一种全反式维甲酸-芳基金属配合物、制备方法及应用

1.本发明属于生物化学技术领域，涉及一类全反式维甲酸-芳基金属配合物，还 涉及所述金属配合物的制备方法和应用。


背景技术：

2.白血病也被称作血癌，是造血系统的一种恶性肿瘤，其治疗手段主要有化疗、 放疗和骨髓移植，治疗过程中具有极强的毒副作用。到目前为止，用于治疗癌症 的药物(天然或合成)已有十几种，目前新型钌、铱等金属抗癌药物逐渐走入人 们的视野，其中，具有半三明治构型的有机金属配合物更是因其结构的多样性、 芳烃的易控性以及环戊二烯基的疏水性，而在化学治疗研究中，常用的单纯芳基 金属配合物作为抗癌药物或者抗癌药物组分时，存在的毒副作用大、代谢难的问 题，且对正常细胞也具有毒性，达不到在治疗癌细胞的同时，对正常细胞无毒害 的作用。


技术实现要素：

3.发明目的：本发明针对现有技术中存在的常用芳基金属配合物作为抗癌药物 或者抗癌药物组分时毒副作用大、代谢难的问题，提供一种不仅对癌细胞有良好 的治疗活性，而且对正常细胞无毒副作用的全反式维甲酸-芳基金属配合物；还提 供了上述配合物的制备方法。
4.技术方案：本发明所述的全反式维甲酸-芳基金属配合物，其结构通式如下：
[0005][0006]
其中，m为ru或ir；r为伞花烃或五甲基环戊二烯；
[0007]
l为为
[0008]
本发明所述配合物的制备方法，包括以下步骤：
[0009]
(1)制备金属配合物前体：在惰性气体氛围下，将钌的二聚体和铱的二聚体 溶解在有机溶剂中，与螯合配体进行配位反应后，将反应液减压旋蒸除去，加入 饱和阴离子盐
的有机溶液，重结晶得到金属配合物前体；
[0010]
(2)制备有机活性分子配体：在惰性气体氛围下，将有机活性分子与炔基化 合物置于有机溶剂中反应，反应结束后，旋蒸除去溶剂，得到粗产物经过色谱柱 分离纯化后，得到有机活性分子配体。
[0011]
(3)将步骤(1)得到的金属配合物前体、步骤(2)得到的有机活性分子配 体和催化剂加入有机溶剂中，反应结束后，旋蒸除去溶剂，粗产物经色谱柱纯化， 得到所述全反式维甲酸-芳基金属配合物。
[0012]
优选的，步骤(1)中，所述钌的二聚体为对伞花烃二氯化钌(ⅱ)二聚体， 铱的二聚体为二氯(五甲基环戊二烯基)合铱(ⅲ)二聚体，所述有机溶剂为甲 醇溶液；钌的二聚体与螯合配体的摩尔比例是1:1～1:2；铱的二聚体与螯合配体 的摩尔比例是1:1～1:2。
[0013]
优选的，所述螯合配体为4-叠氮甲基-4'-甲基-2,2'-联吡啶，4-叠氮甲基-4'-甲 基-2,2'-联吡啶的制备方法为：
[0014]
步骤(1.1)，取4,4'-二甲基-2,2'-联吡啶和1,4-二氧六环中配置悬浮液，再加 入seo2加热回流，过滤得滤液，滤液减压除去溶剂得固体物质；将固体物质溶解 在氯仿中，过滤处理得粗产物a；将硼氢化钠溶解于氢氧化钠溶液中，滴加至粗 产物a的甲醇悬浮液中，冷却搅拌后减压除去甲醇，再加入饱和na2co3溶液稀 释，萃取干燥有机相，再蒸发溶剂，通过色谱柱法纯化以得到4-羟甲基-4'-甲基-2,2'
‑ꢀ
联吡啶；
[0015]
步骤(1.2)，将4-羟甲基-4'-甲基-2,2'-联吡啶溶解在hbr中，再加入浓硫酸， 加热回流，冷却后调节ph值，用氯仿萃取直至有机层无色，取有机层干燥除去 氯仿，得到4-溴甲基-4'-甲基-2,2'-联吡啶；
[0016]
步骤(1.3)，将4-溴甲基-4'-甲基-2,2'-联吡啶和nan3溶解在二甲基甲酰胺的 水溶液中，搅拌，除去溶剂后得粗产物b，取粗产物b用ch2cl2萃取，萃取得到 的有机层用水洗涤，干燥后除去溶剂得到4-叠氮甲基-4'-甲基-2,2'-联吡啶。
[0017]
优选的，步骤(2)中，炔基化合物为炔丙胺或溴丙炔，有机溶剂为n,n-二 甲基甲酰胺溶液，有机活性分子与炔基化合物的摩尔比为1:1～1:3。
[0018]
优选的，步骤(3)中，催化剂为五水硫酸铜和抗坏血酸钠，金属前体与有机 活性分子配体的反应摩尔比为1:1～1:3。
[0019]
优选的，步骤(1)中，反应时间为0～48h，步骤(2)中，反应时间为0～ 24h，步骤(3)中，反应时间为6～9h。
[0020]
本发明所述配合物在细胞内的合成方法，将金属配合物前体加入到肿瘤细胞 培养皿中在细胞培养箱中孵育20～30h，再加入有机活性分子前体继续共孵育 20～30h，然后用pbs洗涤，洗涤后将细胞消化离心收集；最后用细胞破碎仪将细 胞打成碎片，并通过滤膜过滤，再进行电喷雾质谱测定，得到细胞内反应的产物。
[0021]
本发明所述的全反式维甲酸-芳基金属配合物在用于制备抗癌药物和抗癌药 物组分方面的应用。
[0022]
癌细胞中的铜浓度显著高于正常细胞，这使得铜离子成为治疗癌症的有效靶 点。因此，利用肿瘤细胞中较高的铜物种水平，通过cuaac(炔环加成反应) 原位生成癌症特异性药物，将有助于实现对肿瘤细胞的靶向治疗，避免对正常细 胞的毒性。本发明的芳基金属配合物就是以具有抗白血病活性的分子作为炔端， 芳基金属作为叠氮端，两者作为底
物，在内源性铜物种的催化作用下通过cuaac 反应生成。这类配合物对白血病具有一定的靶向性，可实现对白血病细胞的靶向 性治疗。本发明采用是生物正交反应，以将维甲酸与芳基配合物结合；为了提高 对白血病细胞的靶向性，选择了对白血病有治疗活性的维甲酸分子，再结合芳基 金属配合物，由特定的官能团相结合(叠氮-炔)得到。本发明中的配合物不仅可 以通过化学合成的方式制备合成，也可以在细胞内合成此配合物。
[0023]
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：
[0024]
