一种利用数字PCR鉴定精液的方法及其专用试剂盒与流程

一种利用数字pcr鉴定精液的方法及其专用试剂盒
技术领域
1.本发明属于法医学领域，具体涉及一种利用数字pcr鉴定精液的方法及其专用试剂盒。


背景技术：

2.准确确定案发现场遗留的体液斑迹组织属性对于确定案件性质、重建犯罪现场等具有重要意义，而精斑是法医案件中常见的生物物证，尤其是强奸、猥亵等案件，对其准确定性至关重要。传统的精斑检验方法包括化学法、酶催化法、光谱法和免疫学法等，具有对检材完整性要求高、灵敏度和特异性各异、检验结果不稳定且影响后续dna检测等局限性。microrna(mirna)是一种长度为18-25个碱基的非编码小分子rna，具有高稳定性、强保守性、良好的组织特异性、可兼容dna同步分析等优势，是法医体液鉴定的重要工具。
3.一直以来，实时定量pcr(rt-qpcr)被认为是检测mirna表达定量的金标准，也是目前基于mirna进行体液鉴定的主流检测方法，但该方法需要科学准确地选择内参基因进行相对定量分析或通过已知浓度的标准品制作标准曲线以进行绝对定量。另一方面，qpcr针对不同的目标基因需要设计单独的检测体系，复合检测难度较大，无形中限制了其在法医实践中的广泛应用。大量研究表明，mir-891a-5p具有良好的精液特异性，但目前使用的检测方法均为rt-qpcr相对定量法，存在一定的假阳性和假阴性概率，且不同研究可重复性和一致性较差。
4.数字pcr是近些年逐渐发展成熟的一种可对微量核酸样本进行绝对定量检测的方法，其原理是将待测样本分成数万个微滴，每个微滴不含或含有至少一个待检核酸靶分子，经过独立pcr反应后，逐个对每个微滴进行检测，最终根据泊松分布原理及阳性微滴比例，给出待检靶分子的拷贝浓度。数字pcr是一种高灵敏度、高精确性的定量方法，尤其对于低浓度核酸分子检测结果可重复性好，可用于mirna的绝对定量检测。与qpcr相比，数字pcr对pcr抑制剂的耐受能力更强，对pcr效率的依赖性更小，并可进行多重检测。然而，迄今为止，数字pcr技术尚未引入法医学体液鉴定领域。
5.此外，目前大多数研究仅使用新鲜制备的实验室样本进行检测和分析，但考虑到法医实际工作的特殊性和法医相关检材的复杂性，犯罪现场遗留的体液斑迹往往具有微量、降解的特点，且有可能与其他体液不同程度混合。因此，混合斑以及微量、降解样本的检测一直是法医体液鉴定的重点和难点，迫切需要一种准确、灵敏、高效的精斑检验技术。


技术实现要素：

6.本发明的目的为准确、灵敏、高效的鉴定精液或精斑。
7.本发明首先保护一种用于鉴定精液的试剂盒，可包括引物对891、逆转录引物891、水解探针891、引物对rnu6b、逆转录引物rnu6b和水解探针rnu6b；
8.引物对891可由正向引物-891f和反向引物-891r组成；
9.水解探针891的5
′
末端具有荧光标记甲，3
′
末端具有非荧光淬灭基团；
10.引物对rnu6b可由正向引物rnu6b-f和反向引物rnu6b-r组成；
11.水解探针rnu6b的5
′
末端具有荧光标记乙，3
′
末端具有非荧光淬灭基团；
12.所述逆转录引物891的核苷酸序列可如seq id no：2所示；
13.所述正向引物-891f的核苷酸序列可如seq id no：3所示；
14.所述反向引物-891r的核苷酸序列可如seq id no：4所示；
15.所述水解探针891的核苷酸序列可如seq id no：5所示；
16.所述逆转录引物rnu6b的核苷酸序列可如seq id no：7所示；
17.所述正向引物rnu6b-f的核苷酸序列可如seq id no：8所示；
18.所述反向引物rnu6b-r的核苷酸序列可如seq id no：9所示；
19.所述水解探针rnu6b的核苷酸序列如可seq id no：10所示。
20.上述试剂盒中，所述荧光标记甲可为hex荧光标记。所述荧光标记乙可为fam荧光标记。所述非荧光淬灭基团可为mgb探针的淬灭基团。
21.所述试剂盒具体可由所述引物对891、所述逆转录引物891、所述水解探针891、所述引物对rnu6b、所述逆转录引物rnu6b和所述水解探针rnu6b组成。
22.本发明还保护上述任一所述试剂盒的应用，可为如下d1)或d2)：
