一种柑橘贮运过程中酸腐病病害监测的方法

1.本发明涉及水果采后保鲜领域，尤其涉及一种柑橘贮运过程中酸腐病病害监测的方法。


背景技术：

2.酸腐病又被称为白霉病、湿塌烂，是柑橘果实采后贮藏运输过程中的主要病害之一，柑橘一旦被酸腐病菌侵染发病，果实在数天内迅速腐烂成为烂柿子般的粘湿团，流出汁液并散发出强烈的酸臭气味。其汁液中带有大量病原菌，病果附近果实极易受感染，导致柑橘大面积腐烂。目前，可用于酸腐病防治的防腐剂种类有限，而且其病程发展过快，防治难度较大。因此，在实际贮藏物流过程中，一旦发生酸腐病，应及时挑出病果，并根据病害发展情况，及时调整贮运和销售策略，尽早销售。
3.柑橘贮藏或长途运输过程中，大量的果实集中堆码在相对密闭的空间，更易导致酸腐病的大面积发病。目前实际生产中主要通过人员定期巡视来监测病害的发生。酸腐病果会散发出刺鼻的酸臭气味，易于辨识。然而，人的嗅觉容易对环境适应，敏感性迅速降低。为从密集堆垛的果实中发现病果，需抽检少量样品进行逐个观察，而对于位于堆垛下方的果实，需逐筐移出，才有可能发现病果的存在。因此，贮运过程中酸腐病果难以被及时发现，一旦出现往往已经出现了大面积腐烂，难以挽回经济损失。利用其特征性气味，开发更为灵敏而客观的检测技术手段，是及时发现柑橘酸腐病害的有效手段。


技术实现要素：

4.本发明利用柑橘酸腐病果具有易于辨识的酸臭气味这一特征，提供了一种柑橘贮运过程中酸腐病病害监测的方法，能够以贮运空间中的挥发性成分变化为基础，根据采集的信号预测该批次柑橘果实酸腐病发病情况，为大批量仓储和运输过程中及时发现病果、防止酸腐病害的大范围传播提供技术手段。
5.为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案：一种柑橘贮运过程中酸腐病病害监测的方法，该方法通过采集柑橘酸腐病害相关挥发性标志物的信号来预测该批次柑橘果实酸腐病发病情况；所述的柑橘酸腐病害相关挥发性标志物包括以下的一种或多种组合：3-甲氧基-3-甲基-1-丁烯、异戊烯醇、苯乙烯、γ-松油烯、芳樟醇、(+)-顺-柠檬烯-1，2-环氧化物、柠檬烯环氧化物、4-萜烯醇、d-二氢香芹酮、(+)-二氢香芹酮、z-香芹醇、d-香芹酮。
6.本发明所述酸腐病病害监测包括所有涉及柑橘采后各环节的病害检测，包括储存和运输等过程，本发明所述的“检测”和“监测”，在本发明的技术领域还可成为“评估”、“判断”、“判别”等。
7.作为优选，本发明的方法抽取柑橘贮运过程中的气体样本，采用气相色谱-质谱联用仪中进行分析。当然本发明也可以采用各类检测器、传感器或化学反应等方法所开展的
针对柑橘酸腐病的病害监测。
8.作为优选，气相色谱-质谱联用仪的检测参数如下：采用hp-5毛细管色谱柱进行成分分离；升温程序：先从40 ℃以3 ℃/min的速度升到70 ℃，再从70 ℃以1 ℃/min的速度升至130 ℃，最后从130 ℃以15 ℃/min 的速度升温到230 ℃，载气流速1.0 ml/min，离子源温度230 ℃，通过70 ev电子能量的电子轰击离子化；根据挥发性物质的总离子图，采用计算机进行ms数据库检索以及人工谱图分析，采用峰面积归一化方法求出各化合物的相对含量，以1-己醇（0.1% v/v）为内标进行定量计算各目标物质的含量，计算公式如下：c = （c
内标
ꢀ×ꢀv内标
ꢀ×ꢀa目标
）/（a
内标
ꢀ×ꢀm目标
）式中：m目标表示被检测样品的称量质量（mg/fw），c内标表示目标物的浓度（μl/ml）；v内标表示每个样品加入内标物的体积（ml）；a内标表示内标物的峰面积；c内标表示内标物的浓度（μl/ml）；a目标表示目标物的峰面积。
9.作为优选，本发明的方法将病斑平均直径大于1 cm定义为发病，按照发病程度将果实分为五个病程：i级病程-病斑直径10 mm、ii级病程-病斑直径30 mm、iii级病程-病斑直径50 mm、iv级病程-病斑直径70 mm和v级病程-整果腐烂。
