ESRP1启动子报告基因转录活性可视化及在去甲基化抗癌药物筛选中的应用

esrp1启动子报告基因转录活性可视化及在去甲基化抗癌药物筛选中的应用
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种esrp1启动子报告基因转录活性可视化及在去甲基化抗癌药物筛选中的应用。


背景技术：

2.报告基因(reporter gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，其表达产物非常容易被鉴定。把报告基因的编码序列和某基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而可实现利用报告基因的表达产物来标记目的基因表达调控的作用。报告基因技术因其具有高灵敏度、检测方便等特点，被广泛应用于基因启动子转录活性分析及药物筛选等领域。荧光酶基因作为报告基因，具有检测速度快、灵敏度高、费用低及不需使用放射性同位素等优点，得到了广泛的采用。
3.表观遗传学(epigenetics)主要研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下，基因表达的可遗传的变化。近年来表观遗传修饰机制在癌症中的作用越来越受到研究者们的重视，其中dna甲基化被认为是肿瘤形成的重要机制之一。研究表明，肿瘤抑制基因启动子甲基化导致基因失活在肿瘤发生过程中起重要作用，去甲基化药物可通过逆转启动子甲基化状态上调这些基因表达从而起到抑制肿瘤的作用。使用表观遗传药物，如dna甲基化酶抑制剂已成为肿瘤治疗的一种新途径。目前，表观遗传药物治疗在多种肿瘤中已取得明显的效果，许多表观遗传抗癌药物处于临床试验，部分已投入临床使用。在这些抗癌药物的研发过程中，传统的动物实验方法需要肿瘤生长到一定程度后处死动物切除肿瘤，然后通过免疫组化等技术才能获得检测指标。这种具有侵袭性的研究方法，需要处死大量的动物，不能在同一组动物身上重复试验，很难直观、活体、动态地连续观察肿瘤的生长转移情况，限制了对肿瘤尤其是早期肿瘤发生、发展、转移、扩散和治疗效果的研究和评价。因此，建立一种可以在活体小动物实时、反复、非侵袭性地研究抗肿瘤药物模型不仅可以加速药物的研发，快速优化新的治疗方案，降低在研发药物上所用动物的数量，而且还可以对癌症治疗中癌细胞的变化进行实时观测和评估，对于抗肿瘤药物的筛选及其作用机制研究具有重要意义。分子光学成像技术作为一种非侵入性动态成像技术，以其高分辨率、高灵敏度正越来越多的应用于生命科学、医学研究及药物开发等方面，成为近年来动物模型研究最重要的进展，这一技术的完善和发展使非侵袭性研究抗肿瘤药物的分子机制成为可能。到目前为止，国内外科研机构基于该项技术已开发了多个用于筛选抗癌药物的生物发光报告基因，但是针对dna甲基化酶抑制剂类抗癌药物的生物发光报告基因未见报道，这在一定程度上限制了该类药物的研发进程。
4.上皮剪接调节蛋白(epithelial splicing regulatory proteins,esrps)是近年来发现的一种上皮细胞特异性剪接因子，可通过抑制肿瘤细胞增殖及emt的发生，从而发挥抑癌基因的作用。尽管有研究报道，esrp家族在乳腺癌细胞中受zeb1/2转录因子调控，但目前在大多数肿瘤细胞中(包括肾癌细胞)esrp1的表达调控机制仍不清楚。本项研究发现，
esrp1基因低表达于肾癌细胞，其基因启动子区处于高甲基化状态，dna甲基化酶抑制剂可通过下调其启动子甲基化水平上调其表达。因此，若通过分子克隆技术将esrp1基因启动子序列与荧光素酶基因融合，可构建反映esrp1启动子转录活性的生物发光报告基因。该报告基因转染肾癌细胞后，可用于可视化肿瘤细胞内esrp1基因启动子甲基化状态及在体内外条件下监测dna甲基化抑制剂类抗癌药物作用效果，该研究将有助于该类创新药物临床前研究和加快研发进程。报告基因工作原理如图1所示。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于确定肾癌细胞中esrp1基因低表达及其启动子处于高甲基化状态，dna甲基化抑制剂类药物处理可通过下调启动子甲基化水平从而上调esrp1基因表达。
6.本发明的目的还在于针对现有技术的不足，即目前缺乏dna甲基化抑制剂类抗癌药物体内外筛选工具，构建了一种含有esrp1基因启动子序列和报告基因的重组质粒：以含荧光素酶报告基因(luc2)的pgl4.19-luc2质粒为载体，在pgl4.19-luc2质粒的kpn i和xho i的限制性酶切位点之间，插入esrp1基因启动子序列，得到含有esrp1基因启动子序列和报告基因的重组质粒。该重组质粒命名为“pgl4.19-e1p-luc2”，重组质粒的核苷酸序列见seq id no.3。