(1)本发明将有抗白血病活性的有机分子配体和钌、铱芳基金前体经过点击 反应得到的抗癌金属配合物，配合物除了具有相应活性分子的特性外，还具有芳 基金属溶解性好、耐药性低、细胞摄取量高及易代谢的特性；本发明芳基金属配 合物无论是在细胞外经过化学合成还是在细胞内经过生物正交合成均表现出良好 的抗白血病的效果，同时本发明金属配合物对正常组织或细胞均无毒性，从而实 现对白血病细胞的靶向性治疗；
[0025]
(2)本发明提供上述配合物的合成方法，由于本发明是将具有抗白血病活性 的维甲酸小分子通过点击反应与芳基钌、铱金属前体结合而成的配合物，作用位 点唯一，因此该方法产率高，可达85％，克服了现有化合物合成方法存在的反应 产率低、溶解性差的问题。
附图说明
[0026]
图1为化学合成的全反式维甲酸芳基钌金属配合物ret-ru-chem在细胞中的 细胞定位图；
[0027]
图2为化学合成的配合物ret-ru-chem以及配体与前体1:1在细胞内自催发 得到的配合物ret-ru-cell诱导细胞凋亡的图；
[0028]
图3为化学合成的配合物ret-ru-chem以及配体与前体1:1在细胞内自催发 得到的配合物ret-ru-cell对细胞周期阻滞影响的图；
[0029]
图4为化学合成的配合物ret-ru-chem以及配体与前体1:1在细胞内自催发 得到的配合物ret-ru-cell促进细胞内活性氧生成的共聚焦荧光成像的图；
[0030]
图5为化学合成的配合物ret-ru-chem以及配体与前体1:1在细胞内自催发 得到的配合物ret-ru-cell诱导线粒体膜电位下降的流式细胞图；
[0031]
图6为化学合成的配合物ret-ru-chem以及配体与前体1:1在细胞内自催发 得到的配合物ret-ru-cell检测线粒体膜电位下降的激光共聚焦图；
[0032]
图7为化学合成的配合物ret-ru-chem以及配体与前体1:1在细胞内自催发 得到的配合物ret-ru-cell诱导细胞产生自噬小体的共聚焦荧光成像图。
[0033]
具体实施方式
[0034]
下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
[0035]
实施例1
[0036][0037]
本发明金属配合物ret-ru的制备方法，包括以下步骤：
[0038]
步骤1，在氩气氛围下，将维甲酸与n-羟基苯并三唑和n,n-二异丙基乙胺溶 解在dmf中，一定温度下反应5min，将一定量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基 碳二亚胺盐酸盐溶解于dmf中并滴加到反应混合物中。混合物在0℃下反应一 段时间后，向混合溶液中滴加炔丙胺。使反应混合物升温至室温过夜。搅拌过夜 后，除去有机溶剂，将所得残余物溶于乙酸乙酯，依次用5％nahco3(3
×
20ml) 和0.5mol/l hcl(3
×
20ml)洗涤。留盐酸水相，通过添加na2co3将水相溶液 的ph值调节至8.0左右，并用二氯甲烷(3
×
20ml)萃取，以62.5％的产率产生 呈灰白色固体，命名为ret-alkyne。1h nmr(400mhz,chloroform-d)δ7.00(s,1h), 6.31
–
6.22(m,2h),6.17(s,1h),6.13(d,j＝3.2hz,1h),5.66(d,j＝8.2hz,2h), 4.16
–
4.11(m,2h),2.39(s,3h),2.28
–
2.24(m,1h),2.05(d,j＝7.2hz,2h),2.01(s, 3h),1.73(s,3h),1.63(d,j＝6.1hz,2h),1.51
–
1.46(m,2h),1.05(s,6h)。
[0039]
步骤2：4-叠氮甲基-4'-甲基-2,2'-联吡啶，采用如下方法制备而成：步骤(2.1)： 向4,4'-二甲基-2,2'-联吡啶(8.0g，43mmol)在1,4-二氧六环(150ml)中的搅 拌悬浮液中加入seo2(8.0g,71mmol)。将混合物加热回流48小时。冷却至室 温后，过滤混合物，取滤液，减压除去溶剂。将所得黄色固体溶解在氯仿中，过 滤悬浮液以除去硒副产物。在三个连续的溶解和过滤处理之后，获得粗产物(8.0 g)。将所得固体悬浮在甲醇(50ml)中，并将硼氢化钠(2.8g)溶解naoh(0.2 m，20ml)中再滴加到混合物中，在冰上冷却搅拌。将混合物在室温下再搅拌 一小时，然后减压除去甲醇。剩余的水悬浮液用饱和na2co3溶液稀释并用氯仿 萃取。干燥有机相并蒸发溶剂。通过色谱柱法(三乙胺/二氯甲烷＝1/20)纯化粗 产物以得到呈白色固体状的4-羟甲基-4'-甲基-2,2'-联吡啶(3.9g，45％)。1h nmr (400mhz,cdcl3)δ＝8.62(d,j＝5.0hz,1h),8.52(d,j＝4.9hz,1h),8.34(s,1h,), 8.22(s,1h),7.32(d,j＝4.9hz,1h),7.14(d,j＝4.3hz,1h),4.80(s,2h),2.44(s, 3h)。
[0040]
步骤(2.2)：将4-羟甲基-4'-甲基-2,2'-联吡啶(2.0g，10.0mmol)溶解在 hbr(48％，40ml)中，并将浓h2so4(10ml)加入溶液中。将红色溶液加热回 流过夜，冷却至室温后，将混合物倒入100ml冰水中，用na2co3将水层ph值 调至8.0左右，并用氯仿萃取直至有机层无色，合并的有机层用mgso4干燥，真 空旋蒸除去氯仿，得到4-溴甲基-4'-甲基-2,2'-联吡啶(2.4g，93％)。1h nmr(400 mhz,cdcl3)δ＝8.66(d,j＝5.0hz,1h),8.56(d,j＝5.0hz,1h),8.45(s,1h),8.26 (s,1h),7.35(d,j＝5.0hz,1h),7.18(d,j＝4.9hz,1h),4.49(s,2h),2.46(s,3h)。
