶液洗涤1-3次、使用0.5mmol/l edta传代培养，培养时轻轻摇动培养瓶，使edta铺满所有细胞表面，待细胞层略有松动，肉眼可观察到“薄膜”现象时，倒掉 edta，再继续作用2-3分钟，轻轻摇动，细胞层可随残留的edta呈片状从瓶壁上脱落下来，当通过显微镜下发现细胞回缩变圆，细胞间隙增大时，应立即终止消化，然后再加入完全培养基5ml，用吸管反复吹打瓶壁上的细胞，吹打时按顺序进行，以确保所有瓶壁均吹打到，吹打时动作轻柔，不要用力过大，避免出现泡沫和细胞的机械损伤；最后用计数板计数，计算细胞的浓度，并用完全培养基调整适当的细胞浓度后再分瓶培养，37℃孵育3～5min；加入新鲜的干细胞培养基，吹打成细胞悬液，按1:4接种在96孔培养板中培养，放
在生物安全柜中，盖上盖子，室温下静置1小时，使培养板完全、均匀地包被matrigel，然后将细胞置于5％co2的37℃恒温培养箱培养，关闭摇床盖子，控制摇摆速度≤200r/min。
25.s2诱导ipsc分化为心肌细胞：使用干细胞培养基培养ipsc生长至80％后，使用混合培养基培养，诱导ipsc分化呈中胚层前体细胞，然后再用抑制剂培养基培养，将细胞分化成类似心肌前体细胞，最后再用维持培养基培养，得到心肌细胞；
26.其中，混合培养基为含有chir99021和白术内酯ⅱ的基础培养基，基础培养基为含b27添加剂、laa2p的rpmi 1640培养基；具体的，混合培养基中，chir99021的浓度为5.8μmol/l，白术内酯ⅱ的浓度为5.3mol/l，基础培养基为含有2％的b27添加剂、64μg/l laa2p的rpmi1640培养基。
27.抑制剂培养基为含有1μmol/l wnt-c59的基础培养基；
28.维持培养基为基础培养基。
29.进一步的，混合培养基的培养时间为48h，抑制剂培养基的培养时间为48h，且维持培养基培养时，需每两天换液直至心肌开始搏动。
30.实施例2
31.诱导ipsc分化为心肌细胞的方法
32.s1 ipsc细胞培养：采用1：200稀释的matrigel工作液完全覆盖培养皿，并于37℃静置过夜，将ipsc克隆在包被过matrigel的培养皿中培养,待回合度达70％～80％时，吸走干细胞培养基,然后采用无钙镁的pbs溶液洗涤1-3次、使用0.5mmol/l edta传代培养,培养时轻轻摇动培养瓶，使edta铺满所有细胞表面，待细胞层略有松动，肉眼可观察到“薄膜”现象时，倒掉edta，再继续作用2-3分钟，轻轻摇动，细胞层可随残留的edta呈片状从瓶壁上脱落下来，当通过显微镜下发现细胞回缩变圆，细胞间隙增大时，应立即终止消化，然后再加入完全培养基5ml，用吸管反复吹打瓶壁上的细胞，吹打时按顺序进行，以确保所有瓶壁均吹打到，吹打时动作轻柔，不要用力过大，避免出现泡沫和细胞的机械损伤；最后用计数板计数，计算细胞的浓度，并用完全培养基调整适当的细胞浓度后再分瓶培养，37℃孵育3～5min；加入新鲜的干细胞培养基，吹打成细胞悬液，按1:6接种在96孔培养板中培养，放在生物安全柜中，盖上盖子，室温下静置1小时，使培养板完全、均匀地包被matrigel，然后将细胞置于 5％co2的37℃恒温培养箱培养，关闭摇床盖子，控制摇摆速度≤200r/min，并将细胞置于 5％co2的37℃恒温培养箱培养。
33.s2诱导ipsc分化为心肌细胞：使用干细胞培养基培养ipsc生长至80％后，使用混合培养基培养，诱导ipsc分化呈中胚层前体细胞，然后再用抑制剂培养基培养，将细胞分化成类似心肌前体细胞，最后再用维持培养基培养，得到心肌细胞；
34.其中，混合培养基为含有chir99021和白术内酯ⅱ的基础培养基，基础培养基为含b27添加剂、laa2p的rpmi 1640培养基；具体的，混合培养基中，chir99021的浓度为5.2μmol/l，白术内酯ⅱ的浓度为5.8mol/l，基础培养基为含有2％的b27添加剂、64μg/l laa2p的rpmi1640培养基。