7.本发明的目的还在于利用该报告基因在肾癌细胞内可视化esrp1基因启动子甲基化状态及在体内外条件下监测dna去甲基化抗癌药物作用效果。
8.具体地，为达到上述目的，本发明的解决方案是：
9.一种esrp1基因启动子，其核苷酸序列为：ctgcgtggcccgatttaagaaaatttttattaggcatgcggatagatgcttttcatttggggcccaaggcaaataaaagaaatgggccccagctctggaggatgttccagcttcgaactagcagccaggaccaaaccagacatagcattcagagttgacagaaaaagaagcgggctccattgtgcctgagtttccttgcggggtcccccagctgctttgcgcgcgataactgcgtcctggggagtgactaggtggttgggcgtccagcccctggcgtccggctctgccgcgcgcggggttcctctccggaaggtgggcagcgcggcgggtttgggacgagcgtgcacccgggctccggcccggagaagggggggctcgcaggatttctcctgctgtttgcactgaaagttgtgttggctcaggagctgcttttccggggatctgcagttgcccccgccacctcctggctgcggttggcaggtccctccctcagcagttcgtcctccgcctgcgccgcgccctgggcagctccgcgccccgggcctcacctctggcctcctttcgcctccctgcacctggccttttcgcttgaccgttcagaaccttcggcttcgttccctgcagccggtattctccgagcccccctgcacctctcagttacctccagtgggaacccctccccccagcgactccgagccctttacctctctgagccctttccccgtctggcctcgtctaccctctgggtgtcaaccgcctcttccctgcccctcacgtctccccctcctcctcccctgccctcgcctctccattcatccagccattgtctcccgccccttcctccccctcccgaagcggcctcctcccccaccgctgccacgtcgtggtttgaaggagccaatgggccggcgccgccaggtgtctcttacctgcaccacgtgggggagggggaaggggcgggcaggtaaagccacatcccaaaacagaaaagctttcagccattgcgtgcctcccggggggggcagccttgctccaggctttttgcatagacgcccgggcaactgaatacaaaaagggcaggcctcctgcgccctccttcccaccccccttcctgccctgggcgtggagcaccgaccaggtgtgggcttgggtggttggttaccgccttttgcactagcagtagcaaggaaggggggtgggcgctctttctttttctcttagaagagggtttagcacaggttttttcgttctcacttccacaccaccttaccgcct(seq id no.1)所示。
10.一种重组质粒，包括上述的esrp1基因启动子和质粒。
11.优选地，质粒为含荧光素酶报告基因的pgl4.19-luc2。
12.优选地，pgl4.19-luc2的核苷酸序列为atggaagatgccaaaaacattaagaagggcccagcgccattctacccactcgaagacgggaccgccggcgagcagctgcacaaagccatgaagcgctacgccctggtgcccggcaccatcgcctttaccgacgcacatatcgaggtggacattacctacgccgagtacttcgagatgagcgttcggctggcagaagctatgaagcgctatgggctgaatacaaaccatcggatcgtggtgtgcagcgagaatagcttgcagttcttcatgcccgtgttgggtgccctgttcatcggtgtggctgtggccccagctaacgacatctacaacgagcgcgagctgctgaacagcatgggcatcagccagcccaccgtcgtattcgtgagcaagaaagggctgcaaaagatcctcaacgtgcaaaagaagctaccgatcatacaaaagatcatcatcatggatagcaagaccgactaccagggcttccaaagcatgtacaccttcgtgacttcccatttgccacccggcttcaacgagtacgacttcgtgcccgagagcttcgaccgggacaaaaccatcgccctgatcatgaacagtagtggcagtaccggattgcccaagggcgtagccctaccgcaccgcaccgcttgtgtccgattcagtcatgcccgcgaccccatcttcggcaaccagatcatccccgacaccgctatcctcagcgtggtgccatttcaccacggcttcggcatgttcaccacgctgggctacttgatctgcggctttcgggtcgtgctcatgtaccgcttcgaggaggagctattcttgcgcagcttgcaagactataagattcaatctgccctgctggtgcccacactatttagcttcttcgctaagagcactctcatcgacaagtacgacctaagcaacttgcacgagatcgccagcggcggggcgccgctcagcaaggaggtaggtgaggccgtggccaaacgcttccacctaccaggcatccgccagggctacggcctgacagaaacaaccagcgccattctgatcacccccgaaggggacgacaagcctggcgcagtaggcaaggtggtgcccttcttcgaggctaaggtggtggacttggacaccggtaagacactgggtgtgaaccagcgcggcgagctgtgcgtccgtggccccatgatcatgagcggctacgttaacaaccccgaggctacaaacgctctcatcgacaaggacggctggctgcacagcggcgacatcgcctactgggacgaggacgagcacttcttcatcgtggaccggctgaagagcctgatcaaatacaagggctaccaggtagccccagccgaactggagagcatcctgctgcaacaccccaacatcttcgacgccggggtcgccggcctgcccgacgacgatgccggcgagctgcccgccgcagtcgtcgtgctggaacacggtaaaaccatgaccgagaaggagatcgtggactatgtggccagccaggttacaaccgccaagaagctgcgcggtggtgttgtgttcgtggacgaggtgcctaaaggactgaccggcaagttggacgcccgcaagatccgcgagattctcattaaggccaagaagggcggcaagatcgccgtga(seq id no.2)所示。
13.优选地，重组质粒为esrp1启动子报告基因，其核苷酸序列为ctgcgtggcccgatttaagaaaatttttattaggcatgcggatagatgcttttcatttggggcccaaggcaaataaaagaaatgggccccagctctggaggatgttccagcttcgaactagcagccaggaccaaaccagacatagcattcagagttgacagaaaaagaagcgggctccattgtgcctgagtttccttgcggggtcccccagctgctttgcgcgcgataactgcgtcctggggagtgactaggtggttgggcgtccagcccctggcgtccggctctgccgcgcgcggggttcctctccggaaggtgggcagcgcggcgggtttgggacgagcgtgcacccgggctccggcccggagaagggggggctcgcaggatttctcctgctgtttgcactgaaagttgtgttggctcaggagctgcttttccggggatctgcagttgcccccgccacctcctggctgcggttggcaggtccctccctcagcagttcgtcctccgcctgcgccgcgccctgggcagctccgcgccccgggcctcacctctggcctcctttcgcctccctgcacctggccttttcgcttgaccgttcagaaccttcggcttcgttccctgcagccggtattctccgagcccccctgcacctctcagttacctccagtgggaacccctccccccagcgactccgagccctttacctctctgagccctttccccgtctggcctcgtctaccctctgggtgtcaaccgcctcttccctgcccctcacgtctccccctcctcctcccctgccctcgcctctccattcatccagccattgtctcccgccccttcctccccctcccgaagcggcctcctcccccaccgctgccacgtcgtggtttgaaggagccaatgggccggcgccgccaggtgtctcttacctgcaccacgtgggggagggggaaggggcgggcaggtaaagccacatcccaaaacagaaaagctttcagccattgcgtgcctcccggggggggcagccttgctccaggctttttgcatagacgcccgggcaactgaatacaaaaagggcaggcctcctgcgccctccttcccaccccccttcctgccctgggcgtggagcaccgaccaggtgtgggcttgggtggttg
gttaccgccttttgcactagcagtagcaaggaaggggggtgggcgctctttctttttctcttagaagagggtttagcacaggttttttcgttctcacttccacaccaccttaccgcctctcgaggatatcaagatctggcctcggcggccaagcttggcaatccggtactgttggtaaagccaccatggaagatgccaaaaacattaagaagggcccagcgccattctacccactcgaagacgggaccgccggcgagcagctgcacaaagccatgaagcgctacgccctggtgcccggcaccatcgcctttaccgacgcacatatcgaggtggacattacctacgccgagtacttcgagatgagcgttcggctggcagaagctatgaagcgctatgggctgaatacaaaccatcggatcgtggtgtgcagcgagaatagcttgcagttcttcatgcccgtgttgggtgccctgttcatcggtgtggctgtggccccagctaacgacatctacaacgagcgcgagctgctgaacagcatgggcatcagccagcccaccgtcgtattcgtgagcaagaaagggctgcaaaagatcctcaacgtgcaaaagaagctaccgatcatacaaaagatcatcatcatggatagcaagaccgactaccagggcttccaaagcatgtacaccttcgtgacttcccatttgccacccggcttcaacgagtacgacttcgtgcccgagagcttcgaccgggacaaaaccatcgccctgatcatgaacagtagtggcagtaccggattgcccaagggcgtagccctaccgcaccgcaccgcttgtgtccgattcagtcatgcccgcgaccccatcttcggcaaccagatcatccccgacaccgctatcctcagcgtggtgccatttcaccacggcttcggcatgttcaccacgctgggctacttgatctgcggctttcgggtcgtgctcatgtaccgcttcgaggaggagctattcttgcgcagcttgcaagactataagattcaatctgccctgctggtgcccacactatttagcttcttcgctaagagcactctcatcgacaagtacgacctaagcaacttgcacgagatcgccagcggcggggcgccgctcagcaaggaggtaggtgaggccgtggccaaacgcttccacctaccaggcatccgccagggctacggcctgacagaaacaaccagcgccattctgatcacccccgaaggggacgacaagcctggcgcagtaggcaaggtggtgcccttcttcgaggctaaggtggtggacttggacaccggtaagacactgggtgtgaaccagcgcggcgagctgtgcgtccgtggccccatgatcatgagcggctacgttaacaaccccgaggctacaaacgctctcatcgacaaggacggctggctgcacagcggcgacatcgcctactgggacgaggacgagcacttcttcatcgtggaccggctgaagagcctgatcaaatacaagggctaccaggtagccccagccgaactggagagcatcctgctgcaacaccccaacatcttcgacgccggggtcgccggcctgcccgacgacgatgccggcgagctgcccgccgcagtcgtcgtgctggaacacggtaaaaccatgaccgagaaggagatcgtggactatgtggccagccaggttacaaccgccaagaagctgcgcggtggtgttgtgttcgtggacgaggtgcctaaaggactgaccggcaagttggacgcccgcaagatccgcgagattctcattaaggccaagaagggcggcaagatcgccgtga(seq id no.3)所示。
14.一种dna甲基化抑制剂在制备降低esrp1基因启动子在肾癌细胞中的甲基化水平中的应用。
15.esrp1基因启动子为上述的esrp1基因启动子。
16.优选地，dna甲基化抑制剂为5-aza-cdr。
17.优选地，检测esrp1基因启动子在肾癌细胞中的甲基化时，esrp1基因启动子的pcr扩增片段的上游引物序列为seq id no.4所示，下游引物序列为seq id no.5所示；
18.内参片段的上游引物序列为seq id no.6所示，下游引物序列为seq id no.7所示。
19.优选地，dna甲基化抑制剂在制备去甲基化抗癌药物筛选中的应用。
20.由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
21.本发明首次证实esrp1启动子在肾癌细胞中处于高甲基化状态，并构建了esrp1启动子报告基因载体。将报告基因载体转染肿瘤细胞并建立稳定转染细胞株后，外源esrp1基因启动子将整合至基因组，并与内源性启动子呈同步甲基化。当去甲基化类药物处理稳定转染细胞株后，因启动子去甲基化从而报告基因表达上调，荧光信号增强、细胞发光强度增
加，因此可用于可视化esrp1基因启动子甲基化状态及在体内外条件下监测dna甲基化抑制剂抗癌药物作用效果。该报告基因最大的优势是可用于在体条件下实时、无创地对抗癌药物疗效进行早期评价，为以dna甲基化为靶点的抗癌药物筛选提供了一个强有力的工具。
附图说明
22.图1为esrp1启动子转录活性可视化报告基因及在去甲基化药物筛选中的应用工作原理示意图。
23.图2为本发明的实施例1中确定肾癌细胞系中低表达esrp1图。
24.图3为本发明的实施例2中确定肾癌细胞中esrp1启动子异常高甲基化图。
25.图4为本发明的实施例3中确定甲基化酶抑制剂可以降低esrp1启动子在肾癌细胞中的甲基化水平图。
26.图5为本发明的实施例4中esrp1启动子生物发光报告基因载体模式图和测序图。
27.图6为本发明的实施例5中建立稳定表达报告基因的肾癌细胞株图。
28.图7为本发明的实施例6中确定esrp1启动子报告基因可以反映dna去甲基化药物的作用效果图。
具体实施方式
29.本发明提供了一种esrp1启动子报告基因转录活性可视化及在去甲基化抗癌药物筛选中的应用。
30.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
31.实施例1：确定esrp1在肾癌细胞中的表达水平
32.1.生信分析esrp1在肾癌组织和细胞中的表达水平
33.利用ualcan数据库进行mrna表达差异分析。结果表明，肾癌组织(kirc)中的esrp1表达水平明显低于癌旁组织，差异具有统计学意义(图2中a)。利用ccle数据库分析esrp1在肾癌细胞中的表达水平。结果表明，以hct116细胞为对照，肾癌细胞中低表达esrp1(图2中b)。
34.2.确定肾癌细胞中esrp1 mrna表达水平
35.实验方法如下：
36.(1)细胞培养
37.a498细胞和hek293细胞(武汉普诺赛)用mem培养基培养，添加10％胎牛血清、1％青链霉素混合液。细胞在37℃，5％co2恒温培养箱中培养。
38.(2)细胞总rna的提取、逆转录