23.d1)鉴定或辅助鉴定精液；
24.d2)检测或辅助检测待测样本中是否含有精液；
25.所述应用用于非疾病的诊断与治疗。
26.本发明还保护一种鉴定或辅助鉴定待测样本中是否含有精液的方法，可包括如下步骤：
27.(a1)获得若干精液样本和若干非精液样本中的mir-891a-5p拷贝浓度和mir-891a-5p/rnu6b比值；所述mir-891a-5p/rnu6b比值为mir-891a-5p拷贝浓度和rnu6b拷贝浓度的比值；
28.所述非精液样本为月经血、外周血、唾液和阴道分泌液中的至少一种；
29.(a2)对步骤(a1)获得的mir-891a-5p拷贝浓度和mir-891a-5p/rnu6b比值进行roc曲线分析，获得鉴定精液的mir-891a-5p最佳截断值和鉴定精液的mir-891a-5p/rnu6b比值最佳截断值；之后进行如下判断：
30.若待测样本的mir-891a-5p拷贝浓度低于阴性对照样本，则待测样本不含有精液；
31.若待测样本的mir-891a-5p拷贝浓度高于阴性对照样本且大于mir-891a-5p最佳截断值，则待测样本含有精液；
32.若待测样本的mir-891a-5p拷贝浓度高于阴性对照样本且为mir-891a-5p最佳截断值以下：当待测样本的log2(mir-891a-5p/rnu6b)＞log2(mir-891a-5p/rnu6b比值最佳截断值)时，则待测样本含有精液；当待测样本的log2(mir-891a-5p/rnu6b)≤log2(mir-891a-5p/rnu6b比值最佳截断值)时，则待测样本不含有精液；
33.所述方法用于非疾病的诊断与治疗。
34.上述方法中，所述mir-891a-5p拷贝浓度和所述rnu6b拷贝浓度的获得方法可包括如下步骤：
35.(1)取样本的总rna，采用逆转录引物891和逆转录引物rnu6b进行反转录，获得样本的cdna；
36.(2)以步骤(1)获得的样本的cdna为模板，以水解探针891、正向引物-891f、反向引物-891r、水解探针rnu6b、正向引物rnu6b-f和反向引物rnu6b-r进行数字pcr，获得微滴数据；根据微滴数据获得mir-891a-5p拷贝浓度和rnu6b拷贝浓度；mir-891a-5p拷贝浓度低于0.1copies/μl视为未检出，拷贝浓度记为0copies/μl；
37.所述逆转录引物891的核苷酸序列可如seq id no：2所示；
38.所述正向引物-891f的核苷酸序列可如seq id no：3所示；
39.所述反向引物-891r的核苷酸序列可如seq id no：4所示；
40.所述水解探针891的核苷酸序列可如seq id no：5所示；水解探针891的5
′
末端具有荧光标记甲，3
′
末端具有非荧光淬灭基团；
41.所述逆转录引物rnu6b的核苷酸序列可如seq id no：7所示；
42.所述正向引物rnu6b-f的核苷酸序列可如seq id no：8所示；
43.所述反向引物rnu6b-r的核苷酸序列可如seq id no：9所示；
44.所述水解探针rnu6b的核苷酸序列可如seq id no：10所示；水解探针rnu6b的5
′
末端具有荧光标记乙，3
′
末端具有非荧光淬灭基团。
45.上述方法中，所述荧光标记甲可为hex荧光标记。所述荧光标记乙可为fam荧光标记。所述非荧光淬灭基团可为mgb探针的淬灭基团。
46.上述任一所述的方法中，进行数字pcr的体系中，水解探针891和水解探针rnu6b的浓度可为250nmol/l，正向引物-891f、反向引物-891r、正向引物rnu6b-f和反向引物rnu6b-r的浓度可为900nmol/l。
47.上述任一所述的方法中，进行数字pcr的反应程序具体可为95℃10min；94℃30s，59.8℃60s，72℃30s，45个热循环；98℃10min；4℃保持。
48.上述任一所述的方法中，所述阴性对照样本的制备方法可如下：
49.(a1)制备反应体系；反应体系含有dntp mix、rt buffer、rnase inhibitor、逆转录引物891、逆转录引物rnu6b、样本的总rna和去核酸酶水；