35.抑制剂培养基为含有2μmol/l wnt-c59的基础培养基；
36.维持培养基为基础培养基。
37.进一步的，混合培养基的培养时间为48h，抑制剂培养基的培养时间为48h，且维持培养基培养时，需每两天换液直至心肌开始搏动。
38.实施例3
39.诱导ipsc分化为心肌细胞的方法
40.s1 ipsc细胞培养：采用1:250稀释的matrigel工作液完全覆盖培养皿，并于37℃静置过夜，将ipsc克隆在包被过matrigel的培养皿中培养,待回合度达70％～80％时,吸走干细胞培养基,然后采用无钙镁的pbs溶液洗涤1-3次、使用0.5mmol/l edta传代培养,培养时轻轻摇动培养瓶，使edta铺满所有细胞表面，待细胞层略有松动，肉眼可观察到“薄膜”现象时，倒掉 edta，再继续作用2-3分钟，轻轻摇动，细胞层可随残留的edta呈片状从瓶壁上脱落下来，当通过显微镜下发现细胞回缩变圆，细胞间隙增大时，应立即终止消化，然后再加入完全培养基5ml，用吸管反复吹打瓶壁上的细胞，吹打时按顺序进行，以确保所有瓶壁均吹打到，吹打时动作轻柔，不要用力过大，避免出现泡沫和细胞的机械损伤；最后用计数板计数，计算细胞的浓度，并用完全培养基调整适当的细胞浓度后再分瓶培养，37℃孵育3～5min；加入新鲜的干细胞培养基，吹打成细胞悬液，按1:8接种在96孔培养板中培养，放在生物安全柜中，盖上盖子，室温下静置1小时，使培养板完全、均匀地包被matrigel，然后将细胞置于5％co2的37℃恒温培养箱培养，关闭摇床盖子，控制摇摆速度≤200r/min，并将细胞置于5％co2的 37℃恒温培养箱培养。
41.s2诱导ipsc分化为心肌细胞：使用干细胞培养基培养ipsc生长至80％后，使用混合培养基培养，诱导ipsc分化呈中胚层前体细胞，然后再用抑制剂培养基培养，将细胞分化成类似心肌前体细胞，最后再用维持培养基培养，得到心肌细胞；
42.其中，混合培养基为含有chir99021和白术内酯ⅱ的基础培养基，基础培养基为含b27添加剂、laa2p的rpmi 1640培养基；混合培养基中，chir99021的浓度为4.6μmol/l，白术内酯ⅱ的浓度为6.3mol/l，基础培养基为含有2％的b27添加剂、64μg/l laa2p的rpmi 1640 培养基。
43.抑制剂培养基为含有3μmol/l wnt-c59的基础培养基；
44.维持培养基为基础培养基。
45.混合培养基的培养时间为48h，抑制剂培养基的培养时间为48h，且维持培养基培养时，需每两天换液直至心肌开始搏动。
46.实施例4
47.诱导ipsc分化为心肌细胞的方法
48.s1 ipsc细胞培养：采用1：200稀释的matrigel工作液完全覆盖培养皿，并于37℃静置过夜，将ipsc克隆在包被过matrigel的培养皿中培养，待回合度达70％～80％时，吸走干细胞培养基，然后采用无钙镁的pbs溶液洗涤1-3次、使用0.5mmol/l edta传代培养,培养时轻轻摇动培养瓶，使edta铺满所有细胞表面，待细胞层略有松动，肉眼可观察到“薄膜”现象时，倒掉edta，再继续作用2-3分钟，轻轻摇动，细胞层可随残留的edta呈片状从瓶壁上脱落下来，当通过显微镜下发现细胞回缩变圆，细胞间隙增大时，应立即终止消化，然后再加入完全培养基5ml，用吸管反复吹打瓶壁上的细胞，吹打时按顺序进行，以确保所有瓶壁均吹打到，吹打时动作轻柔，不要用力过大，避免出现泡沫和细胞的机械损伤；最后用计数板计数，计算细胞的浓度，并用完全培养基调整适当的细胞浓度后再分瓶培养，37℃孵育3～5min；加入新鲜的干细胞培养基，吹打成细胞悬液，按1:8接种在96孔培养板中培养，放在生物安全柜中，盖上盖子，室温下静置1小时，使培养板完全、均匀地包被matrigel，然后将细
胞置于 5％co2的37℃恒温培养箱培养，关闭摇床盖子，控制摇摆速度≤200r/min，并将细胞置于 5％co2的37℃恒温培养箱培养。
49.s2诱导ipsc分化为心肌细胞：使用干细胞培养基培养ipsc生长至80％后，使用混合培养基培养，诱导ipsc分化呈中胚层前体细胞，然后再用抑制剂培养基培养，将细胞分化成类似心肌前体细胞，最后再用维持培养基培养，得到心肌细胞；
50.其中，混合培养基为含有chir99021和白术内酯ⅱ的基础培养基，基础培养基为含b27添加剂、laa2p的rpmi 1640培养基；具体的，混合培养基中，chir99021的浓度为4.3μmol/l，白术内酯ⅱ的浓度为6.8mol/l，基础培养基为含有2％的b27添加剂、64μg/l laa2p的rpmi1640培养基。
51.抑制剂培养基为含有2μmol/l wnt-c59的基础培养基；
52.维持培养基为基础培养基。
53.进一步的，混合培养基的培养时间为48h，抑制剂培养基的培养时间为48h，且维持培养基培养时，需每两天换液直至心肌开始搏动。
54.实施例5
55.诱导ipsc分化为心肌细胞的方法
56.s1 ipsc细胞培养：采用1:200稀释的matrigel工作液完全覆盖培养皿，并于37℃静置过夜，将ipsc克隆在包被过matrigel的培养皿中培养,待回合度达70％～80％时，吸走干细胞培养基，然后采用无钙镁的pbs溶液洗涤1-3次、使用0.5mmol/l edta传代培养,培养时轻轻摇动培养瓶，使edta铺满所有细胞表面，待细胞层略有松动，肉眼可观察到“薄膜”现象时，倒掉 edta，再继续作用2-3分钟，轻轻摇动，细胞层可随残留的edta呈片状从瓶壁上脱落下来，当通过显微镜下发现细胞回缩变圆，细胞间隙增大时，应立即终止消化，然后再加入完全培养基5ml，用吸管反复吹打瓶壁上的细胞，吹打时按顺序进行，以确保所有瓶壁均吹打到，吹打时动作轻柔，不要用力过大，避免出现泡沫和细胞的机械损伤；最后用计数板计数，计算细胞的浓度，并用完全培养基调整适当的细胞浓度后再分瓶培养，37℃孵育3～5min；加入新鲜的干细胞培养基，吹打成细胞悬液，按1:8接种在96孔培养板中培养，放在生物安全柜中，盖上盖子，室温下静置1小时，使培养板完全、均匀地包被matrigel，然后将细胞置于5％co2的37℃恒温培养箱培养，关闭摇床盖子，控制摇摆速度≤200r/min，并将细胞置于5％co2的 37℃恒温培养箱培养。
57.s2诱导ipsc分化为心肌细胞：使用干细胞培养基培养ipsc生长至80％后，使用混合培养基培养，诱导ipsc分化呈中胚层前体细胞，然后再用抑制剂培养基培养，将细胞分化成类似心肌前体细胞，最后再用维持培养基培养，得到心肌细胞；
58.其中，混合培养基为含有chir99021和白术内酯ⅱ的基础培养基，基础培养基为含b27添加剂、laa2p的rpmi 1640培养基；具体的，混合培养基中，chir99021的浓度为6.3μmol/l，白术内酯ⅱ的浓度为4.8mol/l，基础培养基为含有2％的b27添加剂、64μg/l laa2p的rpmi1640培养基。
59.抑制剂培养基为含有2μmol/l wnt-c59的基础培养基；
60.维持培养基为基础培养基。
61.进一步的，混合培养基的培养时间为48h，抑制剂培养基的培养时间为48h，且维持培养基培养时，需每两天换液直至心肌开始搏动。
62.本发明实施例1-5诱导ipsc分化为心肌细胞的时间及分化效率如下表。
[0063][0064]
对于本领域技术人员而言，显而易见的是，在不脱离本发明所附权利要求所披露的范围和精神的前提下，可以进行多种修改和变型，并且这些修改和变型均落入本发明权利要求的保护范围内。

技术特征：