39.细胞总rna的提取按照rna提取试剂盒(北京天漠)说明书进行操作。逆转录按照all-in-one
tm first-strand cdna synthesis kit(genecopoeia)说明书进行操作。
40.(3)qpcr检测
41.本实验使用sybr green i进行检测，采用法进行结果分析，具体程序及步骤如下：
42.反应体系：2μl cdna模板，2μl上下游混合引物(2μm)，2
×
pcr mix 10μl，ddh2o补足至20μl。
43.反应条件为：95℃预变性30s，95℃、5s，63℃、20s，72℃、20s，40个循环。
44.esrp1验证性上下游混合引物(genecopoeia,hsqrp013766)，gapdh验证性上下游混合引物(genecopoeia,hsqrp20026)。
45.实验结果：
46.qpcr检测结果显示，与正常胚肾细胞hek293相比，a498细胞中esrp1 mrna水平表达量明显降低，差异具有统计学意义(图2中c)。
47.实施例2：确定肾癌细胞中esrp1启动子异常高甲基化
48.1.生信分析esrp1在肾癌组织启动子甲基化水平
49.利用ualcan在线数据库进行esrp1启动子甲基化差异分析。结果表明，kirc中的甲基化水平明显高于癌旁组织，差异具有统计学意义(图3中a)。
50.2.bsp克隆测序法检测esrp1在肾癌细胞中的启动子甲基化水平
51.利用在线工具methprimer预测esrp1启动子cpg岛，发现esrp1基因启动子序列内存在三个cpg岛(cpg island)，按前后顺序依次为island 1、iisland 2和island 3(图3中b)。采用bsp克隆测序法对island 1“221bp”片段的甲基化状态进行了检测。
52.实验方法如下：
53.(1)细胞培养：同上。
54.(2)细胞dna提取：细胞rna的提取按照dna提取试剂盒(北京天根)进行。
55.(3)bsp克隆测序：采用bsp克隆测序法(bisulfite sequencing pcr,bsp)检测hek293细胞和a498细胞中esrp1基因启动子cpg岛“221bp”片段中各位点甲基化情况(由上海生工完成该测序实验)。
56.实验结果：
57.bsp克隆测序实验结果表明，肾癌细胞系a498中esrp1基因启动子cpg岛“221bp”片段中的23个cpg位点总体甲基化率高达100％，而hek293细胞则为91％，提示esrp1基因启动子在肾癌细胞中处于高甲基化状态。图3中c为该片段亚硫酸氢盐处理前后序列，上面图为处理前基因启动子片段序列，下面图为处理后的序列。图2中d为bsp克隆法检测结果珠形图，上面图为a498细胞，下面图为hek293细胞。
58.实施例3：dna甲基化抑制剂处理可以降低esrp1启动子在肾癌细胞中的甲基化水平
59.1.采用msre-qpcr方法检测hek293细胞中esrp1基因启动子(甲基化岛“221bp”片段)的甲基化情况。
60.实验方法如下：
61.(1)细胞培养：同上。
62.(2)dna提取：同上。
63.(3)酶切及琼脂糖凝胶电泳
64.使用甲基化敏感的hhaⅰ酶切dna样品，酶切体系：总体系为20μl，包含：3μl dna，2μl 10
×
buffer，1μl hhaⅰ酶，无菌水15μl。轻轻混匀后在37℃环境下酶切，酶切时间分别为0h、1h、8h和12h。对酶切后的各样品进行琼脂糖凝胶电泳。
65.(4)qpcr检测
66.本实验使用sybr green i进行检测，采用法进行结果分析，具体程序及步骤如下：
67.反应体系为20μl，包含：2μl dna模板，2μl上下游混合引物(2μm)，10μl 2
×
pcr mix，dd h2o补足至20μl。
68.反应条件：95℃预变性30s，95℃、5s，63℃、20s，72℃、20s，40个循环。esrp1启动子目的片段序列引物(上海生工)，上游引物：gctccattgtgcctgagtttcc(seq id no.4)，下游引物：cacgctcgtcccaaacccg(seq id no.5)。内参片段序列引物，上游引物：aggcaaataaaaggaaatggg(seq id no.6)，下游引物：gcaaggaaactcaggcacaat(seq id no.7)。
69.实验结果：
