一种利格列汀有关物质的检测方法与流程

1.本发明涉及药物分析领域，具体而言，涉及一种利格列汀有关物质的检测方法。


背景技术：

2.利格列汀(linagliptin)，化学名为8-[(3r)-3-氨基-1-哌啶基]-7-(2-丁炔基-1)-3,7-二氢-3-甲基-1-[(4-甲基-2-喹唑啉基)甲基]-1h-嘌呤-2,6-二酮，是一种选择性二肽基肽酶-4(dpp-4)抑制剂，dpp-4能够降解肠促胰岛素激素样多肽-1(glp-1)以及葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(gip)。利格列汀能够升高活性肠促胰岛素激素的浓度，以葡萄糖依赖性的方式刺激胰岛素释放，降低循环中的胰高血糖素水平。利格列汀片临床上用于治疗2型糖尿病。
[0003]
药物制剂在生产和/或储存过程中会引入有关物质，这些有关物质都会不同程度地影响药物的稳定性安全性，因此有必要在药物的生产和贮存过程中严格的控制药物有关物质的含量。药物的有关物质检查也是控制药物纯度，提高药品质量的一个非常重要的环节。8-[(3r)-3-叔丁氧羰氨基哌啶-1-基]-7-(丁-2-炔-1-基)-3-甲基-1-[(4-甲基喹唑啉-2-基)甲基]-3,7-二氢-1h-嘌呤-2,6-二酮，结构如式ⅰ所示，为利格列汀的常见杂质之一，其存在会严重影响利格列汀的药品质量和患者的用药安全。
[0004][0005]
利格列汀片进口药注册标准(jx20120110)中记载了其有关物质的测定方法，该方法采用agilent zorbax xdb-c18 4.6*150mm 5μm色谱柱，以15mm磷酸盐缓冲液(ph2.5)为流动相a，甲醇：乙腈＝55：45为流动相b，在波长为225nm，柱温为55℃，流速为1.5ml/min的条件下进行梯度洗脱，检测利格列汀片中的有关物质，洗脱程序为0-9min，65％a-55％a；9-16min，55％a-25％a；16-18min，25％a，18-18.01min，25％a-65％a；18.01-23min，65％a。
[0006]
然而，研究发现上述检测方法并不能有效分离利格列汀样品中潜在的式i杂质，难以满足工业生产中利格列汀产品的质量控制要求，亟待开发出一种适用性广、准确度高、分离效果好的利格列汀有关物质的检测方法，以弥补现有技术存在的缺陷。


技术实现要素：

[0007]
本发明的目的在于提供一种利格列汀有关物质的检测方法。
[0008]
本发明采用的技术方案如下：
[0009]
一种利格列汀有关物质的检测方法，色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以15mm磷酸盐缓冲液：甲醇-乙腈混合溶液＝60-65：40-35(v/v)为流动相a，以甲醇-乙腈(48-52：52-48，v/v)为流动相b，进行梯度洗脱，检测利格列汀中的有关物质；其中，流动
相a中磷酸盐缓冲盐ph为2.5
±
0.1；甲醇-乙腈混合溶液中甲醇-乙腈＝48-52：52-48(v/v)。
[0010]
进一步地，洗脱程序如表1所示。
[0011]
表1本发明的洗脱程序
[0012]
时间(min)流动相a(v％)流动相b(v％)010009851522475325396127396127.011000351000
[0013]
进一步地，流动相b中甲醇-乙腈＝50：50(v/v)。
[0014]
进一步地，流动相a中磷酸盐缓冲液：甲醇-乙腈混合溶液＝65：35(v/v)。
[0015]
进一步地，柱温为25-35℃；进一步地，柱温为30℃。
[0016]
进一步地，检测波长为224-226nm；进一步地，检测波长为225nm。
[0017]
进一步地，流动相的流速为1.0-1.5ml/min；进一步地，流速为1.2ml/min。
[0018]
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
[0019]