50.所述逆转录引物891的核苷酸序列可如seq id no：2所示；
51.所述逆转录引物rnu6b的核苷酸序列可如seq id no：7所示；
52.(a2)将反应体系进行反转录，获得阴性对照样本。
53.所述(a1)中，反应体系具体为15μl，由0.15μl dntp mix(100mm total)、1.5μl10
×
rt buffer、0.19μl rnase inhibitor(20u/μl)、0.75μl逆转录引物891水溶液(1μmol/l)、0.75μl逆转录引物rnu6b水溶液(1μmol/l)、5μl样本的总rna和5.66μl去核酸酶水组成。
54.所述(a2)中，反应条件可为：16℃30min；42℃30min；85℃5min；4℃保持。
55.本发明还保护检测待测样本中mir-891a-5p拷贝浓度和rnu6b拷贝浓度的物质的应用，可为如下d1)或d2)：
56.d1)鉴定或辅助鉴定精液；
57.d2)检测或辅助检测待测样本中是否含有精液；
58.所述应用用于非疾病的诊断与治疗。
59.上述应用中，所述检测待测样本中mir-891a-5p拷贝浓度和rnu6b拷贝浓度的物质可为上述任一所述引物对891、上述任一所述逆转录引物891、上述任一所述水解探针891、上述任一所述引物对rnu6b、上述任一所述逆转录引物rnu6b和上述任一所述水解探针
rnu6b。
60.本发明通过设计5’端不同荧光修饰的taqman mgb探针来实现对mir-891a-5p和rnu6b的数字pcr双重检测，对训练集5种体液(包括精液、外周血、月经血、唾液、阴道分泌液)共107份样本进行检测，通过非参数检验和roc曲线分析评价其鉴别精液的能力，并制备不同比例混合斑、微量精液、模拟案件精斑以测试体系准确性。结果表明，精液中mir-891a-5p表达水平显著高于其他体液(p＜0.0001)且能够实现100％准确区分；所有测试条件下的精液斑(包括与其他4种体液1：100混合的精斑、0.008μl的微量精液以及室外放置14d、紫外照射24h、洗涤的精斑等)均检测出精液特异性成分mir-891a-5p且均被准确鉴别。与qpcr相比，数字pcr技术具有以下优势：1)对核酸分子进行绝对定量，克服了归一化和校准的问题；2)在检测微量目标核酸时精确度、重复性和灵敏度更高；3)对潜在的pcr抑制剂相对不敏感，更不易受扩增效率的影响。此外，为了确保整个体系的有效性，本发明首次将体液特异性mirna与阳性对照在同一反应体系内进行双重数字pcr检测，避免了因样本在rna提取、逆转录和ddpcr过程中出现问题而造成的假阴性和假阳性概率。同时复合检测可以大大节省样本，简化实验流程，缩减检测成本，有利于实际案件工作的应用和推广。
61.综上所述，本发明成功建立了双重数字pcr检测mir-891a-5p与内参基因rnu6b的体系，从而获得了基于数字pcr技术的准确、灵敏的精液检验方法，能够实现精液的100％准确鉴别，混合斑、微量精液、模拟案件精斑样本均被准确判定。因此，本发明具有很好的应用前景，有望在法医实际案件中进行广泛应用。
附图说明
62.图1为图1为数字pcr检测体系退火温度梯度扩增一维图。
63.图2为roc曲线分析。
具体实施方式
64.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
65.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
66.下述实施例中，数字pcr反应在qx200 autodg droplet digital pcr system(美国bio-rad公司)上进行，该设备包括自动化微滴发生仪、px1
tm
热封仪、c1000touch
tm
热循环仪和qx200
tm
微滴分析仪。
67.下述实施例中，外周血样本为通过静脉穿刺收集入edta抗凝采血管内获得。唾液样本为将志愿者唾液收集在离心管中获得，样本收集前禁食1h。月经血样本为志愿者用无菌棉签在月经第2d或第3d时采集。精液样本为将志愿者将新鲜精液收集在取精杯中获得；样本收集前，志愿者禁欲2天。阴道分泌液为使用卫生棉条获取(性交后至少一周)。所有样本采集制备后均储存于-80℃备用。样本采集通过了公安部物证鉴定中心伦理委员会的审查，所有志愿者均已签署知情同意书。