70.esrp1基因启动子甲基化岛“221bp”片段甲基化位点分布示意图如图4中a所示，其中包括选择的pcr扩增目的片段及内参片段的位置(引物设计位点)。酶切结果显示，随着酶切时间的延长，dna片段的量逐渐少，表明hhaⅰ酶可发挥限制性内切酶的作用(图4中b)。qpcr检测结果表明，随着酶切时间的延长，hek293细胞基因组中所含扩增目的片段的量逐渐减少，差异具有统计学意义，提示用msre-qpcr法可确定esrp1启动子“221bp”片段中甲基化状态(图4中c)。
71.1.dna甲基化抑制剂处理可以降低esrp1启动子(甲基化岛“221bp”片段)在肾癌细胞中的甲基化水平。
72.实验方法如下：
73.(1)细胞培养：同上。
74.(2)不同浓度的dna甲基化抑制剂5-aza-cdr(0μm、1μm和5μm)处理细胞48h。
75.(3)dna提取：同上。
76.(4)酶切：处理时间24h，方法同上。
77.(5)qpcr检测：检测方法同上。
78.实验结果：
79.qpcr结果显示，a498细胞经5-aza-cdr处理后，esrp1启动子“221bp”片段中目的片段的量明显降低，表明5-aza-cdr处理可降低该目的片段的甲基化水平。实验结果见图4中d所示。
80.实施例4：esrp1启动子生物发光报告基因载体的构建
81.该载体购自南京public protein/plasmid library(ppl)，命名为“pgl4.19-e1p-luc2”。载体模式图及测序结果见图5所示。载体构建成功后进行转化和质粒抽提，用于后续实验分析使用。
82.实验方法如下：
83.(1)转化
84.①
取100μl感受态细胞(广州genecopoeia)。
85.②
加入质粒2μl(3ng/μl)，轻轻摇匀，冰上放置30min。
86.③
42℃水浴中热击90s。
87.④
冰上冷却5min。
88.⑤
将上述菌液涂布于含amp的平板上，正置30min，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16h。
89.⑥
挑选5个的菌落分别放在2ml含amp的lb培养基中过夜震荡培养。
90.(2)质粒抽提
91.质粒抽提按照质粒抽提试剂盒(北京天漠)说明书进行操作。
92.实施例5：建立稳定表达报告基因的细胞株
93.实验方法如下：
94.(1)细胞培养：a498细胞培养同上。
95.(2)细胞转染：
96.①
a498细胞培养于六孔培养板至汇合70％左右。
97.②
24h后，按照转染试剂highgene plus transfection reagent(abclonal)的说明书，取4.0μg pgl4.19-e1p-luc2质粒加入到200μl无血清mem基础培养基离心管中，吹打混匀，然后加入8μl highgene plus转染试剂，吹打混匀。
98.③
48h后，把培养皿中的培养液换为含有g418的常规mem培养液进行筛选。待对照细胞(未转染质粒)全部被杀死后(约两个星期)，将细胞置于药物浓度相对较低的生长环境中培养(800μg/ml)。在上述条件下，细胞能够持续生长，表明稳定转染细胞株已被成功建立，建立的细胞株命名为“a498-e1p-luc2”，用于后续实验使用。
99.④
收集的一部分细胞利用plb裂解液进行裂解后，进行荧光素酶活性分析。
100.⑤
收集另一部分细胞转至96孔板，加入荧光素酶底物d-luciferin(50μg/ml)用于细胞发光成像实验检测细胞发光强度。通过倍比稀释法确定细胞发光强度与细胞数量的相关性。
101.实验结果：
102.荧光素酶活性分析结果表明，稳定转染细胞株a498-e1p-luc2荧光素酶活性明显高于对照细胞a498，提示细胞表达荧光素酶(图6中a)。细胞发光成像实验结果表明，随着细胞数量的增加细胞发光强度逐渐增加，二者呈直线相关(图6中b)。这些结果表明，报告基因整合至细胞基因组，a498细胞可稳定表达报告基因，即稳定转染细胞a498-e1p-luc2构建成功，可用于下一步实验使用。
103.实施例6：确定报告基因可以反映dna甲基化抑制剂类药物的作用效果
104.1.dna甲基化抑制剂处理可以上调a498细胞esrp1 mrna表达水平。
105.实验方法如下：
106.(1)细胞培养：a498细胞培养同上。
107.(2)不同浓度的dna甲基化抑制剂5-aza-cdr(0μm、1μm和5μm)处理细胞48h。
108.(3)细胞总rna的提取、逆转录和qpcr检测同上。
109.实验结果：
110.qpcr检测结果显示，dna甲基化抑制剂5-aza-cdr处理a498细胞48h后，esrp1 mrna水平表达量明显上调，具有剂量依赖性(图7中a)。