10.作为再优选，五个病程的判断如下：i级病程：标志物含量（%）3-甲氧基-3-甲基-1-丁烯0.01~0.02%异戊烯醇0.02~0.05%苯乙烯＞0γ-松油烯＞0.02%芳樟醇＞0.02%(+)-顺-柠檬烯-1，2-环氧化物＞4.15
×
10-8
柠檬烯环氧化物＞4.15
×
10-8
4-萜烯醇＞0.91
×
10-3
d-二氢香芹酮＞0.91
×
10-3
(+)-二氢香芹酮＞0.91
×
10-3
z-香芹醇＞0.91
×
10-3
d-香芹酮＞0.91
×
10-3
ii级病程：标志物含量3-甲氧基-3-甲基-1-丁烯0.01~0.02%异戊烯醇0.02~0.07%苯乙烯＞0γ-松油烯＞0.02%芳樟醇＞0.02%
(+)-顺-柠檬烯-1，2-环氧化物＞4.15
×
10-8
柠檬烯环氧化物＞4.15
×
10-8
4-萜烯醇＞0.91
×
10-3
d-二氢香芹酮＞0.91
×
10-3
(+)-二氢香芹酮＞0.91
×
10-3
z-香芹醇＞0.91
×
10-3
d-香芹酮＞0.91
×
10-3
iii级病程：标志物含量3-甲氧基-3-甲基-1-丁烯0.01~0.02%异戊烯醇0.01~0.02%苯乙烯＞0γ-松油烯＞0.02%芳樟醇＞0.02%(+)-顺-柠檬烯-1，2-环氧化物0.0002~0.004%柠檬烯环氧化物＞4.15
×
10-8
4-萜烯醇0.91
×
10-3
~0.03%d-二氢香芹酮0.91
×
10-3
~0.03%(+)-二氢香芹酮＞0.91
×
10-3
z-香芹醇＞0.91
×
10-3
d-香芹酮＞0.91
×
10-3
iv级病程：标志物含量3-甲氧基-3-甲基-1-丁烯0.01~0.02%异戊烯醇0.01~0.02%苯乙烯＞0γ-松油烯＞0.02%芳樟醇＞0.02%(+)-顺-柠檬烯-1，2-环氧化物0.004~0.008%柠檬烯环氧化物＞4.15
×
10-8
4-萜烯醇0.91
×
10-3
~0.03%d-二氢香芹酮＞0.02%(+)-二氢香芹酮＞0.91
×
10-3
z-香芹醇＞0.91
×
10-3
d-香芹酮＞0.91
×
10-3
v级病程：标志物含量3-甲氧基-3-甲基-1-丁烯0.01~0.02%异戊烯醇0.01~0.03%
苯乙烯＞0γ-松油烯＞0.02%芳樟醇＞0.02%(+)-顺-柠檬烯-1，2-环氧化物0.001~0.006%柠檬烯环氧化物＞4.15
×
10-8
4-萜烯醇0.91
×
10-3
~0.03%d-二氢香芹酮＞0.02%(+)-二氢香芹酮＞0.91
×
10-3
z-香芹醇＞0.91
×
10-3
d-香芹酮＞0.91
×
10-3
本发明由于采用了上述的技术方案，提供了一种柑橘贮运过程中酸腐病病害监测的方法，能够以贮运空间中的挥发性成分变化为基础，根据采集的信号预测该批次柑橘果实酸腐病发病情况，为大批量仓储和运输过程中及时发现病果、防止酸腐病害的大范围传播提供技术手段。
附图说明
11.图1为12种标志物的化学结构式；其中methyl(2-methyl-3-butene-2-yl) ether（3-甲氧基-3-甲基-1-丁烯）、3-methyl-2-buten-1-ol（异戊烯醇）、styrene（苯乙烯）、γ-terpinene（γ-松油烯）、linalool（芳樟醇）、(+)-cis-limonene 1,2-epoxide（(+)-顺-柠檬烯-1，2-环氧化物）、(e)-limonene oxide（柠檬烯环氧化物）、terpinen-4-ol（4-萜烯醇）、d-dihydrocarvone（d-二氢香芹酮）、(+)-dihydrocarvone（(+)-二氢香芹酮）、z-carveol（z-香芹醇）、d-carvone（d-香芹酮）。