1.一种诱导ipsc分化为心肌细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：s1 ipsc细胞培养：将ipsc克隆在包被过matrigel的培养皿中培养，待回合度达70％～80％时，吸走干细胞培养基，然后进行洗涤、传代培养，37℃孵育3～5min；s2诱导ipsc分化为心肌细胞：使用干细胞培养基培养ipsc生长至80％后，使用混合培养基培养，诱导ipsc分化呈中胚层前体细胞，然后再用抑制剂培养基培养，将细胞分化成类似心肌前体细胞，最后再用维持培养基培养，得到心肌细胞；所述混合培养基为含有chir99021和白术内酯ⅱ的基础培养基，所述基础培养基为含b27添加剂、laa2p的rpmi 1640培养基；所述抑制剂培养基为含有wnt-c59的基础培养基；所述维持培养基为基础培养基。2.根据权利要求1所述的诱导ipsc分化为心肌细胞的方法，其特征在于：所述步骤s1中，经过孵育培养后，还加入新鲜的干细胞培养基，吹打成细胞悬液，按1:4～1:8接种在96孔培养板中培养，放在生物安全柜中，盖上盖子，室温下静置1小时，使培养板完全、均匀地包被matrigel，然后将细胞置于5％co2的37℃恒温培养箱培养，关闭摇床盖子，控制摇摆速度≤200r/min。3.根据权利要求1所述的诱导ipsc分化为心肌细胞的方法，其特征在于：所述步骤s1中，包被过matrigel的培养皿为采用1:150～250稀释的matrigel工作液完全覆盖培养皿，并于37℃静置过夜。4.根据权利要求1所述的诱导ipsc分化为心肌细胞的方法，其特征在于：所述步骤s1中，采用无钙镁的pbs溶液洗涤。5.根据权利要求1所述的诱导ipsc分化为心肌细胞的方法，其特征在于：所述步骤s1中，使用0.5mmol/l edta传代培养，培养时轻轻摇动培养瓶，使edta铺满所有细胞表面，待细胞层略有松动，肉眼可观察到“薄膜”现象时，倒掉edta，再继续作用2-3分钟，轻轻摇动，细胞层可随残留的edta呈片状从瓶壁上脱落下来，当通过显微镜下发现细胞回缩变圆，细胞间隙增大时，应立即终止消化，然后再加入完全培养基5ml，用吸管反复吹打瓶壁上的细胞，吹打时按顺序进行，以确保所有瓶壁均吹打到，吹打时动作轻柔，不要用力过大，避免出现泡沫和细胞的机械损伤；最后用计数板计数，计算细胞的浓度，并用完全培养基调整适当的细胞浓度后再分瓶培养。6.根据权利要求1所述的诱导ipsc分化为心肌细胞的方法，其特征在于：所述步骤s2中，混合培养基中，chir99021的浓度为4.6～5.8μmol/l，白术内酯ⅱ的浓度为5.3～6.3mol/l，所述基础培养基为含有2％的b27添加剂、64μg/l laa2p的rpmi 1640培养基。7.根据权利要求1所述的诱导ipsc分化为心肌细胞的方法，其特征在于：所述抑制剂培养基中，wnt-c59的浓度为1～3μmol/l。8.根据权利要求1所述的诱导ipsc分化为心肌细胞的方法，其特征在于：所述混合培养基的培养时间为48h，所述抑制剂培养基的培养时间为48h，所述维持培养基培养时，需每两天换液直至心肌开始搏动。

技术总结
本发明公开了一种诱导ipsc分化为心肌细胞的方法，涉及生物技术领域。所述方法包括以下步骤：S1ipsc细胞培养；S2诱导ipsc分化为心肌细胞。使用干细胞培养基培养ipsc生长至80％后，使用混合培养基培养，诱导ipsc分化呈中胚层前体细胞，然后再用抑制剂培养基培养，将细胞分化成类似心肌前体细胞，最后再用维持培养基培养，得到心肌细胞，所述混合培养基为含有Chir99021和白术内酯Ⅱ的基础培养基，所述基础培养基为含B27添加剂、LAA2P的RPMI 1640培养基；所述抑制剂培养基为含有Wnt-C59的基础培养基；所述维持培养基为基础培养基。本发明诱导ipsc分化为心肌细胞的方法，具有分化时间短(3天即可见分化出跳动的心肌细胞)，分化效率高(7天分化效率高达85％)的优点。率高(7天分化效率高达85％)的优点。


技术研发人员：胡俊 程亚婷 欧阳佳 李颖 陈志毅 苏雨晴 袁天立 林宝怡
受保护的技术使用者：武汉百翼生物科技有限公司
技术研发日：2022.03.15
技术公布日：2022/5/25