本发明提供的利格列汀有关物质的检测方法能有效分离利格列汀中的各种有关物质，其具有基线平稳、峰形美观、耐用性高、重复性好、准确度高等优点，对于利格列汀的质量控制有着重要意义。
附图说明
[0020]
本发明将通过例子并参照附图的方式说明，其中：
[0021]
图1是对比例1中色谱条件下的hplc色谱图；
[0022]
图2是对比例2中色谱条件下的hplc色谱图；
[0023]
图3是对比例3中色谱条件下的hplc色谱图；
[0024]
图4是对比例4中色谱条件下的hplc色谱图；
[0025]
图5是对比例5中色谱条件下的hplc色谱图；
[0026]
图6是实施例1中色谱条件下的hplc色谱图；
[0027]
图7是实施例2中初始条件下供试品溶液的hplc色谱图；
[0028]
图8是对比例6中色谱条件下的hplc色谱图；
[0029]
图9是对比例7中色谱条件下的hplc色谱图。
具体实施方式
[0030]
对比例1
[0031]
api溶液：精密称取不含式i化合物的利格列汀(购自teva公司)10mg，加入稀释液(ph2.5磷酸盐缓冲液-乙腈70:30)超声10min使其溶解，转入100ml容量瓶定容至刻度，即得。
[0032]
式i化合物定位溶液：精密称取式i化合物(购自teva公司)对照品1.5mg置于100ml
容量瓶，加入稀释液(ph2.5磷酸盐缓冲液-乙腈70:30)超声使其溶解并定容至刻度，即得定位贮备液；精密量取该贮备液1ml置于100ml容量瓶，加入稀释液(同上)定容至刻度，即得。
[0033]
api氧化破坏溶液：精密称取利格列汀(购自teva公司)10mg，置于100ml容量瓶，加入稀释液(ph2.5磷酸盐缓冲液-乙腈70:30)5ml，超声10min使其溶解，然后加入3％双氧水，混合均匀后于60℃下水浴30min，取出加入稀释液(同上)超声30min后加入稀释液定容至刻度，过滤，取续滤液即得。
[0034]
取上述api溶液、式i化合物定位溶液及api氧化破坏溶液各10μl，进样至高效液相色谱仪进行分析。色谱条件如下：
[0035]
色谱柱：agilent zorbax xdb-c18 4.6*150mm，5μm；
[0036]
流动相a：15mm磷酸盐缓冲液，ph2.5；
[0037]
流动相b：甲醇：乙腈55：45；
[0038]
波长：225nm；
[0039]
柱温：55℃；
[0040]
流速：1.5ml/min；
[0041]
洗脱方式：梯度洗脱，洗脱程序如表2所示。
[0042]
表2对比例1中的洗脱程序
[0043]
时间(min)流动相a(v％)流动相b(v％)065359554516257518257518.016535236535
[0044]
结果如图1所示。图1-a中，
①
为api溶液色谱检测曲线，其中，m为主峰(即api色谱峰)；a为某未知杂质峰，a的保留时间为16.652min；
②
为式i化合物定位溶液色谱检测曲线，其中b为式i化合物色谱峰，保留时间为16.644min。对比可知，式i化合物色谱峰与api溶液中的未知杂质峰a重叠，无法对二者进行有效分离。同时，该检测方法下色谱曲线基线漂移较为严重，不利于目标峰的定性和定量。图1-b为api氧化破坏溶液的色谱图，m为主峰，色谱峰1-10为杂质峰；杂质峰2与主峰m之间分离度差，并且杂质峰3、4之间分离度差。由此可见，该方法不适合于利格列汀有关物质的分析。
[0045]
对比例2
[0046]
api溶液、式i化合物定位溶液及api氧化破坏溶液均同对比例1。
[0047]
取上述api溶液、式i化合物定位溶液及api氧化破坏溶液各10μl，进样至高效液相色谱仪进行分析。色谱条件除色谱柱外，其余条件均同对比例1。本对比例中采用的色谱柱为agilent zorbax xdb-c184.6*250mm，5μm。
[0048]
结果如图2所示。图2-a中，
①
为api溶液色谱检测曲线，其中m为主峰；a为某未知杂质峰，a的保留时间为17.248min；
②