12.图2、图3为12种标志物在柑橘健康果实、酸腐病果和其他病害果实环境气体中的含量水平比较。
13.图4、图5为12种标志物区分健康果实vs病害果实的roc曲线。
14.图6、图7为12种标志物随着柑橘酸腐病果病程发展的含量变化。
具体实施方式
15.下面结合附图和具体实施例对本发明作出进一步的详细阐述。应理解，所述实施例仅用于解释本发明，并非用于限制本发明的范围。
16.实施例1：挥发性标志物在区分健康果实和酸腐病果中的应用1）试验方法选取大小均匀、无病虫害的
‘
宫川’温州蜜柑果实，自来水清洗后，再浸入2%的次氯酸钠溶液进行1-2 min消毒，取出后用自来水冲洗，去除残余次氯酸钠，自然晾干。在果实赤道部位用无菌接种针打孔，深度为1-2 cm，以接种相同体积无菌水为对照，接种1
×
106孢子/ml 病原菌孢子悬浮液20 μl，每组30个果实，每个处理重复3次，对照组果实接种20 μl无菌水。接种后的柑橘放置在塑料筐中，保鲜膜包装保湿，置于25 ℃、rh为95%的条件下培养。
17.每个处理组随机选取9个果实，观察记录发病症状动态变化，采用十字交叉法测量
病斑相互垂直方向上的直径，取平均值。病斑平均直径大于1 cm定义为发病，按照发病程度将果实分为五个病程：i级病果（病斑直径10 mm）、ii级病果（病斑直径30 mm）、iii级病果（病斑直径50 mm）、iv级病果（病斑直径70 mm，半果腐烂）、v级病果（整果腐烂）。
18.取不同病程的果实各9个，置于无味带呼吸阀的乐扣盒中，每盒3个，每组3个重复。每隔24 h盖上盒盖集气60 min后，用一次性注射器抽取2 ml顶空气体，迅速注入气相色谱-质谱联用仪（gc-ms，agilent 5975c-7890a气相质谱联用仪，美国）中进行分析。
19.gc-ms检测参数：采用hp-5毛细管色谱柱（30 m
×
0.25 mm，0.25 μm，agilent，美国）进行成分分离。升温程序：先从40 ℃以3 ℃/min的速度升到70 ℃，再从70 ℃以1 ℃/min的速度升至130 ℃，最后从130 ℃以15 ℃/min 的速度升温到230 ℃，载气流速1.0 ml/min，离子源温度230 ℃，通过70 ev电子能量的电子轰击离子化。根据挥发性物质的总离子图，采用计算机进行ms数据库检索以及人工谱图分析，采用峰面积归一化方法求出各化合物的相对含量，以1-己醇（0.1% v/v）为内标进行定量计算各目标物质的含量，计算公式如下：c = （c
内标
ꢀ×ꢀv内标
ꢀ×ꢀa目标
）/（a
内标
ꢀ×ꢀm目标
）式中：m目标表示被检测样品的称量质量（mg/fw），c内标表示目标物的浓度（μg/g）；v内标表示每个样品加入内标物的体积（ml）；a内标表示内标物的峰面积；c内标表示内标物的浓度（mg/ml）；a目标表示目标物的峰面积。
20.2）试验结果为避免柑橘贮藏过程中的气味变化干扰，本研究每个病程的果实均设置了在相同环境下放置相应时间的无菌水接种健康果实对照（hf）。为避免青腐病、绿腐病等柑橘其他常见病害的气体成分相混淆，本研究也相应地设置了青腐病（bm）、绿腐病（gm）接种的全病程果实对照。检测结果表明，本发明中的12种标志物（化学结构如图1所示），除γ-松油烯外，其余11种标志物在健康果实的气体环境中均未检出，而γ-松油烯的含量在健康果实气体环境中的含量远远低于酸腐病果（sr）的气体环境；3-甲氧基-3-甲基-1-丁烯、异戊烯醇、r-氧化柠檬烯、4-萜烯醇、d-二氢香芹酮、d-香芹酮在bm和gm果实气体环境中也未检出；苯乙烯、γ-松油烯、芳樟醇、柠檬烯-1 2-环氧化物、(+)-二氢香芹酮、z-香芹醇在bm和gm果实中偶有检出，但含量远低于sr果实（图2、图3）。