68.实施例1、鉴定精液的试剂盒的制备
69.本发明的发明人制备了鉴定精液的试剂盒，由引物对891、逆转录引物891、水解探针891、引物对rnu6b、逆转录引物rnu6b和水解探针rnu6b组成。引物对891由正向引物-891f和反向引物-891r组成。水解探针891的5
′
末端具有hex荧光标记，3
′
末端具有mgb探针的淬灭基团。引物对rnu6b由正向引物rnu6b-f和反向引物rnu6b-r组成。水解探针rnu6b的5
′
末端具有fam荧光标记，3
′
末端具有mgb探针的淬灭基团。
70.由生工(上海)生物科技有限公司合成逆转录引物891、水解探针891、正向引物-891f、反向引物-891r、逆转录引物rnu6b、水解探针rnu6b、正向引物rnu6b-f和反向引物rnu6b-r。
71.mir-891a-5p和内参基因rnu6b的核苷酸序列、用于进行逆转录的引物、用于扩增的正向引物和反向引物、水解探针具体见表1。
72.表1
[0073][0074]
注：下划线部分为水解探针与rna自身序列区域结合的碱基。
[0075]
实施例2、利用数字pcr鉴定精液的方法的建立
[0076]
一、实验方法
[0077]
1、待测样本的总rna的提取
[0078]
(1)用mirneasy mini kit(qiagen，德国)提取待测样本的总rna，rna洗脱体积统一至30μl，得到待测样本的总rna。
[0079]
(2)使用nanodrop 2000c(thermo fisher scientific，美国)测定待测样本的总rna的浓度和纯度(od260/280)。
[0080]
2、待测样本的cdna的获得
[0081]
(1)取待测样本的总rna，按照microrna reverse transcription kit(thermo fisher scientific，美国)说明书的步骤，采用实施例1制备的试剂盒中的逆转录引物891和逆转录引物rnu6b进行反转录，获得待测样本的cdna。
[0082]
反应体系为15μl，由0.15μl dntp mix(100mm total)、1.00μl multiscribe
tm rt enzyme(50u/μl)、1.5μl 10
×
rt buffer、0.19μl rnase inhibitor(20u/μl)、0.75μl逆转
录引物891水溶液(1μmol/l)、0.75μl逆转录引物rnu6b水溶液(1μmol/l)、5μl待测样本的总rna和5.66μl去核酸酶水组成。
[0083]
反应条件为：16℃30min；42℃30min；85℃5min；4℃保持。
[0084]
(2)按照步骤(1)的方法，将反应体系中的multiscribe
tm rt enzyme替换为去核酸酶水，其它步骤均不变，得到阴性对照模板。
[0085]
3、微滴式数字pcr扩增反应
[0086]
(1)配制反应体系
[0087]
反应体系为24μl，由12μl ddpcr supermix for probes(no dutp)、1.6μl待测样本的cdna、水解探针891、正向引物-891f、反向引物-891r、水解探针rnu6b、正向引物rnu6b-f、反向引物rnu6b-r和去核酸酶水组成；反应体系中，水解探针891和水解探针rnu6b的浓度为250nmol/l，正向引物-891f、反向引物-891r、正向引物rnu6b-f和反向引物rnu6b-r的浓度为900nmol/l。
[0088]
(2)完成步骤(1)后，将反应体系转移至96孔板中，于自动化微滴发生仪生成微滴，放置另一96孔板以接收生成的微滴。
[0089]
(3)完成步骤(2)后，将接收生成微滴的96孔板盖膜、封膜，进行pcr扩增反应，得到pcr扩增产物。
[0090]
反应程序：95℃10min；94℃30s，56～62℃60s，72℃30s，45个热循环；98℃10min；4℃保持。升降温速度为2.0℃/s。
[0091]
(4)完成步骤(3)后，将所述96孔板取出，置于qx200
tm
