多样性抗体产生细胞的细胞库及其用途的制作方法

1.本发明涉及抗体体外自发演化领域，具体涉及可体外演化的多样性抗体产生细胞的细胞库及其用途。


背景技术：

2.获得性免疫系统是人体控制病原体的重要防御机制。这其中，抗体由于其在体内可以针对每个病原体进行针对性的优化并找寻到最具保护效应的分子而显得尤为重要。在病毒或其他微生物感染时，人体经过百万年的进化，发展出了一套在淋巴器官内对b细胞进行高效的分子演化，可以于数天内开发出针对感染源的特异性抗体，帮助个体抵御疾病。近30年，抗体的药用潜力在得到了巨大发展，已远远超越了简单的抗感染免疫。全球市场上销售额最高的前20种药物中，有几近一半是生物类药物。这其中抗体药物又是其中最重要的组成部分。尽管抗体药最早期往往是鼠源的，抗药抗体的严重问题推动整个领域经过长期技术改造发展为现今以人源化抗体为主流的构架。然而从鼠源抗体药物候选改造人员化的过程存在很大的不确定性，又消耗大量资源，人源抗体的筛选平台的探索在近20年是抗体生物制药业的一个重要研究课题。人源抗体噬菌体展示库，人源化小鼠和人外周血单细胞克隆技术都是这个方向的重要成果。
3.然而，由于原代b细胞无法在体外长期培养，更无法进行类似体内的受控基因组突变过程，至本发明前，抗体的高效的分子进化过程只能在生物体内完成，无法在体外有效的仿制。现有的所有人源抗体筛选技术也都以动物载体体内免疫，体外被动筛选为主，由于牵涉免疫原选择，免疫途径优化，动物血清筛选等多个步骤，研发周期长且无法适应快速应对大规模流行病类应用的需求。
4.b细胞定向突变与抗体基因所在的染色体环境有紧密关联但对基因序列本身的容忍性较高，因此，如果将一个外源基因嵌入到抗体基因可变区，该嵌入基因也可以通过b细胞高效的体细胞突变机制来进行分子演化。这些外源基因可以是单域抗体、非人源抗体基因，单链抗体，或药物受体等任何生物活性分子。
5.人源b细胞系ramos是目前唯一一株可以在体外持续稳定的对抗体基因进行突变的细胞系。该细胞系是从成熟b细胞来源的淋巴细胞肿瘤中分离获得，表达重组后的3-23抗体重链基因，产生igm抗体。通过3-4轮自然演化和定向筛选，该细胞被证明可以演化出针对链霉亲和素的特异抗体(nature biotechnology 20,1129-1134(2002))。然而，人体中抗体库多样性是分步完成的：从前-b细胞到成熟b细胞的vdj重排是第二阶段感染中生发中心进行抗体基因体细胞高效突变产生抗病原微生物抗体的基础。ramos细胞仅表达一个重组完全的重链抗体基因，从这个单一的vdj重组源头出发，可针对的抗原种类也将受到极大限制。此外抗体功能与抗体恒定区亚型也有很大关联，因此如何将ramos细胞应用于igg抗体个亚型的筛选也是一个空白。
6.另一方面，由于ramos细胞本身的抗体基因定向突变效率比体内b细胞在感染过程中的天然机理低约100倍，仅利用该细胞本身进行演化的效率低下，不能满足制药研发的需
要。事实上，虽然b细胞在体内可以在7-14天内演化出针对未知抗原的高亲和力抗体，但未经改造的ramos细胞在体外需要3-4个月才有可能得到类似产物。此外，为保持抗体库的多样性，抗体演化过程将不会丢弃任何细胞。这将使的演化抗体库在短时间内超过数十亿级的细胞，而对目的抗原高反应的抗体可能只有有限的数个。本领域不知晓何种技术平台可以高效分离扩增这样的高反应性单克隆细胞。


技术实现要素：

7.本发明首次描述了在体外b细胞中进行抗体优化的系统，完成类似b细胞体内淋巴器官分子演化的过程，给予研究者体外模拟体液免疫反应过程的推演，极大加快功能性人源抗体的开发和利用。
8.本发明第一方面提供一种多样型抗体(ig)产生细胞的细胞库，所述细胞库中的抗体产生细胞的抗体基因包含多种抗体重链可变区的编码序列。
9.在一个或多个实施方案中，所述细胞库建库过程设计如图1。
10.在一个或多个实施方案中，所述细胞库包含来自相同或不同供体的抗体产生细胞。在一个或多个实施方案中，所述细胞库包含来自相同或不同供体的抗体产生细胞。所述抗体产生细胞的抗体序列相同或不同。优选地，所述供体是存在获得性免疫的动物，例如哺乳动物，例如人。
11.在一个或多个实施方案中，所述抗体重链可变区是选自以下的抗体的重链可变区：igm、igg、iga、ige、igd。
12.在一个或多个实施方案中，所述抗体重链可变区选自gene id:3492所示抗体重链基因座中所列的任意重链可变区。
13.在一个或多个实施方案中，所述抗体重链可变区选自人体抗体重链可变区列表(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/？term＝igh％40)中所列的重链可变区。
14.在一个或多个实施方案中，抗体重链可变区的编码序列包括重链v区段(ighv)、重链d区段(ighd)、或重链j区段(ighj)。在一个或多个实施方案中，所述重链v区段(ighv)、重链d区段(ighd)、或重链j区段(ighj)经重组。