[0041]
步骤(2.3)：将4-溴甲基-4'-甲基-2,2'-联吡啶(2.4g，9.1mmol)和nan3(3.0 g，45.5mmol)溶解在二甲基甲酰胺(dmf)和h2o(55ml，10/1,v/v)，70℃ 搅拌过夜。真空除去溶剂后，粗产物用ch2cl2萃取，有机层用水洗涤，无水mgso4干燥。通过除去溶剂得到4-叠氮甲基-4'-甲基-2,2'-联吡啶，为白色固体(1.7g， 87.0％)。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ＝8.68(d,j＝5.0hz,1h),8.54(d,j＝4.9hz, 1h),8.35(s,1h),8.25(s,1h),7.32
–
7.26(m,1h),7.15
(d,j＝4.8hz,1h),4.48(s, 2h),2.44(s,3h)。
[0042]
步骤(2.4)：在常温下，将步骤(3)中的产物(4-叠氮甲基-4'-甲基-2,2'-联 吡啶)与对伞花烃二氯化钌(ⅱ)二聚体以2:1的当量比在甲醇溶液中反应48h， 旋蒸出去溶剂，加入饱和的(nh4)pf6的甲醇溶液。色谱柱纯化，得到纯品。产率 65％，命名为ru-n3。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ9.53
–
9.49(m,1h),9.37(d,j ＝5.8hz,1h),8.59(d,j＝1.9hz,2h),7.74(dd,j＝5.9,1.8hz,1h),7.66(dd,j＝6.0, 1.8hz,1h),6.23
–
6.19(m,2h),5.98
–
5.94(m,2h),4.88(s,2h),2.59(s,3h),2.56 (d,j＝6.9hz,1h),2.18(s,3h),0.94(dd,j＝6.9,2.0hz,6h)。
[0043]
步骤3，在氩气氛围下，将上述制备的0.05mmol ret-alkyne、0.15mmol ru-n3、 0.01mmol的五水硫酸铜和0.02mmol的抗坏血酸钠溶解在dmf中搅拌9h，反 应结束后，旋蒸除去溶剂，柱层析分离得到橙黄色产物，产率83.3％。1h nmr(400 mhz,cdcl3)δ9.22(s,1h),9.09(s,1h),8.17(s,1h),8.11(s,1h),7.88(s,1h),7.44 (s,1h),6.91(t,j＝13.3hz,1h),6.25(d,j＝17.5hz,2h),6.13(d,j＝15.9hz,2h), 5.84(s,3h),5.67(s,3h),4.59(s,2h),2.64(s,1h),2.53(s,3h),2.34(s,2h),2.17(s, 3h),2.03(s,2h),1.98(s,3h),1.80(s,3h),1.72(s,3h),1.62(s,2h),1.49(s,2h), 1.27(s,1h),1.02(d,j＝6.1hz,12h)。esi-ms[ret-ru]

：理论值：833.53，实验值： 833.41。
[0044]
实施例2
[0045][0046]
本发明金属配合物ret-ir的制备方法，包括以下步骤：
[0047]
步骤1，在氩气氛围下，将二氯(五甲基环戊二烯基)合铱(ⅲ)二聚体和 4-叠氮甲基-4'-甲基-2,2'-联吡啶(实施例1)溶解在甲醇溶液中，常温下反应48h， 旋蒸除去溶剂，加入10倍当量饱和的六氟磷酸胺甲醇溶液，柱层析分离，得到嫩 黄色粉末状产物，产率86％，命名为ir-n3。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.95(d, j＝5.9hz,1h),8.82(d,j＝5.8hz,1h),8.73(d,j＝5.6hz,2h),7.79(d,j＝5.8hz, 1h),7.71(s,1h),4.95(s,2h),2.64(s,3h),1.65(s,15h)。
[0048]
步骤2，在氩气氛围下，将上述制备的0.05mmol ret-alkyne、0.15mmol ir-n3、 0.01mmol的五水硫酸铜和0.02mmol的抗坏血酸钠溶解在dmf中搅拌9h，反 应结束后，旋蒸除去溶剂，柱层析分离得到黄色产物，产率85％。1h nmr(400mhz, dmso-d6)δ8.94(d,j＝5.9hz,1h),8.84
–
8.77(m,1h),8.72(d,j＝4.6hz,1h), 8.66(d,j＝5.8hz,1h),8.59(d,j＝7.1hz,1h),8.52(s,1h),8.21(d,j＝2.2hz,1h), 7.74
–
7.61(m,1h),7.50
–
7.40(m,1h),6.90(d,j＝12.1hz,1h),6.28
–
6.16(m, 4h),5.92(s,2h),5.85(s,1h),4.39(s,2h),2.63(d,j＝2.6hz,3h),2.29(s,3h),1.99 (d,j＝5.7hz,2h),1.95(d,j＝1.6hz,3h),1.69
–
1.63(m,15h),1.56(s,2h),1.45
–ꢀ
1.42(m,2h),1.24(d,j＝5.6hz,3h),1.01(s,6h)。esi-ms[ret-ir]

：理论值：925.60， 实验值：925.40。
0.01mmol的五水硫酸铜和0.02mmol的抗坏血酸钠溶解在dmf中搅拌9h，反 应结束后，旋蒸除去溶剂，柱层析分离得到黄色产物，产率67％。命名为lin-ru。 δ9.53
–
9.49(m,1h),9.37(d,j＝5.8hz,1h),8.59(d,j＝1.9hz,2h),7.74(dd,j＝ 5.9,1.8hz,1h),7.66(dd,j＝6.0,1.8hz,1h),6.23
–