微滴分析仪上读取微滴数据，采用quantasoft v1.7.4进行数据收集与分析。包含10000个以上微滴的反应被视为有效反应，并用于数据分析。mir-891a-5p拷贝浓度低于0.1copies/μl视为未检出，拷贝浓度记为0copies/μl。
[0092]
按照上述步骤，将待测样本的cdna替换为阴性对照模板，其它步骤均不变，作为阴性对照。
[0093]
4、退火温度的优化
[0094]
使用c1000 touch tm
热循环仪温度梯度功能进行pcr扩增退火温度的优化(62℃～56℃)。设置退火温度梯度包括：62℃、61.6℃、60.9℃、59.8℃、58.4℃、57.3℃、56.5℃、56℃。
[0095]
5、数字pcr鉴定精液的方法的建立
[0096]
对107个待测样本进行mir-891a-5p和rnu6b的双重数字pcr检测，包括67份精液斑样本(58份精液、9份精斑)、40份非精液斑样本(10份外周血、10份月经血、10份唾液、10份阴道分泌液)，得到阴性对照和各个待测样本的mir-891a-5p和rnu6b的拷贝浓度(由qx200 autodg droplet digital pcr system自动生成)。其中42份精液为10μl，16份精液为300μl，9份精斑为50μl精液制成，6份外周血为10μl，4份外周血为500μl，6份唾液为10μl，4份唾液为2ml，月经血和阴道分泌液为剪取2cm2卫生棉。
[0097]
对mir-891a-5p以及mir-891a-5p/rnu6b比值进行roc曲线分析，以确定本检测体系鉴别能力(auc)以及最佳截断值。
[0098]
6、数据分析
[0099]
精斑与其他常见体液表达差异性分析使用graphpad prism 9软件进行非参数检
验(mann-whitney u检验)及roc曲线分析，p＜0.05表示差异有统计学意义。
[0100]
二、实验结果
[0101]
1、双重ddpcr检测体系的优化
[0102]
退火温度的优化实验见图1(a为rnu6b；b为mir-891a-5p；a08～h08退火温度分别为62℃、61.6℃、60.9℃、59.8℃、58.4℃、57.3℃、56.5℃、56℃)。根据两个检测通道阳性微滴和阴性微滴的分离状态，退火温度优化为59.8℃(d08)。
[0103]
2、数字pcr鉴定精液的方法的建立
[0104]
(1)本研究将5种体液共107份样本用于数字pcr鉴定精液的方法的建立，每种体液类型样本rna浓度、纯度、mir-891a-5p拷贝浓度、rnu6b拷贝浓度和mir-891a-5p拷贝浓度/rnu6b拷贝浓度的检测结果见表2。阴性对照的mir-891a-5p拷贝浓度为0.1copies/μl以下。
[0105]
结果表明，5种体液所有样本的rnu6b拷贝浓度均为阳性；所有精液样本均能检测出mir-891a-5p且表达水平较高(1.70～2890.00copies/μl)；大多数非精液样本(34/40)未检测出mir-891a-5p，少数非精液样本(6/40)虽然能检测到mir-891a-5p但mir-891a-5p拷贝浓度极低(≤0.69copies/μl)且仅存在于样本总rna浓度较高时。经非参数检验(mann-whitney u检验)，mir-891a-5p以及mir-891a-5p/rnu6b比值(即内参归一化后的mir-891a-5p表达量)在精液中均显著高于其他体液，p值均小于0.0001，具有显著性差异。
[0106]
表2.mir-891a和rnu6b在5种体液样本中的表达量
[0107][0108][0109]
注：a表示该体液类型样本中rnu6b拷贝数最高值超出数字pcr检测限(即所有微滴fam通道均为阳性)。
[0110]
(2)roc曲线分析见图2(a为mir-891a-5p；b为mir-891a-5p/rnu6b比值)：mir-891a-5p以及mir-891a-5p/rnu6b比值区分精液与非精液的能力均为100％(auc＝1)，即通过mir-891a-5p的绝对定量或相对表达量均可实现对精液样本的准确鉴别。mir-891a-5p最佳截断值为1.195copies/μl；mir-891a-5p/rnu6b比值最佳截断值为0.000548，即log2