15.在一个或多个实施方案中，所述细胞库中的抗体产生细胞的抗体基因包含多种重链v区段。在一个或多个实施方案中，所述细胞库中的抗体产生细胞的抗体基因包含多种重链d区段。在一个或多个实施方案中，所述细胞库中的抗体产生细胞的抗体基因包含多种重链j区段。
16.在一个或多个实施方案中，所述重链v区段选自ighv1、ighv2、ighv3、ighv4、ighv5、ighv6、ighv7、ighvi、ighvii、ighviii、ighviv。
17.在一个或多个实施方案中，所述重链v区段可以选自ighv 4-34(gene id:28395)、ighv 1-3(gene id:28473)、ighv 1-18(gene id:28468)、ighv3-73(gene id:28409)和ighv 1-69(geneid:28461)等任何人体重链v区段。在一个或多个实施方案中，所述重链v区段选自gene id:3492中的任何一个或多个重链v区段。
18.在一个或多个实施方案中，所述重链d区段选自gene id:3492中的任何一个或多个重链d区段。
19.在一个或多个实施方案中，所述重链j区段选自gene id:3492中的任何一个或多
个重链j区段。
20.在一个或多个实施方案中，所述抗体重链可变区包含来自不同供体细胞的抗体重链可变区基因的重链v区段、重链d区段、或重链j区段。所述抗体重链可变区包含来自不同供体细胞的抗体重链可变区基因的重链v区段、重链d区段、或重链j区段的任意组合。在一个或多个实施方案中，所述重链v区段、重链d区段、重链j区段来自两种供体细胞的抗体重链可变区基因，其中，重链v区段、重链d区段来自一种供体细胞的抗体重链可变区基因，重链j区段来自另一种供体细胞的抗体重链可变区基因；或者，重链v区段、重链j区段来自一种供体细胞的抗体重链可变区基因，重链d区段来自另一种供体细胞的抗体重链可变区基因；或者，重链d区段、重链j区段来自一种供体细胞的抗体重链可变区基因，重链v区段来自另一种供体细胞的抗体重链可变区基因。在一个或多个实施方案中，所述重链v区段、重链d区段、重链j区段分别来自三种供体细胞的抗体重链可变区基因。
21.在一个或多个实施方案中，所述抗体重链可变区可以是来自不同供体的同一抗体重链可变区(例如ighv1-69)的不同vdj重排组合。
22.在一个或多个实施方案中，所述多种抗体的重链可变区的编码序列中的部分或全部可通过同源重组或crispr技术引入所述抗体产生细胞。
23.在一个或多个实施方案中，所述细胞库中的抗体产生细胞的抗体基因还包含一种或多种抗体的重链恒定区、轻链恒定区和轻链可变区的编码序列。
24.在一个或多个实施方案中，所述重链恒定区、轻链恒定区和/或轻链可变区的编码序列通过同源重组或crispr技术引入所述抗体产生细胞。
25.在一个或多个实施方案中，所述一种或多种抗体的重链恒定区、轻链恒定区和轻链可变区是选自以下的一种或多种抗体的重链恒定区、轻链恒定区和轻链可变区：igm、igg、iga、ige、igd。
26.在一个或多个实施方案中，所述抗体产生细胞是分离的哺乳动物抗体产生细胞或哺乳动物细胞系的分离的抗体产生细胞。在一个或多个实施方案中，所述分离的哺乳动物抗体产生细胞是能组成性表达抗体的抗体产生细胞。优选地，所述分离的哺乳动物抗体产生细胞是人源b细胞系细胞。
27.在一个或多个实施方案中，哺乳动物细胞系的分离的抗体产生细胞是不组成性表达抗体，但是已经被基因改造以表达抗体的细胞。在一个或多个实施方案中，所述基因改造通过同源重组或crispr技术将抗体的编码序列引入所述抗体产生细胞。
28.在一个或多个实施方案中，所述抗体产生细胞是杂交瘤。
29.在一个或多个实施方案中，所述抗体产生细胞是人b淋巴细胞瘤细胞，ramos细胞。
30.在一个或多个实施方案中，所述抗体产生细胞分泌抗体。
31.在一个或多个实施方案中，所述抗体产生细胞在其细胞表面表达抗体。
32.在一个或多个实施方案中，所述抗体产生细胞经工程改造使得spt5的表达降低。
33.在一个或多个实施方案中，所述抗体产生细胞表达逆转录病毒蛋白或其具有转录因子结合功能的片段。优选地，所述逆转录病毒蛋白是hiv tat蛋白。在一个或多个实施方案中，所述片段的长度至少60个氨基酸，优选至少48个氨基酸。
34.在一个或多个实施方案中，所述抗体产生细胞表达激活诱导脱氨酶，从而诱导抗体基因可变区的体细胞超突变增加。
35.在一个或多个实施方案中，所述抗体产生细胞的抗体基因的重链可变区编码序列的体细胞超突变增加。
36.在一个或多个实施方案中，所述抗体产生细胞库的抗体基因的重链可变区编码序列的多样性随着体细胞超突变增加而增加。
37.本文第二方面提供一种多样型抗体(ig)产生细胞的细胞库，所述细胞库的抗体产生细胞的抗体基因包含多种重链v区段。
38.在一个或多个实施方案中，所述细胞库建库过程设计如图1。
39.在一个或多个实施方案中，所述细胞库包含来自相同或不同供体的抗体产生细胞。在一个或多个实施方案中，所述细胞库包含来自相同或不同供体的抗体产生细胞的抗体序列。优选地，所述供体是存在获得性免疫的动物，例如哺乳动物，例如人。