6.19(m,2h),5.98
–
5.94(m, 2h),5.89(m,1h),5.29(d,j＝4.6hz,1h),5.28(d,j＝4.6hz,1h),5.20(m,1h), 4.88(s,2h),4.77(s,1h),2.59(s,3h),2.56(d,j＝6.9hz,1h),2.18(s,3h),1.94(s,j ＝5.8hz,2h),1.82(s,3h),1.70(s,3h),1.46(m,2h),1.05(s,3h)0.94(dd,j＝6.9, 2.0hz,6h)。esi-ms[lin-ru]

：理论值：688.24，实验值：688.33。
[0059]
实施例5
[0060][0061]
本发明金属配合物pte-ru的制备方法，包括以下步骤：
[0062]
步骤1，在氩气氛围下，将1mmol 4-氨基-2-芳基-6,9-二氯苯佐蝶啶，1mmol 溴丙炔和2mmol的碳酸钾溶解在dmf中，80℃反应10-16h，反应结束后，将 反应液用等体积的乙酸乙酯和水的溶剂稀释，分离有机层，并用乙酸乙酯萃取水 相，合并有机层，并用无水硫酸钠干燥，除去溶剂，柱层析分析得到纯净物，产 率为84％。命名为pte-alkyne。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ8.18(d,j＝5.9hz, 1h),7.78(d,j＝5.8hz,1h),7.49(d,j＝4.6hz,1h),7.18(d,j＝5.8hz,1h),7.05 (d,j＝7.1hz,1h),7.05(d,j＝6.9hz,1h),6.96(s,j＝2.2hz,2h),2.46(s,3h)。
[0063]
步骤2，在氩气氛围下，将上述制备的0.05mmol pte-alkyne、0.15mmol ru-n3、 0.01mmol的五水硫酸铜和0.02mmol的抗坏血酸钠溶解在dmf中搅拌9h，反 应结束后，旋蒸除去溶剂，柱层析分离得到黄色产物，产率79.3％。命名为pte-ru。 1
h nmr(400mhz,dmso-d6)δ9.53
–
9.49(m,1h),9.37(d,j＝5.8hz,1h),8.59 (d,j＝1.9hz,2h),8.18(d,j＝5.9hz,1h),7.78(d,j＝5.8hz,1h),7.74(dd,j＝5.9, 1.8hz,1h),7.66(dd,j＝6.0,1.8hz,1h),7.49(d,j＝4.6hz,1h),7.18(d,j＝5.8 hz,1h),7.05(d,j＝7.1hz,1h),7.05(d,j＝6.9hz,1h),6.96(s,j＝2.2hz,2h), 6.23
–
6.19(m,2h),5.98
–
5.94(m,2h),4.88(s,2h),2.59(s,3h),2.56(d,j＝6.9hz, 1h),2.46(s,3h),2.18(s,3h),0.94(dd,j＝6.9,2.0hz,6h)。esi-ms[pte-ru]

：理 论值：889.16，实验值：889.29。
[0064]
实施例6
[0065]
[0066]
本发明金属配合物rtc-ru的制备方法，包括以下步骤：
[0067]
步骤1，在氩气氛围下，将1mmol ptc
596
，1mmol溴丙炔和2mmol的碳酸 钾溶解在dmf中，80℃反应10-16h，反应结束后，将反应液用等体积的乙酸乙 酯和水的溶剂稀释，分离有机层，并用乙酸乙酯萃取水相，合并有机层，并用无 水硫酸钠干燥，除去溶剂，柱层析分析得到纯净物，产率为46.7％。命名为 ptc-alkyne。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ11.13(d,j＝5.9hz,1h),8.82(d,j＝ 2.2hz,1h),7.43(d,j＝4.6hz,1h),7.43(d,j＝5.8hz,1h),7.31(d,j＝7.1hz,1h), 7.31(s,1h),7.18(d,j＝2.2hz,1h),6.67(d,j＝2.2hz,1h),6.61(dd,j＝5.8hz, 1h),5.95(d,j＝12.1hz,1h),3.86(m,1h)3.80(m,2h),3.08(m,1h),1.04(m, 3h)。
[0068]
步骤2，在氩气氛围下，将上述制备的0.05mmol ptc-alkyne、0.15mmolru-n3、0.01mmol的五水硫酸铜和0.02mmol的抗坏血酸钠溶解在dmf中搅拌9 h，反应结束后，旋蒸除去溶剂，柱层析分离得到黄色产物，产率51.7％。命名为 ptc-ru。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ11.13(d,j＝5.9hz,1h),9.53
–
9.49(m, 1h),9.37(d,j＝5.8hz,1h),8.82(d,j＝2.2hz,1h),8.59(d,j＝1.9hz,2h),7.74 (dd,j＝5.9,1.8hz,1h),7.66(dd,j＝6.0,1.8hz,1h),7.43(d,j＝4.6hz,1h),7.43 (d,j＝5.8hz,1h),7.31(d,j＝7.1hz,1h),7.31(s,1h),7.18(d,j＝2.2hz,1h), 6.67(d,j＝2.2hz,1h),6.61(dd,j＝5.8hz,1h),6.23
–
6.19(m,2h),5.98
–
5.94(m, 2h),5.95(d,j＝12.1hz,1h),4.88(s,2h),3.86(m,1h)3.80(m,2h),3.08(m,1h), 2.59(s,3h),2.56(d,j＝6.9hz,1h),2.18(s,3h),1.04(m,3h)0.94(dd,j＝6.9,2.0 hz,6h),。esi-ms[ptc-ru]