为式i化合物定位溶液色谱检测曲线，其中b为式i化合物的色谱峰，保留时间为17.306min。式i化合物与api溶液中的该未知杂质保留时间十分接近，无法对二者进行有效分离，基线漂移也未见改善，在实际应用中极易对杂质的定性和定
量产生干扰，不适于工业应用。图2-b为api氧化破坏溶液的色谱图，其中m为主峰，色谱峰1-11为杂质峰，杂质峰4与主峰m之间分离度差。由此可见，该方法不适合于利格列汀有关物质的分析。
[0049]
对比例3
[0050]
api溶液、式i化合物定位溶液及api氧化破坏溶液均同对比例1。
[0051]
取上述api溶液、式i化合物定位溶液及api氧化破坏溶液各10μl，进样至高效液相色谱仪进行分析。色谱条件如下：
[0052]
色谱柱：agilent zorbax xdb-c18 4.6*250mm，5μm；
[0053]
流动相a：15mm磷酸盐缓冲液，ph2.0；
[0054]
流动相b：甲醇：乙腈55：45；
[0055]
波长：225nm；
[0056]
柱温：45℃；
[0057]
流速：1.5ml/min；
[0058]
洗脱方式：梯度洗脱，洗脱程序如表2所示。
[0059]
结果如图3所示。图3-a中，
①
为api溶液色谱检测曲线，其中m为主峰；a为某未知杂质峰，a的保留时间为17.095min；
②
为式i化合物定位溶液色谱检测曲线，其中b为式i化合物的色谱峰，保留时间为17.117min。式i化合物色谱峰b与api溶液中的未知杂质峰a基本重叠，无法将二者有效分离，并且基线严重漂移，不利于目标峰的定性和定量。图3-b为api氧化破坏溶液的色谱图，其中m为主峰，色谱峰1-11为杂质峰，主峰m与相邻杂质峰之间分离度改善，但杂质峰4、5之间未实现分离。由此可见，该方法不适合于利格列汀有关物质的分析。
[0060]
对比例4
[0061]
api溶液、式i化合物定位溶液及api氧化破坏溶液均同对比例1。
[0062]
取上述api溶液、式i化合物定位溶液及api氧化破坏溶液各10μl，进样至高效液相色谱仪进行分析。色谱条件如下：
[0063]
色谱柱：agilent zorbax xdb-c18 4.6*250mm，5μm；
[0064]
流动相a：15mm磷酸盐缓冲液，ph4.0；
[0065]
流动相b：甲醇：乙腈55：45；
[0066]
波长：225nm；
[0067]
柱温：35℃；
[0068]
流速：1.5ml/min；
[0069]
洗脱方式：梯度洗脱，洗脱程序如表2所示。
[0070]
结果如图4所示。图4-a中，
①
为api溶液色谱检测曲线，其中m为主峰；a为某未知杂质峰，a的保留时间为19.842min；
②
为式i化合物定位溶液色谱检测曲线，其中b为式i化合物的色谱峰，保留时间为19.768min。式i化合物色谱峰b与api溶液中的该未知杂质峰a基本重叠，无法有效分离二者。图4-b为api氧化破坏溶液的色谱图，其中m为主峰，色谱峰1-10为杂质峰，杂质峰5与主峰m之间未实现分离。由此可见，该方法不适合于利格列汀有关物质的分析。
[0071]
对比例5
[0072]
api氧化破坏溶液同对比例1。取api氧化破坏溶液10μl，进样至高效液相色谱仪进
行分析。色谱条件如下：
[0073]
色谱柱：agilent zorbax xdb-c18 4.6*250mm，5μm；
[0074]
流动相a：15mm磷酸盐缓冲液，ph2.5；
[0075]
流动相b：甲醇：乙腈50：50；
[0076]
波长：225nm；
[0077]
柱温：30℃；
[0078]
流速：1.2ml/min；
[0079]
洗脱方式：梯度洗脱，洗脱程序如表3所示。
[0080]
表3对比例5中的洗脱程序
[0081]
时间(min)流动相a(v％)流动相b(v％)010009851522475325396127396127.011000351000
[0082]
结果如图5所示。图5中，m为主峰，色谱峰1-10为杂质峰，杂质峰3、4之间分离度差，并且杂质峰6、7、8、9、10的峰形差。由此可见，该方法不适合于利格列汀有关物质的分析。
[0083]
实施例1
[0084]