40.在一个或多个实施方案中，所述细胞库的抗体产生细胞的抗体基因还包含多种重链d区段和/或多种重链j区段。在一个或多个实施方案中，所述重链v区段选自gene id:3492所示抗体重链基因座中所列的任意重链v区段。在一个或多个实施方案中，所述重链d区段选自gene id:3492所示抗体重链基因座中所列的任意重链d区段。在一个或多个实施方案中，所述重链j区段选自gene id:3492所示抗体重链基因座中所列的任意重链j区段。
41.在一个或多个实施方案中，所述重链v区段、重链d区段、重链j区段选自人体抗体重链可变区列表https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/？term＝igh％40中所列的重链v区段、重链d区段、重链j区段。
42.在一个或多个实施方案中，所述重链v区段选自ighv1、ighv2、ighv3、ighv4、ighv5、ighv6、ighv7、ighvi、ighvii、ighviii、ighviv。
43.在一个或多个实施方案中，所述重链v区段可以选自ighv 4-34(gene id:28395)、ighv 1-3(gene id:28473)、ighv 1-18(gene id:28468)、ighv3-73(gene id:28409)和ighv 1-69(geneid:28461)等任何人体重链v区段。
44.在一个或多个实施方案中，所述重链v区段选自gene id:3492中的任何一个或多个重链v区段。
45.在一个或多个实施方案中，所述重链d区段选自gene id:3492中的任何一个或多个重链d区段。
46.在一个或多个实施方案中，所述重链j区段选自gene id:3492中的任何一个或多个重链j区段。
47.在一个或多个实施方案中，所述重链v区段、重链d区段、重链j区段来自不同供体细胞的抗体重链可变区基因。在一个或多个实施方案中，所述重链v区段、重链d区段、重链j区段来自两种供体细胞的抗体重链可变区基因，其中，重链v区段、重链d区段来自一种供体细胞的抗体重链可变区基因，重链j区段来自另一种供体细胞的抗体重链可变区基因；或者，重链v区段、重链j区段来自一种供体细胞的抗体重链可变区基因，重链d区段来自另一种供体细胞的抗体重链可变区基因；或者，重链d区段、重链j区段来自一种供体细胞的抗体重链可变区基因，重链v区段来自另一种供体细胞的抗体重链可变区基因。在一个或多个实施方案中，所述重链v区段、重链d区段、重链j区段分别来自三种供体细胞的抗体重链可变区基因。。
48.在一个或多个实施方案中，所述多种重链v区段、多种重链d区段、多种重链j区段
中的部分或全部通过同源重组或crispr技术引入所述抗体产生细胞。
49.在一个或多个实施方案中，所述细胞库中的抗体产生细胞的抗体基因还包含一种或多种抗体的重链恒定区、轻链恒定区和轻链可变区的编码序列。
50.在一个或多个实施方案中，所述重链恒定区、轻链恒定区和/或轻链可变区的编码序列通过同源重组或crispr技术引入所述抗体产生细胞。
51.在一个或多个实施方案中，所述一种或多种抗体的重链恒定区、轻链恒定区和轻链可变区是选自以下的一种或多种抗体的重链恒定区、轻链恒定区和轻链可变区：igm、igg、iga、ige、igd。
52.在一个或多个实施方案中，所述抗体产生细胞是分离的哺乳动物抗体产生细胞或哺乳动物细胞系的分离的抗体产生细胞。
53.在一个或多个实施方案中，哺乳动物细胞系的分离的抗体产生细胞是不组成性表达抗体，但是已经被基因改造以表达抗体的细胞。
54.在一个或多个实施方案中，所述基因改造通过同源重组或crispr技术将抗体的编码序列引入所述抗体产生细胞。
55.在一个或多个实施方案中，所述抗体产生细胞是杂交瘤。
56.在一个或多个实施方案中，所述抗体产生细胞是人b淋巴细胞瘤细胞，ramos细胞。
57.在一个或多个实施方案中，所述抗体产生细胞分泌抗体。
58.在一个或多个实施方案中，所述抗体产生细胞在其细胞表面表达抗体。
59.在一个或多个实施方案中，所述抗体产生细胞经工程改造使得spt5的表达降低。
60.在一个或多个实施方案中，所述抗体产生细胞表达逆转录病毒蛋白或其具有转录因子结合功能的片段。优选地，所述逆转录病毒蛋白是hiv tat蛋白。在一个或多个实施方案中，所述片段的长度至少60个氨基酸，优选至少48个氨基酸。
61.在一个或多个实施方案中，所述抗体产生细胞表达激活诱导脱氨酶，从而诱导抗体基因可变区的体细胞超突变增加。
62.在一个或多个实施方案中，所述抗体产生细胞的抗体基因的重链可变区编码序列的体细胞超突变增加。
63.在一个或多个实施方案中，所述抗体产生细胞库的抗体基因的重链可变区编码序列多样性随着的体细胞超突变增加而增加。
64.在一个或多个实施方案中，所述抗体产生细胞库的抗体基因的重链可变区编码序列多样性随着混合多个细胞库的方式而增加。
65.本发明还提供一种扩展抗体产生细胞的细胞库多样性的方法或制备多样型抗体产生细胞的细胞库的方法，
66.(1a)通过基因改造在细胞库的抗体产生细胞中引入多种抗体重链可变区的编码序列，或