：理论值：956.25，实验值：956.44。
[0069]
实施例7
[0070][0071]
本发明金属配合物urs-ru的制备方法，包括以下步骤：
[0072]
步骤1，在氩气氛围下，将熊果酸与n-羟基苯并三唑和n,n-二异丙基乙胺溶 解在dmf中，一定温度下反应5min，将一定量的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基 碳二亚胺盐酸盐溶解于dmf中并滴加到反应混合物中。混合物在0℃下反应一 段时间后，向混合溶液中滴加炔丙胺。使反应混合物升温至室温过夜。搅拌过夜 后，除去有机溶剂，将所得残余物溶于乙酸乙酯，依次用5％nahco3(3
×
20ml) 和0.5mol/l hcl(3
×
20ml)洗涤。留盐酸水相，通过添加na2co3将水相溶液 的ph值调节至8.0左右，并用二氯甲烷(3
×
20ml)萃取，以63.4％的产率产生 呈灰白色固体，命名为urs-alkyne。1h nmr(400mhz,chloroform-d)δ8.18(s,1h), 4.77(s,1h),3.34(d,j＝3.2hz 1h),1.47(d,j＝3.2hz,1h),1.44(d,j＝8.2hz,1h), 1.72(dd,j＝3.2hz 2h),2.19(dd,j＝3.2hz 2h),1.31(m,2h),1.56(dd,j＝7.2hz, 2h),1.56(dd,j＝7.2hz 2h),1.55(dd,j＝3.2hz,2h),1.91(dd,j＝6.1hz,2h), 1.63(dd,j＝7.2hz,2h),1.63(s,2h)3.94(d,j＝8.2hz,2h),1.01(m,3h),0.89(s, 3h),0.84(m,3h),0.88-0.89(s,12h),3.08(s,1h),2.22(s,1h),1.07(d,j＝6.1hz, 1h),0.94(m,1h),5.19(s,1h)。
[0073]
步骤2，在氩气氛围下，将上述制备的0.05mmol urs-alkyne、0.15mmol ru-n3、 0.01mmol的五水硫酸铜和0.02mmol的抗坏血酸钠溶解在dmf中搅拌9h，反 应结束后，旋蒸除去溶剂，柱层析分离得到黄色产物，产率65.9％。命名为urs-ru。 1
h nmr(400mhz,dmso-d6)δ9.53
–
9.49(m,1h),9.37(d,j＝5.8hz,1h),8.59 (d,j＝1.9hz,2h),8.18(s,1h),7.74(dd,j＝5.3.08(s,1h),9,1.8hz,1h),7.66(dd, j＝6.0,1.8hz,1h),6.23
–
6.19(m,2h),5.98
–
5.94(m,2h),5.19(s,1h),4.88(s, 2h),4.77(s,1h),3.94(d,j＝8.2hz,2h),3.34(d,j＝3.2hz 1h),2.59(s,3h),2.56 (d,j＝6.9hz,1h),2.22(s,1h),2.19(dd,j＝3.2hz 2h),2.18(s,3h),1.91(dd,j＝ 6.1hz,2h),1.72(dd,j＝3.2hz 2h),1.63(dd,j＝7.2hz,2h),1.63(s,2h),1.56(dd, j＝7.2hz,2h),1.56(dd,j＝7.2hz 2h),1.55(dd,j＝3.2hz,2h),1.47(d,j＝3.2 hz,1h),1.44(d,j＝8.2hz,1h),1.31(m,2h),1.07(d,j＝6.1hz,1h),1.01(m,3h), 0.94(dd,j＝6.9,2.0hz,6h),0.94(m,1h),0.89(s,3h),0.88-0.89(s,12h),0.84(m, 3h)。esi-ms[urs-ru]

：理论值：989.18，实验值：989.50。
[0074]
实施例8
[0075][0076]
本发明金属配合物cel-ru的制备方法，包括以下步骤：
[0077]
步骤1，在氩气氛围下，将南蛇藤醇与n-羟基苯并三唑和n,n-二异丙基乙胺 溶解在有dmf中，一定温度下反应5min，将一定量的1-(3-二甲氨基丙基)-3
‑ꢀ
乙基碳二亚胺盐酸盐溶解于dmf中并滴加到反应混合物中。混合物在0℃下反 应一段时间后，向混合溶液中滴加炔丙胺。使反应混合物升温至室温过夜。搅拌 过夜后，除去有机溶剂，将所得残余物溶于乙酸乙酯，依次用5％nahco3(3
×
20 ml)和0.5mol/l hcl(3
×
20ml)洗涤。留盐酸水相，通过添加na2co3将水相 溶液的ph值调节至8.0左右，并用二氯甲烷(3
×
20ml)萃取，以73.8％的产率 产生呈灰白色固体，命名为cel-alkyne。1h nmr(400mhz,chloroform-d)δ10.68 (s,1h),8.18(s,1h),7.34(s,2h),6.33(s,j＝3.2hz,1h),5.86(s,1h),3.94(d,j＝ 7.2hz,2h),3.08(d,j＝8.2hz,1h),2.42(s,3h),1.91(dd,j＝6.1hz,2h),1.69(dd, j＝6.1hz,2h),1.67(dd,j＝3.2hz,2h),1.56(dd,j＝6.1hz,2h),1.38(dd,j＝7.3 hz,2h),1.27(s,3h),1.25(d,j＝8.2hz,2h),1.20(s,3h),1.01(s,3h),0.94(s,1h), 0.89(m,2h),0.70(s,6h)。
[0078]
步骤2，在氩气氛围下，将上述制备的0.05mmol cel-alkyne、0.15mmol ru-n3、 0.01mmol的五水硫酸铜和0.02mmol的抗坏血酸钠溶解在dmf中搅拌9h，反 应结束后，旋蒸除去溶剂，柱层析分离得到黄色产物，产率47.2％。命名为cel-ru。 δ10.68(s,1h),9.53