111.2.dna甲基化抑制剂处理可以上调a498-e1p-luc2细胞发光强度。
112.①
取六孔板的细胞培养皿，加入一定量的a498-e1p-luc2细胞，37℃培养，至70％左右汇合。
113.②
5-aza-cdr(0μm、1μm和5μm)分别处理a498-e1p-luc2细胞，48h后收集细胞样品。
114.③
收集的一部分细胞利用plb裂解液进行裂解，bca法测定蛋白浓度后进行荧光素酶活性分析。
115.④
另一部分细胞转至96孔板，加入荧光素酶底物d-luciferin(50μg/ml)用于细胞发光成像实验检测细胞发光强度。
116.实验结果：
117.荧光素酶活性分析结果表明，5-aza-cdr处理a498-e1p-luc2细胞后，荧光素酶活性上调，具有剂量依赖性(图7中b)。细胞发光成像实验结果表明，5-aza-cdr处理a498-e1p-luc2细胞后，细胞发光强度增加，具有剂量依赖性(图7中c)。上述实验结果提示报告基因指示的细胞发光强度可反映dna甲基化酶抑制剂类药物作用效果。
118.综上，本发明证明了esrp1低表达于肾癌细胞，esrp1启动子在肾癌细胞中处于高甲基化状态。dna甲基化抑制剂5-aza-cdr处理肾癌细胞后可下调esrp1启动子甲基化状态并上调esrp1分子表达水平。此外，本发明构建了esrp1启动子荧光素酶报告基因载体“pgl4.19-e1p-luc2”，并将该报告基因质粒转染肿瘤细胞后建立稳定转染细胞株，通过检测该发光细胞的发光强度来反映esrp1基因启动子转录活性的变化。dna甲基化抑制剂5-aza-cdr处理稳定转染细胞株后，细胞发光强度增加，呈剂量依赖性。因此，本发明的光学影像报告基因可用于在体内外条件下监测dna甲基化抑制剂类抗癌药物作用效果。
119.对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

技术特征：
1.一种esrp1基因启动子，其特征在于：其核苷酸序列如seq id no.1所示。2.一种重组质粒，其特征在于：包括权利要求1所述的esrp1基因启动子和质粒。3.根据权利要求2所述的重组质粒，其特征在于：所述质粒为含荧光素酶报告基因的pgl4.19-luc2。4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于：所述pgl4.19-luc2的核苷酸序列如seq id no.2所示。5.根据权利要求2所述的重组质粒，其特征在于：所述重组质粒为esrp1启动子报告基因，其核苷酸序列如seq id no.3所示。6.一种dna甲基化抑制剂在制备降低esrp1基因启动子在肾癌细胞中的甲基化水平中的应用；所述esrp1基因启动子为权利要求1所述的esrp1基因启动子。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述dna甲基化抑制剂为5-aza-cdr。8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：检测esrp1基因启动子在肾癌细胞中的甲基化时，esrp1基因启动子的pcr扩增片段的上游引物序列为seq id no.4所示，下游引物序列为seq id no.5所示；内参片段的上游引物序列为seq id no.6所示，下游引物序列为seq id no.7所示。9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述dna甲基化抑制剂在制备去甲基化抗癌药物筛选中的应用。

技术总结
本发明提供了一种ESRP1启动子报告基因转录活性可视化及在去甲基化抗癌药物筛选中的应用，本发明构建了ESRP1启动子报告基因载体如SEQ ID NO.3所示，将报告基因转染肿瘤细胞并建立稳定转染细胞株后，外源ESRP1基因启动子将整合至基因组，并与内源性启动子呈同步甲基化。当去甲基化类药物处理稳定转染细胞株后，因启动子去甲基化从而引起报告基因表达上调，荧光信号增强、细胞发光强度增加，因此可用于在体内外条件下监测DNA甲基化抑制剂抗癌药物作用效果。该报告基因可用于在活体小动物肿瘤模型中实时、无创地对抗癌药物疗效进行早期评价，为以DNA甲基化为靶点的抗癌药物筛选提供了一个强有力的工具。供了一个强有力的工具。供了一个强有力的工具。


技术研发人员：陈志鸿 陈伶俐 林乐成 静雅杰 李晓蕾
受保护的技术使用者：右江民族医学院
技术研发日：2022.03.14
技术公布日：2022/5/25