67.(1b)通过基因改造在细胞库的抗体产生细胞中引入多种重链可变区编码序列的区段，优选地，多种重链可变区编码序列的区段选自以下的一项或多项：多种重链v区段、多种重链d区段和多种重链j区段，和
68.(2)使抗体产生细胞与增加抗体基因座体细胞超突变的试剂接触，和
69.任选的(3)通过基因改造在抗体产生细胞中引入多种抗体重链恒定区、多种抗体
轻链可变区和/或多种抗体轻链恒定区的编码序列。
70.在一个或多个实施方案中，步骤(1a)包括：使细胞与含有所述多种抗体重链可变区编码序列的同源重组载体接触，或使细胞与含有针对所述多种抗体重链可变区编码序列的引导rna和编码cas蛋白的核酸构建物接触。优选地，使细胞与含有所述多种抗体重链可变区上下游约1-1.5kb碱基内的与对应pam序列相匹配的引导rna和编码cas蛋白的核酸构建物接触。
71.在一个或多个实施方案中，步骤(1b)包括：使细胞与含有所述多种重链可变区编码序列的区段的同源重组载体接触，或使细胞与含有所述多种重链可变区编码序列的区段的引导rna和编码cas蛋白的核酸构建物接触。
72.在一个或多个实施方案中，步骤(2)的试剂是具有选自以下的一种或多种序列的核酸分子：(a)表达逆转录病毒蛋白或其具有转录因子结合功能的片段的核酸序列，所述逆转录病毒蛋白优选是hiv tat蛋白，(b)降低细胞的spt5表达的rnai核酸序列，优选sirna或shrna，(c)表达激活诱导脱氨酶或其具有激活诱导脱氨功能的片段的核酸序列。
73.在一个或多个实施方案中，步骤(3)包括：使细胞与含有所述一种或多种其他类型抗体的恒定区编码序列的同源重组载体接触，或使细胞与含有针对所述多种抗体重链恒定区、多种抗体轻链可变区和/或多种抗体轻链恒定区的编码序列的引导rna和编码cas蛋白的核酸构建物接触。
74.在一个或多个实施方案中，所述多样型抗体产生细胞的细胞库如本文第一方面所述。
75.本发明还提供一种筛选生产具有抗原特异性活性的抗体的细胞的方法，包括
76.(1)在使细胞生产抗体的条件下培养本文所述的多样型抗体产生细胞的细胞库，和
77.(2)根据抗体的抗原特异性活性利用包含细胞克隆筛选技术、流式细胞仪或光电微流控技术的方法选择生产抗体的细胞。
78.在一个或多个实施方案中，使细胞生产抗体的条件包括使一种或多种抗原与细胞接触。
79.在一个或多个实施方案中，细胞克隆筛选技术是clonepix 2系统。
80.本发明还提供一种体外进化筛选生产具有抗原特异性活性的抗体的细胞的方法，包括
81.(1a)通过基因改造在细胞库的抗体产生细胞中引入多种抗体重链可变区的编码序列，或
82.(1b)通过基因改造在细胞库的抗体产生细胞中引入多种重链可变区编码序列的区段，优选地，多种重链可变区编码序列的区段选自以下的一项或多项：多种重链v区段、多种重链d区段和多种重链j区段，和
83.(2)使抗体产生细胞与增加抗体基因座体细胞超突变的一种或多种试剂接触，和
84.任选的(3)通过基因改造在抗体产生细胞中引入多种抗体重链恒定区、多种抗体轻链可变区和/或多种抗体轻链恒定区的编码序列，
85.(4)在使细胞生产抗体的条件下培养多样型抗体产生细胞的细胞库，
86.(5)根据抗体的抗原特异性活性利用包含细胞克隆筛选技术、流式细胞仪或光电
微流控技术的方法选择生产抗体的细胞。
87.在一个或多个实施方案中，步骤(1a)包括：使细胞与含有所述多种抗体重链可变区编码序列的同源重组载体接触，或使细胞与含有针对所述多种抗体重链可变区编码序列的引导rna和编码cas蛋白的核酸构建物接触。优选地，使细胞与含有所述多种抗体重链可变区上下游1kb内的引导rna和编码cas蛋白的核酸构建物接触。
88.在一个或多个实施方案中，步骤(1b)包括：使细胞与含有所述多种重链可变区编码序列的区段的同源重组载体接触，或使细胞与含有所述多种重链可变区编码序列的区段的引导rna和编码cas蛋白的核酸构建物接触。
89.在一个或多个实施方案中，步骤(2)的试剂是具有选自以下的一种或多种序列的核酸分子：(a)表达逆转录病毒蛋白或其具有转录因子结合功能的片段的核酸序列，所述逆转录病毒蛋白优选是hiv tat蛋白，(b)降低细胞的spt5表达的rnai核酸序列，优选sirna或shrna，(c)表达激活诱导脱氨酶或其具有激活诱导脱氨功能的片段的核酸序列，
90.在一个或多个实施方案中，所述多样型抗体产生细胞的细胞库如本文第一方面所述。
91.在一个或多个实施方案中，步骤(3)包括：使细胞与含有所述一种或多种其他类型抗体的恒定区编码序列的同源重组载体接触，或使细胞与含有针对所述多种抗体重链恒定区、多种抗体轻链可变区和/或多种抗体轻链恒定区的编码序列的引导rna和编码cas蛋白的核酸构建物接触。
92.在一个或多个实施方案中，使细胞生产抗体的条件包括使一种或多种抗原与细胞接触。
93.在一个或多个实施方案中，步骤(4)还包括诱导抗体基因体细胞超突变，从而扩展抗体产生细胞的细胞库的多样性。在一个或多个实施方案中，所述诱导抗体基因体细胞超突变包括(4a)使抗体产生细胞与增加抗体基因座体细胞超突变的试剂接触，和任选的(4b)通过基因改造在抗体产生细胞中引入多种抗体重链恒定区、多种抗体轻链可变区和/或多种抗体轻链恒定区的编码序列。