–
9.49(m,1h),9.37(d,j＝5.8hz,1h),8.59(d,j＝1.9hz,2h), 8.18(s,1h),7.74(dd,j＝5.9,1.8hz,1h),7.66(dd,j＝6.0,1.8hz,1h),7.34(s,2h), 6.33(s,j＝3.2hz,1h),6.23
–
6.19(m,2h),5.98
–
5.94(m,2h),5.86(s,1h),4.88(s, 2h),3.94(d,j＝7.2hz,2h),3.08(d,j＝8.2hz,1h),2.59(s,3h),2.56(d,j＝6.9hz, 1h),2.42(s,3h),2.18(s,3h),1.91(dd,j
＝6.1hz,2h),1.69(dd,j＝6.1hz,2h), 1.67(dd,j＝3.2hz,2h),1.56(dd,j＝6.1hz,2h),1.38(dd,j＝7.3hz,2h),1.27(s, 3h),1.25(d,j＝8.2hz,2h),1.20(s,3h),1.01(s,3h),0.94(dd,j＝6.9,2.0hz, 6h),0.94(s,1h),0.89(m,2h),0.70(s,6h)。esi-ms[cel-ru]

：理论值：983.42，实 验值：983.72。
[0079]
本发明金属抗血癌配合物在制备抗肿瘤药物方面的应用。
[0080]
方法：mtt比色法、cck-8比色法。本实验测定对人源癌细胞系a2780(卵 巢癌)，a549(肺癌)及其nb-4(白血病)在体外的抗癌活性。a2780，a549 细胞在含有10％胎牛血清、1％青霉素-链霉素溶液的dmem培养基中，nb-4细 胞在含有10％胎牛血清、1％青霉素-链霉素溶液的1640培养基中，于37℃，5％ co2细胞培养箱中培养。将细胞按照5000细胞/孔的初始密度接种到96孔细胞培 养板中，培养24h后，加入不同浓度梯度的药物培养基，继续培养48h后，铺有 a2780，a549细胞的孔板，每个孔中加入20μl的mtt水溶液(5mg/ml)，继 续孵育4h，最后吸去培养基，加入150μl的dmso，使用酶标仪晃动1分钟并 读取590nm的吸光度。而铺有nb-4细胞孔板，每个孔板中加入10μl cck-8， 继续孵育3h，直接使用酶标仪晃动1分钟并读取450nm的吸光度。
[0081]
实施例1制得全反式维甲酸钌金属配合物的抗癌活性如表1所示。
[0082]
表1为细胞内外制得的配合物ret-ru-cell，ret-ru-chem，维甲酸炔 (ret-alkyne)，联吡啶钌叠氮(ru-n3)及顺铂(cddp)得ic
50
(μm)值。
[0083][0084]
结果表明：化学合成的钌配合物ret-ru-chem和细胞内合成的钌配合物 ret-ru-cell对上述几种肿瘤细胞的活性均远高于两个前体的抗肿瘤活性，尤其针 对nb-4表现出较好的抗癌活性，体现了对白血病细胞的靶向性。且无论在体内 还是在体外均对正常细胞无毒害作用。证明了基于抗白血病活性分子维甲酸钌的 配合物对癌细胞具有很高的选择性。以上结果证明，基于抗白血病活性分子合成 的芳基金属配合物可通过降低细胞给药浓度进而降低药物的毒副作用。
[0085]
实施例2制得维甲酸铱配合物的抗癌活性如表2所示。
[0086]
表2为细胞内外制得的配合物ret-ir-cell，ret-ir-chem，维甲酸炔 (ret-alkyne)，联吡啶铱叠氮(ir-n3)及顺铂(cddp)得ic
50
(μm)值。
[0087][0088]
结果表明：有机抗白血病活性分子前体ret-alkyne，金属配体ir-n3的抗肿瘤 活性远低于化学合成的铱配合物ret-ir-chem和细胞内合成的铱配合物ret-ir-cell 抗癌活性，且无论在体内还是在体外均对正常细胞无毒害作用。以上结果再次证 明，基于抗白血病活性分子合成的芳基金属配合物可通过降低细胞给药浓度进而 降低药物的毒副作用，以及对白血病具有良好的靶向性。
[0089]
实施例3制得紫苏醇钌配合物的抗癌活性如表3所示。
[0090]
表3为细胞内外制得的配合物per-ru-cell，per-ru-chem，紫苏醇炔 (per-alkyne)，联吡啶钌叠氮(ru-n3)及顺铂(cddp)得ic
50
(μm)值。
[0091][0092]
结果表明：化学合成的钌配合物per-ru-chem，对几种肿瘤细胞均具有较高 的抗增殖活性，而细胞内合成的钌配合物per-ru-cell对白血病细胞表现出较好的 抗增殖活性，且无论在体内还是在体外均对正常细胞无毒害作用。以上结果再次 证明，基于抗白血病活性分子合成的芳基金属配合物可通过降低细胞给药浓度进 而降低药物的毒副作用，以及对白血病具有良好的靶向性。
[0093]
实施例4制得芳樟醇钌配合物的抗癌活性如表4所示。
[0094]
表4为细胞内外制得的配合物lin-ru-cell，lin-ru-chem，芳樟醇炔 (lin-alkyne)，联吡啶钌叠氮(ru-n3)及顺铂(cddp)得ic
50
(μm)值。
[0095]
[0096]
结果表明：化学合成的钌配合物lin-ru-chem对几种肿瘤的抗增殖活性远高 于有机抗白血病活性分子前体lin-alkyne的抗增殖活性，金属配体ru-n3对几种 细胞几乎没活性(ic
50
》100μm)。且无论在体内还是在体外配合物均对正常细 胞无毒害作用。结果再次证明，基于抗白血病活性分子合成的芳基金属配合物可 通过降低细胞给药浓度进而降低药物的毒副作用，以及对白血病具有良好的靶向 性。
[0097]
实施例5制得4-氨基-2-芳基-6,9-二氯苯佐蝶啶钌配合物的抗癌活性如表5所 示。
[0098]