api溶液、式i化合物定位溶液及api氧化破坏溶液均同对比例1。
[0085]
加标api溶液：精密称取不含式i化合物的利格列汀(购自teva公司)10mg置于100ml容量瓶，加入约80ml稀释液(ph2.5磷酸盐缓冲液-乙腈70:30)超声10min使其溶解，再加入式i化合物的定位贮备液(约15μg/ml)1ml，加稀释液定容至刻度，即得。
[0086]
取上述api溶液、式i化合物定位溶液、加标api溶液及api氧化破坏溶液各10μl，进样至高效液相色谱仪进行分析。色谱条件如下：
[0087]
色谱柱：agilent zorbax xdb-c18 4.6*250mm 5μm；
[0088]
流动相a：磷酸盐缓冲液(取磷酸二氢钾2.0g，加水1000ml使溶解，并用磷酸调节ph至2.5)：[甲醇-乙腈(50:50)](65:35)；
[0089]
流动相b：甲醇：乙腈(50：50)；
[0090]
波长：225nm；
[0091]
柱温：30℃；
[0092]
流速：1.2ml/min。
[0093]
洗脱方式：梯度洗脱，洗脱程序如表3所示。
[0094]
结果如图6所示。图6中，
①
为api溶液色谱检测曲线，其中m为主峰；a为某未知杂质峰，a的保留时间为26.447min；
②
为式i化合物定位溶液的色谱检测曲线，其中b为式i化合物的色谱峰，保留时间为26.928min，
③
为加标api溶液的色谱检测曲线，其中m
′
为主峰，a
′
为未知杂质峰，保留时间为26.451min，b
′
为式i化合物的色谱峰，保留时间为26.919min；a
′
与b
′
的分离度为1.52。结合色谱检测曲线
①
、
②
及
③
可以看出，本检测方法下，式i化合物与
api溶液中的未知杂质有效分离；基线平稳，利于目标峰的定性和定量。图6-b为api氧化破坏溶液的色谱图，其中m为主峰，色谱峰1-11为杂质峰，主峰m与相邻杂质分离度好，各杂质峰之间的分离度也符合分析要求。由此可见，该方法能同时分离利格列汀中的各种有关物质，适用性好，适合于利格列汀有关物质的分析。
[0095]
实施例2
[0096]
耐用性测试条件如下：
[0097]
柱温变化：在实施例1色谱条件柱温30℃基础上变更
±
5℃，即25℃和35℃。
[0098]
流速变化：在实施例1色谱条件流速1.2ml/min基础上变更
±
0.1ml/min，即1.1ml/min和1.3ml/min。
[0099]
流动相a中磷酸盐缓冲液ph变化：在实施例1流动相a中磷酸盐缓冲液ph2.5基础上变更
±
0.2，及ph2.3和ph2.7。
[0100]
供试品溶液：精密称取利格列汀样品(参照文献：刘祥生,张毅,张吉泉,et al.利格列汀的合成[j].中国医药工业杂志,2016,47(01):4-7.中提供的方法合成)10mg置于100ml容量瓶，加入稀释液(ph2.5磷酸盐缓冲液-乙腈70:30)超声10min使其溶解后加稀释液定容至刻度，即得。
[0101]
对照溶液：精密量取供试品溶液1ml置于100ml容量瓶，加入稀释液(ph2.5磷酸盐缓冲液-乙腈70:30)定容至刻度，即得。
[0102]
本发明中，杂质含量采用不加校正因子的主成分自身对照法进行计算，计算公式如下：
[0103][0104][0105]a对
为对照溶液中主峰面积；
[0106]a杂
为供试品溶液中单个杂质峰面积；
[0107]
总杂即为总杂质，a1+a2....+an为供试品溶液中单个杂质峰面积总和，100为稀释倍数。
[0108]
本实施例中，在上述各个色谱条件下变化时，各耐用性样品溶液与最优条件中各有关物质含量极差均不大于
±
0.01％，总杂含量rsd为4.0％。具体结果如表4和图7所示。图7为实施例1中色谱条件(初始条件)下的供试品溶液的色谱图(其他条件下的供试品溶液色谱图可参考该色谱图)，其中m为主峰，色谱峰1、2、3分别为表4中有关物质1、2、3的色谱峰，图7中其余小峰因峰面积占比低于0.03％，忽略不计。
[0109]
表4利格列汀检测方法耐用性考察结果表
[0110][0111]