94.在一个或多个实施方案中，细胞克隆筛选技术是clonepix 2系统。
95.在一个或多个实施方案中，所述方法还包括在步骤(5)后再次进行一次或多次步骤(4)和(5)，其中每次步骤(4)中的使细胞生产抗体的条件相同或不同。在一个或多个实施方案中，不同的使细胞生产抗体的条件包括使不同的抗原与细胞接触。在一个或多个实施方案中，每次步骤(4)中诱导抗体基因体细胞超突变(使细胞库多样性扩展)的条件相同或不同。例如使抗体产生细胞与相同或不同的增加抗体基因座体细胞超突变的试剂接触。在一个或多个实施方案中，每次步骤(5)中所述选择生产抗体的细胞的条件可以相同或不同。
96.本发明还提供使用本文所述的筛选生产具有抗原特异性活性的抗体的细胞的方法筛选得到的细胞。
97.本发明还提供一种生产抗体的方法，包括在使细胞生产抗体的条件下培养本发明所述的筛选生产具有抗原特异性活性的抗体的细胞的方法筛选得到的细胞并收集该细胞生产的抗体。
98.本发明还提供一种生产抗体的方法，包括
99.(1a)通过基因改造在细胞库的抗体产生细胞中引入多种抗体重链可变区的编码
序列，或
100.(1b)通过基因改造在细胞库的抗体产生细胞中引入多种重链可变区编码序列的区段，优选地，多种重链可变区编码序列的区段选自以下的一项或多项：多种重链v区段、多种重链d区段和多种重链j区段，和
101.(2)使抗体产生细胞与增加抗体基因座体细胞超突变的一种或多种试剂接触，和
102.任选的(3)通过基因改造在抗体产生细胞中引入多种抗体重链恒定区、多种抗体轻链可变区和/或多种抗体轻链恒定区的编码序列，
103.(4)在使细胞生产抗体的条件下培养多样型抗体产生细胞的细胞库，
104.(5)根据抗体的抗原特异性活性利用包含细胞克隆筛选技术、流式细胞仪或光电微流控技术的方法从细胞库中选择生产所述抗体的细胞，
105.(6)培养得到的细胞，
106.任选的(7)收集细胞生产的抗体。
107.在一个或多个实施方案中，步骤(1a)包括：使细胞与含有所述多种抗体重链可变区编码序列的同源重组载体接触，或使细胞与含有针对所述多种抗体重链可变区编码序列的引导rna和编码cas蛋白的核酸构建物接触。优选地，使细胞与含有所述多种抗体重链可变区上下游1kb内的引导rna和编码cas蛋白的核酸构建物接触。
108.在一个或多个实施方案中，步骤(1b)包括：使细胞与含有所述多种重链可变区编码序列的区段的同源重组载体接触，或使细胞与含有所述多种重链可变区编码序列的区段的引导rna和编码cas蛋白的核酸构建物接触。
109.在一个或多个实施方案中，步骤(2)的试剂是具有选自以下的一种或多种序列的核酸分子：(a)表达逆转录病毒蛋白或其具有转录因子结合功能的片段的核酸序列，所述逆转录病毒蛋白优选是hiv tat蛋白，(b)降低细胞的spt5表达的rnai核酸序列，优选sirna或shrna，(c)表达激活诱导脱氨酶或其具有激活诱导脱氨功能的片段的核酸序列，
110.在一个或多个实施方案中，所述多样型抗体产生细胞的细胞库如本文第一方面所述。
111.在一个或多个实施方案中，步骤(3)包括：使细胞与含有所述一种或多种其他类型抗体的恒定区编码序列的同源重组载体接触，或使细胞与含有针对所述多种抗体重链恒定区、多种抗体轻链可变区和/或多种抗体轻链恒定区的编码序列的引导rna和编码cas蛋白的核酸构建物接触。
112.在一个或多个实施方案中，使细胞生产抗体的条件包括使一种或多种抗原与细胞接触。
113.在一个或多个实施方案中，步骤(4)还包括诱导抗体基因体细胞超突变，从而扩展抗体产生细胞的细胞库的多样性。在一个或多个实施方案中，所述诱导抗体基因体细胞超突变包括(4a)使抗体产生细胞与增加抗体基因座体细胞超突变的试剂接触，和任选的(4b)通过基因改造在抗体产生细胞中引入多种抗体重链恒定区、多种抗体轻链可变区和/或多种抗体轻链恒定区的编码序列。
114.在一个或多个实施方案中，细胞克隆筛选技术是clonepix 2系统。
115.在一个或多个实施方案中，所述方法还包括在步骤(5)后再次进行一次或多次步骤(4)和(5)，其中每次步骤(4)中的使细胞生产抗体的条件相同或不同。在一个或多个实施
方案中，不同的使细胞生产抗体的条件包括使不同的抗原与细胞接触。在一个或多个实施方案中，每次步骤(4)中使细胞库多样性扩展的条件相同或不同。例如使抗体产生细胞与相同或不同的增加抗体基因座体细胞超突变的试剂接触。在一个或多个实施方案中，每次步骤(5)中所述选择生产抗体的细胞的条件可以相同或不同。
116.本发明的优点：
117.(1)通过引进us20180179516a1技术，可提高ramos细胞抗体基因定点突变率超过20倍，接近体内生发中心水平，为体外高效演化抗体分子提供了技术基础；
118.(2)初始抗体库可以分多次预先高效演化积累出抗体库1到n，以保证每个库的演化独立性。这n个抗体库在筛选抗原特异性抗体时可被分批或合并筛选。初始克隆可以再经过第二轮演化，提高亲和力并进行抗体亚型转化。这种方式，在流行性疾病如类似sars-cov或是流感爆发时，可以在最短的时间内提供治疗性抗体候选。