表5为细胞内外制得的配合物pte-ru-cell，pte-ru-chem，苯佐蝶啶炔 (pte-alkyne)，联吡啶钌叠氮(ru-n3)及顺铂(cddp)得ic
50
(μm)值。
[0099][0100]
结果表明：有机抗白血病活性分子前体pte-alkyne，金属配体ru-n3对几种肿 瘤细胞基本无毒性，化学合成的钌配合物pte-ru-chem对几种肿瘤细胞表现出与 顺铂相当的抗癌活性，而细胞内合成的钌配合物pte-ru-cell仅对白血病细胞表现 出优异的抗癌活性，且无论在体内还是在体外均对正常细胞无毒害作用。以上结 果再次证明，基于抗白血病活性分子合成的芳基金属配合物对白血病具有良好的 靶向性，且可通过降低细胞给药浓度进而降低药物的毒副作用。
[0101]
实施例6制得ptc钌配合物的抗癌活性如表6所示。
[0102]
表6为细胞内外制得的配合物ptc-ru-cell，ptc-ru-chem，ptc-alkyne， 联吡啶钌叠氮(ru-n3)及顺铂(cddp)得ic
50
(μm)值。
[0103][0104]
结果表明：化学合成的钌配合物ptc-ru-chem对几种肿瘤细胞表现与顺铂 相当的抗癌活性，而细胞内合成的钌配合物ptc-ru-cell仅对白血病细胞表现出 优异的抗癌活性，而有机抗白血病活性分子前体ptc-alkyne，金属配体ru-n3对 几种肿瘤细胞几乎无毒性，且无论在体内还是在体外均对正常细胞无毒害作用。 以上结果证明了，基于抗白血病活性分子合成的芳基金属配合物可通过降低细胞 给药浓度进而降低药物的毒副作用，以及对白血病具有良好的靶向性。
[0105]
实施例7制得熊果酸钌配合物的抗癌活性如表7所示。
[0106]
表7为细胞内外制得的配合物urs-ru-cell，urs-ru-chem，熊果酸炔 (urs-alkyne)，联吡啶钌叠氮(ru-n3)及顺铂(cddp)得ic
50
(μm)值。
[0107][0108]
结果表明：有机抗白血病活性分子前体urs-alkyne，化学合成的钌配合物 urs-ru-chem对几种肿瘤细胞均表现出很高的抗癌活性，细胞内合成的钌配合物 仅对白血病表现出良好的抗癌活性。且无论在体内还是在体外均对正常细胞无毒 害作用。以上结果再次证明，基于抗白血病活性分子合成的芳基金属配合物可通 过降低细胞给药浓度进而降低药物的毒副作用，以及对白血病具有良好的靶向性。
[0109]
实施例8制得南蛇藤醇钌配合物的抗癌活性如表8所示。
[0110]
表8为细胞内外制得的配合物cel-ru-cell，cel-ru-chem，南蛇藤醇炔 (cel-alkyne)，联吡啶钌叠氮(ru-n3)及顺铂(cddp)得ic
50
(μm)值。
[0111][0112]
结果表明：化学合成的钌配合物cel-ru-chem对几种肿瘤细胞均表现出很高 的抗癌活性，细胞内合成的钌配合物cel-ru-cell仅对白血病表现出良好的抗癌活 性。有机抗白血病活性分子前体cel-alkyne，金属配体ru-n3对这几种肿瘤细胞 均无毒性，且无论在体内还是在体外均对正常细胞无毒害作用。以上结果再次证 明，基于抗白血病活性分子合成的芳基金属配合物可通过降低细胞给药浓度进而 降低药物的毒副作用，以及对白血病具有良好的靶向性。
[0113]
实施例9
[0114]
本发明化学合成的钌配合物ret-ru-chem在细胞中的定位。
[0115]
方法：nb-4细胞接种于100mm培养皿中。培养18小时后，加入10μm配 合物ret-ru-chem继续培养。12小时后，收集细胞并用pbs(4℃)洗涤两次。 使用线粒体/细胞核制备试剂盒取出细胞核、线粒体和细胞质，然后依次用浓硝酸 (100μl，95℃)消化2小时。过氧化氢(50μl，95℃)消化1.5小时，浓盐 酸(100μl，95℃)消化2小时。冷却后用超纯水稀释至2ml，通过电感耦合 等离子质谱icp-ms测定不同细胞器中样品中金属ru的含量。
[0116]
实施例1的钌配合物ret-ru-chem细胞内定位如图1所示，将配合物 ret-ru-chem(10μm)与nb-4细胞共孵育12h后，提取细胞器，通过电感耦合 等离子质谱icp-ms测定不同细胞器中样品中金属ru的含量。图中数据说明了配 合物ret-ru-chem主要分布于线粒体中。
[0117]
结果表明：钌配合物ret-ru-chem可以短时间内大量通过细胞膜被nb-4细 胞摄取，主要定位于线粒体中，少量分布于细胞质中。
[0118]
实施例10
[0119]
本发明化学合成的钌配合物ret-ru-chem，细胞内合成的钌配合物 ret-ru-cell诱导细胞凋亡。
[0120]
方法：将nb-4细胞接种到六孔板中，生长18h，加入不同浓度的钌配合物 ret-ru-chem和ret-ru-cell。孵育24小时，收集细胞并用pbs洗涤两次，将细 胞重悬于500μl binding buffer中，加入5μl annexin v-fitc并混匀。5分钟后 加入5μl propidium iodide混匀，避光孵育15分钟，bd facsverse流式细胞仪 分析样品，flowjo7.6软件分析数据。
[0121]
实施例1化学合成的钌配合物ret-ru-chem，细胞内合成的钌配合物 ret-ru-cell诱导细胞凋亡如图2所示代表给药24h后，不同浓度梯度下的配合物 ret-ru-chem与ret-ru-cell诱导nb-4细胞凋亡的流式图以及细胞的凋亡各期百 分比图(左为化学合成的钌配合物，右为细胞内合成的钌配合物)，由图中数据可 以看出，在给药浓度为60μm时，有明显的细胞凋亡现象。
[0122]
结果表明：化学合成的钌配合物ret-ru-chem，细胞内合成的钌配合物 ret-ru-cell可诱导细胞发生凋亡。
[0123]