(mir-891a-5p/rnu6b)＝-10.834。
[0111]
据此，上述建立的数字pcr鉴定精液的方法的鉴定原则如下：1)若样本的mir-891a-5p拷贝浓度低于阴性对照，则该样本不含有精液；2)若样本的mir-891a-5p拷贝浓度高于阴性对照且大于1.195copies/μl，则该样本含有精液；3)若样本的mir-891a-5p拷贝浓度高于阴性对照且为1.195copies/μl以下，则需结合内参基因计算mir-891a-5p/rnu6b比值以获取相对表达量，若log2(mir-891a-5p/rnu6b)＞-10.834，则该样本含有精液；若log2(mir-891a-5p/rnu6b)≤-10.834，则该样本不含有精液。
[0112]
实施例3、实施例2建立的方法的应用
[0113]
一、实施例2建立的方法在检测混合斑中的应用
[0114]
1、将精液样本(精液样本1、精液样本2或精液样本3)和200μl非精液样本(外周血样本、月经血样本、唾液样本或阴道分泌液样本)按照1：10、1：50或1：100的比例混合，得到混合样本。其中，200μl阴道分泌液样本取自2.5cm2卫生棉。
[0115]
2、将混合样本作为待测样本，按照实施例2建立的方法检测混合样本的mir-891a-5p拷贝浓度和log2(mir-891a-5p/rnu6b)。
[0116]
检测结果见表3。结果表明，所有混合样本均可检测出mir-891a-5p且被鉴定为含有精液(mir-891a-5p＞1.195copies/μl)。log2(mir-891a-5p/rnu6b)随着混合比例中精液成分的降低而逐渐下降，说明rnu6b在样本中的稳定性较好，也一定程度上反映出rnu6b作为内参基因的适用性。
[0117]
表3
[0118][0119][0120]
注：值1为mir-891a-5p(copies/μl)，值2为log2(mir-891a-5p/rnu6b)。
[0121]
二、实施例2建立的方法在检测微量样本中的应用
[0122]
1、取1μl精液样本(精液样本1、精液样本2或精液样本3)，用无菌水依次进行2倍梯度稀释，共8个梯度，得到微量样本。取1μl微量样本进行检测，即精液量分别为1μl、0.5μl、0.25μl、0.125μl、0.063μl、0.031μl、0.016μl、0.008μl。
[0123]
2、将步骤1得到的微量样本作为待测样本，按照实施例2建立的方法检测微量样本的mir-891a-5p拷贝浓度和log2(mir-891a-5p/rnu6b)。
[0124]
检测结果见表4。结果表明，随着精液量的降低，rnu6b和mir-891a-5p的数字pcr定量结果均呈现出明显的下降规律，而nanodrop 2000c测量的总rna浓度并没有明显规律。正如其他研究报道所说，nanodrop等方法对低浓度rna样本的定量准确性较差，本研究也进一步证实了这种说法，若按照不准确的定量结果进行后续检测可能会造成假阴性。因此，本发明的发明人采用恒定的rna体积进行rt-dpcr、利用阳性对照进行归一化的方法用于后续的mirna精液斑鉴定研究，而不是依赖不准确的定量方法，这将简化分析，有利于实际案例的mirna实验室应用和实施。当精液量降低至0.063μl时仍可通过mir-891a-5p的拷贝浓度鉴定精液；当精液量降低至0.008μl时，虽然mir-891a-5p的拷贝浓度达不到判定为精液阳性的标准，但此时可以通过log2(mir-891a-5p/rnu6b)对上样量进行归一化后将样本鉴定为精液。
[0125]
表4
[0126][0127][0128]
注：值1为mir-891a-5p(copies/μl)，值2为log2(mir-891a-5p/rnu6b)。
[0129]
三、实施例2建立的方法在检测模拟案件精斑样本中的应用
[0130]
1、将50μl精液样本(精液样本1、精液样本2或精液样本3)置于棉签，晾干。
[0131]
2、完成步骤1后，于室外自然露天条件下放置0d、4d、8d或14d，得到室外放置样本；置于紫外灯下照射0h、4h、8h或24h，得到紫外灯照射样本；先用“蓝月亮”牌洗衣液浸泡10min，再用自来水冲洗20s，得到洗涤后样本；静置10min，得到未洗涤样本。