119.(3)由于该方法演化上的可持续性，本方法还非常适合于寻找极少见的功能性抗体。
附图说明
120.图1显示经工程改造的获自不同供体的多样型抗体产生细胞的细胞库。
121.图2显示利用本发明所述的多样型抗体产生细胞的细胞库进行组合并体外抗体演化过程的一个实施方案。
具体实施方式
122.应理解，在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。本文虽以人基因组为例描述具体实施方式，本领域技术人员知晓这些实施方式可扩展至其他存在获得性免疫的动物供体。
123.本文所述“演化”或“抗体演化”指含有抗体基因的抗体产生细胞例如人b淋巴细胞瘤细胞(ramos细胞)在遭遇抗原后的成熟过程。抗体基因的重链基因座包括v区段、d区段、j区段和c区段，其中重链可变区的基因座包括v区段，d区段和j区段。在b细胞发育过程中，dna水平的重组事件v、d和j区段重排。不同的v、d和j区段的重组提供了广泛的抗原识别。本发明通过将多种重链基因座或其区段引入细胞，获得了具有不同重链可变区编码序列的细胞库。
124.本文所述“抗体产生细胞”是分离的哺乳动物抗体产生细胞。这些细胞不仅能组成性表达抗体，并且还可用来被基因改造，在抗体基因原位表达各种外源性抗体。所述分离的哺乳动物抗体产生细胞可以是人源b细胞系细胞。本文所述“抗体产生细胞”还可以是哺乳动物细胞系的分离的抗体产生细胞。这种细胞本身不组成性表达抗体，但是已经被基因改造以表达抗体。所述基因改造可以通过本领域已知的任何方法进行，例如通过同源重组或crispr技术将抗体的编码序列引入所述抗体产生细胞。在一个或多个实施方案中，所述抗体产生细胞是杂交瘤，例如人b淋巴细胞瘤细胞(如ramos细胞)。抗体产生细胞分泌抗体，并优选在其细胞表面表达抗体。
125.因此，本发明提供一种制备多样型抗体产生细胞的细胞库的方法，包括通过基因
改造在细胞库的抗体产生细胞中引入多种抗体重链可变区的编码序列，或通过基因改造在细胞库的抗体产生细胞中引入多种重链可变区编码序列的区段，例如多种重链v区段、多种重链d区段和/或多种重链j区段。所述抗体重链可变区、重链v区段、重链d区段和重链j区段可为本领域已知的任何相应序列，示例性的列表可如https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/？term＝igh％40所示。具体地，在所述细胞库的所有细胞中，所述重链v区段可选自gene id:3492中所列的任何一个或多个重链v区段；所述重链d区段可选自gene id:3492中所列的任何一个或多个重链d区段；所述重链j区段可选自gene id:3492中所列的任何一个或多个重链j区段。在所述细胞库的各细胞中，抗体重链可变区可具有上述任一重链v区段、任一重链d区段和任一重链j区段的任意组合。本领域技术人员知晓常用的基因改造方法，例如基因重组或通过crispr技术。若使用基因重组，可使细胞与含有所述多种抗体重链可变区编码序列或其区段的同源重组载体接触。若使用crispr，可使细胞与含有针对所述多种抗体重链可变区编码序列或其区段的引导rna和编码cas蛋白的核酸构建物接触。例如使细胞与含有所述多种抗体重链可变区或其区段的上下游约1-1.5kb碱基内的与相应pam序列相符合的引导rna和编码cas蛋白的核酸构建物接触。
126.将多种重链基因座或其区段引入细胞可以通过将细胞中的原始序列替换为需要的重链可变区序列来实现。定点替代抗体产生细胞(例如ramos细胞)重链可变区的实验方法可以将3-23(gene id:28442)抗体可变区基因置换成诸如人体抗体可变区4-34序列(gene id:28395)。本发明通过构建多样化的抗体产生细胞(例如ramos)细胞库，建立一系列抗体产生细胞系，其分别带有不同的人体抗体重链可变区，例如但不仅限于人体抗体可变区1-3(gene id:28473)，1-18(gene id:28468)，3-73(gene id:28409)，和1-69(geneid:28461)等。完整人体抗体重链可变区列表可见(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/？term＝igh％40)。由于vdj重组时对抗体对抗原结合区的重要影响，同一抗体可变区(例如1-69)的不同vdj重排组合可由供体细胞中的多样性来获得。同时，发明人发现，ramos细胞抗体基因恒定区保留了所有抗体亚型基因，采用crispr定点剪切技术，可以方便的诱导该细胞从igm向其他抗体亚型种类的转换。
127.本发明的多样型抗体产生细胞的细胞库可以进一步通过体细胞突变产生高亲和力抗体。通常，抗体演化过程涉及“体细胞超突变”，可以使重链可变区的各区段获得多样性。抗体产生细胞例如人b淋巴细胞瘤细胞遭遇抗原后发生快速增殖和成熟，这一过程中抗体基因的重链v片段(igvh)发生体细胞超突变(shm)，其突变频率是其他基因自发突变率的百倍甚至千倍以上。体细胞超突变使细胞表达多样性功能抗体。经演化、筛选，存活下来的是具有免疫功能的，分泌功能性抗体的b细胞，可以产生针对抗原的特异性抗体。