实施例11
[0124]
本发明化学合成的钌配合物ret-ru-chem，细胞内合成的钌配合物 ret-ru-cell将细胞周期阻滞在s期。
[0125]
方法：将nb-4细胞接种在6孔细胞板中，在5％co2的气氛中，在37℃下 孵育18小时后，加入所需浓度的ret-ru-chem和ret-ru-cell。在37℃下用 ret-ru-chem和ret-ru-cell处理24小时后，收获细胞，用冷pbs洗涤两次，并 在4℃下用70％乙醇固定过夜。固定后的混合物用pbs洗涤2次，用rnase a (100μg/ml)预处理10min后与碘化丙啶(pi，50μg/ml)孵育30min，用pbs 洗涤2次，然后进行流式细胞仪分析以评估nb-4对细胞周期阻滞的影响。
[0126]
实施例1化学合成的钌配合物ret-ru-chem，细胞内合成的钌配合物 ret-ru-cell将细胞周期阻滞在s期如图3所示，给药24h后，不同浓度梯度下的 配合物ret-ru-chem和ret-ru-cell对nb-4细胞周期阻滞效果的流式图(左为化 学合成的钌配合物，右为细胞内合成的钌配合物)，由图中可以看出，随着药物浓 度的增大，g0/g1期的细胞越来越多，由此可得出配合物ret-ru-chem和 ret-ru-cell可将nb-4细胞阻滞在g0/g1期。
[0127]
结果表明：化学合成的钌配合物ret-ru-chem，细胞内合成的钌配合物 ret-ru-cell将细胞周期阻滞在s期。
[0128]
实施例12
[0129]
本发明化学合成的钌配合物ret-ru-chem，细胞内合成的钌配合物 ret-ru-cell可促进活性氧(ros)生成。
[0130]
方法：nb-4细胞接种在6孔细胞板中，37℃孵育18小时。在与20μmret-ru-chem和20μm ret-ru-cell进一步孵育12小时和24小时后，收集细胞并 用pbs洗涤两次。在37℃，将细胞暴露于荧光探针2',7'-二氯荧光素二乙酸酯 (dcfh-da，10μm)中20分钟。然后用pbs将细胞洗涤、重悬并装入共聚焦 比色皿中，并在激光共聚焦显微镜下对细胞进行成像。
[0131]
实施例1化学合成的钌配合物ret-ru-chem，细胞内合成的钌配合物 ret-ru-cell可促进活性氧(ros)生成如图4所示，nb-4细胞分别与ret-ru-chem (20μm)、ret-ru-cell(20μm)共孵育12h，24h后，通过激光共聚焦检测配 合物ret-ru-chem与ret-ru-cell诱导的胞内活性氧产生。由图中数据可以看出， 当加药12h时，细胞内就有大量的活性氧产生。
[0132]
结果表明：化学合成的钌配合物ret-ru-chem，细胞内合成的钌配合物 ret-ru-cell可促进活性氧(ros)生成。
[0133]
实施例13
[0134]
本发明化学合成的钌配合物ret-ru-chem，细胞内合成的钌配合物 ret-ru-cell可诱导线粒体膜电位下降。
[0135]
方法：将nb-4细胞接种于6孔板，培养18小时后，加入不同浓度的 ret-ru-chem和ret-ru-cell。孵育24h，收集细胞并用pbs洗两次，加入500μljc-1染色工作液重悬细胞，37℃孵育30分钟，收集细胞用jc-1染色缓冲液洗涤 两次，最后使用jc-1染色缓冲液重悬细胞。样品用bd facsverse流式细胞仪分 析，数据用flowjo 7.6软件分析。重悬细胞置于共聚焦小皿中，在激光共聚焦显 微镜下进行细胞成像。
[0136]
实施例1化学合成的钌配合物ret-ru-chem，细胞内合成的钌配合物 ret-ru-cell诱导线粒体膜电位下降如图5，6所示，nb-4细胞在不同浓度配合物 ret-ru-chem与ret-ru-cell中孵育24h后，细胞线粒体膜电位变化。可以看出随 着药物浓度的增加，线粒体膜电位呈下降趋势，说明配合物ret-ru-chem和 ret-ru-cell可诱导nb-4细胞线粒体膜电位的下降；nb-4细胞分别在20μm的 ret-ru-chem和20μm ret-ru-cell中孵育24h后，细胞线粒体膜电位变化的激光 共聚焦图，由图可以看出与对照相比，加药组细胞线粒体膜电位有很明显的下降。
[0137]
结果表明：化学合成的钌配合物ret-ru-chem，细胞内合成的钌配合物 ret-ru-cell诱导线粒体膜电位下降。
[0138]
实施例14
[0139]
本发明化学合成的钌配合物ret-ru-chem，细胞内合成的钌配合物 ret-ru-cell可诱导细胞产生自噬小体。
[0140]
方法：将nb-4细胞接种于6孔板中，生长18小时后，加入20μm配合物 ret-ru-chem和ret-ru-cell。孵育24小时后，收集细胞，用pbs洗涤2次，用 4％多聚甲醛(pfa)固定细胞，除去固定液，用pbs洗涤细胞3次，将细胞滴在 载玻片上，均匀分布，并快速干燥。用0.2％tritonx-100渗透和1.5％bsa封闭 处理后，加入一抗稀释液并孵育1小时。去除一抗，用pbs洗3次，并与fitc 偶联的二抗在黑暗中孵育1小时。去除二抗，用pbs洗涤3次，用dapi染色细 胞核5分钟。去除染料并用pbs洗涤3次，共聚焦显微镜下进行细胞成像。
[0141]
实施例1化学合成的钌配合物ret-ru-chem，细胞内合成的钌配合物 ret-ru-cell可诱导细胞产生自噬小体如图7所示，nb-4细胞分别在20μm的 ret-ru-chem和20μm ret-ru-cell中孵育24h后，细胞内有自噬小体的产生，说 明nb-4细胞通过自噬的方式死亡。
[0142]
结果表明：化学合成的钌配合物ret-ru-chem，细胞内合成的钌配合物 ret-ru-cell诱导细胞产生自噬小体。