[0132]
室外放置样本、紫外灯照射样本和洗涤后样本均为模拟案件精斑样本。
[0133]
3、将步骤2得到的模拟案件精斑样本和未洗涤样本作为待测样本，按照实施例2建立的方法检测模拟案件精斑样本和未洗涤样本的mir-891a-5p拷贝浓度和log2(mir-891a-5p/rnu6b)。
[0134]
检测结果见表4。室外放置样本精液特异性成分mir-891a-5p在4d时已显著降低，且随着时间梯度逐渐减少，而内参基因rnu6b拷贝浓度与mir-891a-5p相比较为稳定；相较于室外放置样本，紫外灯照射样本的精斑mir-891a-5p拷贝浓度随时间梯度的变化较小，仅
在第一个梯度(从0h到4h)下降较明显；洗涤后样本mir-891a-5p拷贝浓度显著降低。根据实施例2中数字pcr鉴定精液的方法的鉴定原则，所有模拟降解样本(室外放置样本、紫外灯照射样本、洗涤样本)均被判定为含有精液。
[0135]
表5
[0136][0137]
注：值1为mir-891a-5p(copies/μl)，值2为log2(mir-891a-5p/rnu6b)。
[0138]
上述结果表明，利用实施例1制备的鉴定精液的试剂盒和实施例2建立的方法可以准确的鉴定精液，具有极高的准确性。
[0139]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

技术特征：
1.一种用于鉴定精液的试剂盒，包括引物对891、逆转录引物891、水解探针891、引物对rnu6b、逆转录引物rnu6b和水解探针rnu6b；引物对891由正向引物-891f和反向引物-891r组成；水解探针891的5
′
末端具有荧光标记甲，3
′
末端具有非荧光淬灭基团；引物对rnu6b由正向引物rnu6b-f和反向引物rnu6b-r组成；水解探针rnu6b的5
′
末端具有荧光标记乙，3
′
末端具有非荧光淬灭基团；所述逆转录引物891的核苷酸序列如seq id no：2所示；所述正向引物-891f的核苷酸序列如seq id no：3所示；所述反向引物-891r的核苷酸序列如seq id no：4所示；所述水解探针891的核苷酸序列如seq id no：5所示；所述逆转录引物rnu6b的核苷酸序列如seq id no：7所示；所述正向引物rnu6b-f的核苷酸序列如seq id no：8所示；所述反向引物rnu6b-r的核苷酸序列如seq id no：9所示；所述水解探针rnu6b的核苷酸序列如seq id no：10所示。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述荧光标记甲为hex荧光标记；所述荧光标记乙为fam荧光标记；所述非荧光淬灭基团为mgb探针的淬灭基团。3.权利要求1或2所述的试剂盒的应用，为如下d1)或d2)：d1)鉴定或辅助鉴定精液；d2)检测或辅助检测待测样本中是否含有精液；所述应用用于非疾病的诊断与治疗。4.一种鉴定或辅助鉴定待测样本中是否含有精液的方法，包括如下步骤：(a1)获得若干精液样本和若干非精液样本中的mir-891a-5p拷贝浓度和mir-891a-5p/rnu6b比值；所述mir-891a-5p/rnu6b比值为mir-891a-5p拷贝浓度和rnu6b拷贝浓度的比值；所述非精液样本为月经血、外周血、唾液和阴道分泌液中的至少一种；(a2)对步骤(a1)获得的mir-891a-5p拷贝浓度和mir-891a-5p/rnu6b比值进行roc曲线分析，获得鉴定精液的mir-891a-5p最佳截断值和鉴定精液的mir-891a-5p/rnu6b比值最佳截断值；之后进行如下判断：若待测样本的mir-891a-5p拷贝浓度低于阴性对照样本，则待测样本不含有精液；若待测样本的mir-891a-5p拷贝浓度高于阴性对照样本且大于mir-891a-5p最佳截断值，则待测样本含有精液；若待测样本的mir-891a-5p拷贝浓度高于阴性对照样本且为mir-891a-5p最佳截断值以下：当待测样本的log2(mir-891a-5p/rnu6b)＞log2(mir-891a-5p/rnu6b比值最佳截断值)时，则待测样本含有精液；当待测样本的log2(mir-891a-5p/rnu6b)≤log2(mir-891a-5p/rnu6b比值最佳截断值)时，则待测样本不含有精液；所述方法用于非疾病的诊断与治疗。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述mir-891a-5p拷贝浓度和所述rnu6b拷贝浓度的获得方法包括如下步骤：(1)取样本的总rna，采用逆转录引物891和逆转录引物rnu6b进行反转录，获得样本的