128.ramos细胞是从一位男性burkitt's淋巴瘤患者的肿瘤中分离出的一株ebv病毒阴性的b细胞株。虽然无论是人源，动物源的原代b细胞还是绝大多数b细胞系在体外都无法进行激活诱导脱氨酶(aid)介导的体细胞突变，研究表明人源ramos细胞是目前已知的唯一一个可以进行aid介导的体细胞突变的哺乳动物源b细胞系。该细胞表达的igm抗体从而可以通过抗原直接标记的方法筛选。
129.尽管如此，经实验检测，天然分离得到的ramos细胞的突变速度仅为每代～2x10-5
bp，即每代仅0.7％细胞发生突变。而b细胞在体内免疫反应生发中心里的体细胞突变速度可以达到每代10-3
bp，即每代细胞分裂35％的细胞会发生至少一个基因突变现象(包括点突
变，插入，缺失和替代等)。作为一个简化模型，假设：i)一个高亲和力抗体需要至少3个突变；ii)并且在所有包含3个或以上突变的抗体基因中，结合抗原的抗体产生的概率为千分之一，计算表明，在1000个细胞组成的初始群体中，10代以内产生抗原特异性抗体的几率在天然ramos细胞系中为每百万细胞0.04个抗体基因克隆，但在生发中心中为每百万细胞756个抗原结合抗体基因。如果所需抗体比较复杂，需要至少5个突变才可以产生抗原结合，在其他条件不变的情况下，生发中心b细胞可以在10代内约100万细胞中产生》200抗原结合抗体基因但天然的ramos细胞需要生长30代，在上万亿细胞中产生大约同等数量的抗体基因。
130.为了解决这个问题，本发明的制备多样型抗体产生细胞的细胞库的方法还包括使抗体产生细胞与增加抗体基因座体细胞超突变的试剂接触的步骤。所述试剂能降低细胞的spt5表达，从而显著增加抗体产生细胞在抗体演化中的体细胞超突变，能够在相同的时间获得更多种不同的抗体，提高了抗体演化速度。示例性地，所述试剂是具有选自以下的一种或多种序列的核酸分子：(a)表达逆转录病毒蛋白的核酸序列，所述逆转录病毒蛋白优选是hiv tat蛋白，(b)降低细胞的spt5表达的rnai核酸序列，优选sirna或shrna，(c)表达激活诱导脱氨酶的核酸序列。上述方法可提高ramos细胞抗体基因定点突变率超过20倍。在前述模型中，即便仅提高ramos突变率16倍，10代以内产生抗原特异性抗体的几率在优化后的ramos细胞系中为每百万细胞94个抗体基因克隆(3个突变)，或是14代1600万细胞中即可产生》200抗原结合抗体基因。参见例如，us20180179516a1，该文献通过引用全文纳入本文。
131.此外，本发明的制备多样型抗体产生细胞的细胞库的方法还可包括通过基因改造在抗体产生细胞中引入多种抗体重链恒定区、多种抗体轻链可变区和/或多种抗体轻链恒定区的编码序列的步骤。其中基因改造的方法本领域已知或如本文他处所述。例如，基因改造的方法可包括：使细胞与含有所述一种或多种其他类型抗体的恒定区编码序列的同源重组载体接触，或使细胞与含有针对所述多种抗体重链恒定区、多种抗体轻链可变区和/或多种抗体轻链恒定区的编码序列的引导rna和编码cas蛋白的核酸构建物接触。
132.因此，本发明提供一种制备多样型抗体产生细胞的细胞库的方法，包括(1a)通过基因改造在细胞库的抗体产生细胞中引入多种抗体重链可变区的编码序列，或(1b)通过基因改造在细胞库的抗体产生细胞中引入多种重链可变区编码序列的区段，例如多种重链v区段、多种重链d区段和/或多种重链j区段，和(2)使抗体产生细胞与增加抗体基因座体细胞超突变的试剂接触。所述方法还可包括(3)通过基因改造在抗体产生细胞中引入多种抗体重链恒定区、多种抗体轻链可变区和/或多种抗体轻链恒定区的编码序列。在具体实施方式中，本发明包括以ramos细胞为基础构建多样型抗体产生细胞的细胞库的方法。抗体多样性由前b细胞中抗体基因重组和成熟b细胞中的体细胞突变共同构成。虽然天然ramos细胞抗体重链基因仅是4-34，基因重组技术可以将任何其他基因组涵盖的重链抗体基因带入ramos细胞中。通过以下方法可以建立任何基因组抗体序列为起始的ramos细胞，作为后续抗体演化筛选过程初始起点。使用的基因原位knock-in方法多样，下述实验方法仅为其中一种：
133.1、克隆ramos重链抗体基因重链抗体可变区上下游同源臂序列；2、将用于筛选的分子标记物以分子生物学技术插入到上、下游序列之间，建立传递质粒；3、将人源抗体基因的重链可变区编码基因以分子生物学技术插入到上、下游序列之间，建立目标质粒；4、将步骤2获得的质粒转入ramos细胞；5、以分子标记物筛选稳定重组到基因组上的细胞株；6、检
测分子标记物成功重组到ramos细胞人体重链可变区位点上；7、将步骤3获得的质粒转入经过步骤6鉴定的成功重组的ramos细胞；8、在步骤7细胞群中筛选细胞表面表达igm的细胞克隆；9、经确认成功原位重组的细胞克隆即为新的带有人源抗体重链基因的新的ramos衍生细胞系；10、重复实验步骤1-步骤9，可以建立在抗体重链基因位点上带有任何基因组编码的人源重链抗体基因的ramos衍生系。重复本实验操作，可以建立一系列ramos细胞系，分别带有各种人体抗体重链可变区。按需要，将一定数量的2个或超过2个含不同的初始重组抗体基因的不同ramos衍生细胞系混合即建立了以ramos细胞为基础的多样化重组抗体重链细胞库。