21.将12种化合物对sr果实与健康果实以及非酸腐病果（bm和gm）制作roc曲线结果如图2所示，γ-松油烯、芳樟醇、柠檬烯-1 2-环氧化物、(+)-二氢香芹酮、z-香芹醇、d-香芹酮、d-二氢香芹酮等7种标志物在的auc为1；3-甲氧基-3-甲基-1-丁烯、异戊烯醇、苯乙烯、r-氧化柠檬烯、4-萜烯醇等5种标志物的auc均在0.9以上（图4、图5）。
22.随着柑橘酸腐病果病程发展的含量变化，12种挥发性标志物的变化规律如图6、图7所示。12种标志物在健康果的气体环境中未能检出，而且均在病程i的果实种即可检出，并且在随后的病程中一直存在。表明该12种化合物灵敏度高，适用于酸腐病早期病害的监测。除了3-甲氧基-3-甲基-1-丁烯和异戊烯醇这两种化合物在病程i中含量最高，4-萜烯醇在病程v含量最高，其余大部分化合物随着病程发展逐渐升高，在病程iv中含量最高，随后在病程v含量略有下降。
23.实施例2：挥发性标志物在酸腐病果病程监测中的应用选取不同病程的果实，病程划分标准、果实集气方法、检测方法和定量方法同实施
例1。不同病程果实各化合物的含量如表1所示。检测结果表明，不同病程的果实微环境中标志物含量基本符合本说明书所划定的范围。
24.
技术特征：
1.一种柑橘贮运过程中酸腐病病害监测的方法，该方法通过采集柑橘酸腐病害相关挥发性标志物的信号来预测该批次柑橘果实酸腐病发病情况；其特征在于，所述的柑橘酸腐病害相关挥发性标志物包括以下的一种或多种组合：3-甲氧基-3-甲基-1-丁烯、异戊烯醇、苯乙烯、γ-松油烯、芳樟醇、(+)-顺-柠檬烯-1，2-环氧化物、柠檬烯环氧化物、4-萜烯醇、d-二氢香芹酮、(+)-二氢香芹酮、z-香芹醇、d-香芹酮。2.根据权利要求1所述的一种柑橘贮运过程中酸腐病病害监测的方法，其特征在于，该方法抽取柑橘贮运过程中的气体样本，采用气相色谱-质谱联用仪中进行分析。3.根据权利要求2所述的一种柑橘贮运过程中酸腐病病害监测的方法，其特征在于，气相色谱-质谱联用仪的检测参数如下：采用hp-5毛细管色谱柱进行成分分离；升温程序：先从40 ℃以3 ℃/min的速度升到70 ℃，再从70 ℃以1 ℃/min的速度升至130 ℃，最后从130 ℃以15 ℃/min 的速度升温到230 ℃，载气流速1.0 ml/min，离子源温度230 ℃，通过70 ev电子能量的电子轰击离子化；根据挥发性物质的总离子图，采用计算机进行ms数据库检索以及人工谱图分析，采用峰面积归一化方法求出各化合物的相对含量，以1-己醇（0.1% v/v）为内标进行定量计算各目标物质的含量，计算公式如下：c = （c
内标
ꢀ×ꢀv内标
ꢀ×ꢀ
a
目标
）/（a
内标
ꢀ×ꢀ
m
目标
）式中：m目标表示被检测样品的称量质量（mg/fw），c内标表示目标物的浓度（μg/g）；v内标表示每个样品加入内标物的体积（ml）；a内标表示内标物的峰面积；c内标表示内标物的浓度（mg/ml）；a目标表示目标物的峰面积。4.根据权利要求1所述的一种柑橘贮运过程中酸腐病病害监测的方法，其特征在于，该方法将病斑平均直径大于1 cm定义为发病，按照发病程度将果实分为五个病程：i级病程-病斑直径10 mm、ii级病程-病斑直径30 mm、iii级病程-病斑直径50 mm、iv级病程-病斑直径70 mm和v级病程-整果腐烂。5.根据权利要求4所述的一种柑橘贮运过程中酸腐病病害监测的方法，其特征在于，五个病程的判断如下：i级病程：标志物含量3-甲氧基-3-甲基-1-丁烯0.01~0.02%异戊烯醇0.02~0.05%苯乙烯＞0γ-松油烯＞0.02%芳樟醇＞0.02%(+)-顺-柠檬烯-1，2-环氧化物＞4.15
×
10-8
柠檬烯环氧化物＞4.15
×
10-8
4-萜烯醇＞0.91
×
10-3
d-二氢香芹酮＞0.91
×
10-3