cdna；(2)以步骤(1)获得的样本的cdna为模板，以水解探针891、正向引物-891f、反向引物-891r、水解探针rnu6b、正向引物rnu6b-f和反向引物rnu6b-r进行数字pcr，获得微滴数据；根据微滴数据获得mir-891a-5p拷贝浓度和rnu6b拷贝浓度；mir-891a-5p拷贝浓度低于0.1copies/μl视为未检出，拷贝浓度记为0copies/μl；所述逆转录引物891的核苷酸序列如seq id no：2所示；所述正向引物-891f的核苷酸序列如seq id no：3所示；所述反向引物-891r的核苷酸序列如seq id no：4所示；所述水解探针891的核苷酸序列如seq id no：5所示；水解探针891的5
′
末端具有荧光标记甲，3
′
末端具有非荧光淬灭基团；所述逆转录引物rnu6b的核苷酸序列如seq id no：7所示；所述正向引物rnu6b-f的核苷酸序列如seq id no：8所示；所述反向引物rnu6b-r的核苷酸序列如seq id no：9所示；所述水解探针rnu6b的核苷酸序列如seq id no：10所示；水解探针rnu6b的5
′
末端具有荧光标记乙，3
′
末端具有非荧光淬灭基团。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述荧光标记甲为hex荧光标记；所述荧光标记乙为fam荧光标记；所述非荧光淬灭基团为mgb探针的淬灭基团。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：进行数字pcr的体系中，水解探针891和水解探针rnu6b的浓度为250nmol/l，正向引物-891f、反向引物-891r、正向引物rnu6b-f和反向引物rnu6b-r的浓度为900nmol/l。8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：进行数字pcr的反应程序为95℃10min；94℃30s，59.8℃60s，72℃30s，45个热循环；98℃10min；4℃保持。9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述阴性对照样本的制备方法如下：(a1)制备反应体系；反应体系含有dntp mix、rt buffer、rnase inhibitor、逆转录引物891、逆转录引物rnu6b、样本的总rna和去核酸酶水；所述逆转录引物891的核苷酸序列如seq id no：2所示；所述逆转录引物rnu6b的核苷酸序列如seq id no：7所示；(a2)将反应体系进行反转录，获得阴性对照样本。10.检测待测样本中mir-891a-5p拷贝浓度和rnu6b拷贝浓度的物质的应用，为如下d1)或d2)：d1)鉴定或辅助鉴定精液；d2)检测或辅助检测待测样本中是否含有精液；所述应用用于非疾病的诊断与治疗。

技术总结
本发明公开了一种利用数字PCR鉴定精液的方法及其专用试剂盒。本发明成功建立了双重数字PCR检测miR-891a-5p与内参基因RNU6b的体系，从而获得了基于数字PCR技术的准确、灵敏的精液检验方法，能够实现精液的100％准确鉴别，混合斑、微量精液、模拟案件精斑样本均被准确判定。因此，本发明具有很好的应用前景，有望在法医实际案件中进行广泛应用。本发明具有重要的应用价值。的应用价值。


技术研发人员：孙启凡 石慧霞 季安全 魏孙祥 胡胜 赵一霞
受保护的技术使用者：公安部物证鉴定中心
技术研发日：2022.03.10
技术公布日：2022/5/25