由表4可知，本发明提供的本发明的利格列汀有关物质的检测方法耐用性好。
[0112]
对比例6
[0113]
取api氧化破坏溶液(同对比例1)10μl，进样至高效液相色谱仪进行分析。色谱条件除洗脱程序外，其余均同实施例1。洗脱程序如表5所示。
[0114]
表5对比例6中的洗脱程序
[0115]
时间(min)流动相a(v％)流动相(v％)085159554516257518257518.018515238515
[0116]
结果如图8所示。图8中，m为主峰，色谱峰1-11为杂质峰；杂质峰4与主峰m之间分离度差。由此可见，该方法不适合于利格列汀有关物质的检测。
[0117]
对比例7
[0118]
取api氧化破坏溶液(同对比例1)10μl，进样至高效液相色谱仪进行分析。色谱条件除洗脱程序外，其余均同实施例1。洗脱程序如表6所示。
[0119]
表6对比例7中的洗脱程序
[0120]
时间(min)流动相(v％)流动相(v％)085159554520307022257525257525.018515308515
[0121]
结果如图9所示。图9中，m为主峰，色谱峰1-10为杂质峰，杂质峰与主峰m之间分离度改善，但杂质峰4、5之间分离度差。由此可见，该方法不适合于利格列汀有关物质的检测。

技术特征：
1.一种利格列汀有关物质的检测方法，其特征在于，色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以15mm磷酸盐缓冲液：甲醇-乙腈混合溶液＝60-65：40-35(v/v)为流动相a，以甲醇-乙腈(48-52：52-48，v/v)为流动相b，进行梯度洗脱，检测利格列汀中的有关物质；其中，流动相a中磷酸盐缓冲盐ph为2.5
±
0.1；甲醇-乙腈混合溶液中甲醇-乙腈＝48-52：52-48(v/v)。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，洗脱程序为：3.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，流动相b中甲醇-乙腈＝50：50(v/v)。4.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，流动相a中磷酸盐缓冲液：甲醇-乙腈混合溶液＝65：35(v/v)。5.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，柱温为25-35℃。6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于，柱温为30℃。7.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，检测波长为224-226nm。8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，检测波长为225nm。9.根据权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于，流动相的流速为1.0-1.5ml/min。10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于，流速为1.2ml/min。

技术总结
本发明提供一种利格列汀有关物质的检测方法，涉及药物分析领域。该方法中，色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以15mM磷酸盐缓冲液：甲醇-乙腈混合溶液＝60-65：40-35(V/V)为流动相A，以甲醇-乙腈(48-52：52-48，V/V)为流动相B，进行梯度洗脱，检测利格列汀中的有关物质；其中，流动相A中磷酸盐缓冲盐pH为2.5


技术研发人员：高青青 侯慧 闫娟 李素秋 李芳 何威轩 苏忠海
受保护的技术使用者：成都倍特药业股份有限公司
技术研发日：2020.11.23
技术公布日：2022/5/25