(+)-二氢香芹酮＞0.91
×
10-3
z-香芹醇＞0.91
×
10-3
d-香芹酮＞0.91
×
10-3
ii级病程：标志物含量3-甲氧基-3-甲基-1-丁烯0.01~0.02%异戊烯醇0.02~0.07%苯乙烯＞0γ-松油烯＞0.02%芳樟醇＞0.02%(+)-顺-柠檬烯-1，2-环氧化物＞4.15
×
10-8
柠檬烯环氧化物＞4.15
×
10-8
4-萜烯醇＞0.91
×
10-3
d-二氢香芹酮＞0.91
×
10-3
(+)-二氢香芹酮＞0.91
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z-香芹醇＞0.91
×
10-3
d-香芹酮＞0.91
×
10-3
iii级病程：标志物含量3-甲氧基-3-甲基-1-丁烯0.01~0.02%异戊烯醇0.01~0.02%苯乙烯＞0γ-松油烯＞0.02%芳樟醇＞0.02%(+)-顺-柠檬烯-1，2-环氧化物0.0002~0.004%柠檬烯环氧化物＞4.15
×
10-8
4-萜烯醇0.91
×
10-3
~0.03%d-二氢香芹酮0.91
×
10-3
~0.03%(+)-二氢香芹酮＞0.91
×
10-3
z-香芹醇＞0.91
×
10-3
d-香芹酮＞0.91
×
10-3
iv级病程：标志物含量3-甲氧基-3-甲基-1-丁烯0.01~0.02%异戊烯醇0.01~0.02%苯乙烯＞0γ-松油烯＞0.02%芳樟醇＞0.02%(+)-顺-柠檬烯-1，2-环氧化物0.004~0.008%柠檬烯环氧化物＞4.15
×
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4-萜烯醇0.91
×
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~0.03%d-二氢香芹酮＞0.02%(+)-二氢香芹酮＞0.91
×
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z-香芹醇＞0.91
×
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d-香芹酮＞0.91
×
10-3
v级病程：标志物含量3-甲氧基-3-甲基-1-丁烯0.01~0.02%异戊烯醇0.01~0.03%苯乙烯＞0γ-松油烯＞0.02%芳樟醇＞0.02%(+)-顺-柠檬烯-1，2-环氧化物0.001~0.006%柠檬烯环氧化物＞4.15
×
10-8
4-萜烯醇0.91
×
10-3
~0.03%d-二氢香芹酮＞0.02%(+)-二氢香芹酮＞0.91
×
10-3
z-香芹醇＞0.91
×
10-3
d-香芹酮＞0.91
×
10-3
。

技术总结
本发明涉及水果采后保鲜领域，尤其涉及一种柑橘贮运过程中酸腐病病害监测的方法。一种柑橘贮运过程中酸腐病病害监测的方法，该方法通过采集柑橘酸腐病害相关挥发性标志物的信号来预测该批次柑橘果实酸腐病发病情况；所述的柑橘酸腐病害相关挥发性标志物包括以下的一种或多种组合：3-甲氧基-3-甲基-1-丁烯、异戊烯醇、苯乙烯、γ-松油烯、芳樟醇、(+)-顺-柠檬烯-1，2-环氧化物、柠檬烯环氧化物、4-萜烯醇、D-二氢香芹酮、(+)-二氢香芹酮、Z-香芹醇、D-香芹酮。本发明能够以贮运空间中的挥发性成分变化为基础，根据采集的信号预测该批次柑橘果实酸腐病发病情况，为大批量仓储和运输过程中及时发现病果、防止酸腐病害的大范围传播提供技术手段。供技术手段。供技术手段。


技术研发人员：曹锦萍 孙崇德 吴珏 孙翠 张禾 王岳
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：2022.02.11
技术公布日：2022/5/25