134.本发明中，ramos细胞抗体重链基因自发体细胞突变产生抗原特异性抗体。利用ramos细胞可以从初始对抗原无亲和力的抗体基因经过一系列点突变而演化出对该抗原高亲和力的抗体基因，表明该细胞系有作为人源抗体体外演化的细胞分子生物学基础。示例性实验过程如下：1、取ramos细胞扩增、接种、培养；2、使标记的抗原与细胞接触；3、使用流式细胞仪分选经标记的细胞亚群；4、培养分选的细胞并重复步骤2和3；5、用标记的抗原与细胞接触；6、分选回收所有标记信号高于母细胞株的细胞群；7、对分选回的细胞进行单细胞测序，选取主要的抗体基因进行重组表达，确认抗原特异性和亲和力。
135.本发明还包括通过降低细胞的spt5表达来增加体细胞超突变，提高ramos细胞抗体基因多样性演化速度、抗原特异性抗体产生速度与突变率。示例性的过程如下，使用电穿孔将外源基因或shrna通过慢病毒介导的转导递送到ramos细胞中。对于外源基因的构建体，使用pcdh载体，并且通过将外源基因的pcr产物插入载体中的多个克隆位点而将基因克隆到pcdh载体中。对于外源表达tat家族成员及其变体的情况，使用慢病毒颗粒将编码相应蛋白质的基因片段引入ramos报道细胞。pcdh载体中的egfp用作成功递送目的外源基因的指示。
136.在建立多样型抗体产生细胞的细胞库并任选进行体细胞超突变增强后，抗体产生细胞的细胞库可用于高效自发体细胞突变筛选抗原特异性抗体。因此，本发明还提供筛选生产具有抗原特异性活性的抗体的细胞的方法，以及生产抗体的方法。
137.示例性的体外筛选生产具有抗原特异性活性的抗体的细胞的方法如图2所示。具体地，筛选生产具有抗原特异性活性的抗体的细胞的方法包括(1)在使细胞生产抗体的条件下培养本文所述的多样型抗体产生细胞的细胞库，和(2)根据抗体的抗原特异性活性选择生产抗体的细胞。常用的选择生产抗体的细胞方法本领域周知，例如，细胞克隆筛选技术、流式细胞仪或光电微流控技术。需要注意的是，所述筛选方法还包括在步骤(2)后再次进行一次或多次步骤(1)和(2)，其中每次步骤(1)中的使细胞生产抗体的条件相同或不同。不同的使细胞生产抗体的条件包括使不同的抗原与细胞接触。本发明包括使用所述筛选方法筛选得到的细胞。示例性的实验过程包括：1、建立由n(n≥2)个不同的基因组抗体重链重组ramos衍生系组成的多样型细胞库；2、如本文所述对该库进行体细胞超突变增强；3、用标记的抗原与细胞接触；4、分选回收所有标记信号高于母细胞株的细胞群；5、对步骤4分选的细胞取样进行单细胞测序，选取主要的抗体基因进行重组表达，确认抗原特异性和亲和力；6、如有必要，可以对步骤4回收获得的初步抗体亚群进行多次体细胞突变演化(步骤3-4)；7、以比步骤3中所用的标记的抗原浓度低10倍的条件对步骤6获得的细胞进行抗原处理；8、分选回收信号最高的2％的细胞亚群，作为候选的产生高亲和力抗体的细胞；9、对步骤8分
选回的细胞取样进行单细胞测序，选取主要抗体基因进行重组表达，进一步确认抗原特异性和亲和力。
138.本文中，生产抗体的方法包括在使细胞生产抗体的条件下培养本发明所述的筛选方法得到的细胞并收集该细胞生产的抗体。具体包括(1)在使细胞生产抗体的条件下培养本文所述的多样型抗体产生细胞的细胞库，(2)根据抗体的抗原特异性活性选择生产抗体的细胞，(3)培养得到的细胞，和任选的(4)收集细胞生产的抗体。常用的选择生产抗体的细胞方法本领域周知，例如，细胞克隆筛选技术、流式细胞仪或光电微流控技术。此外，本领域知晓检测和/或收集由细胞生产的抗体的过程，包括免疫沉淀、elisa，荧光染色等方法。需要注意的是，所述筛选方法还包括在步骤(3)后再次进行一次或多次步骤(2)和(3)，其中每次步骤(2)中的使细胞生产抗体的条件可相同或不同。本发明包括使用所述方法生产的抗体。
139.本发明通过参考以下实验实施例进一步详细地进行描述。这些实施例仅出于说明性的目的提供，并不意欲为限制性的，除非另有规定。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导变得显而易见的任何和全部的变化。实施例中所用的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域常规的方法和试剂。
140.实施例
141.实施例1，以ramos细胞为基础的多样化重组抗体重链细胞库的构建
142.抗体多样性由前b细胞中抗体基因重组和成熟b细胞中的体细胞突变共同构成。百万年进化过程在基因组中建立了一个可对不同抗原进行应答的基础抗体库，这些基础抗体库可以进一步通过体细胞突变产生高亲和力抗体。虽然天然ramos细胞抗体重链基因仅是4-34，基因重组技术可以将任何其他基因组涵盖的重链抗体基因带入ramos细胞中。以下是以1-69基因为例的原位knock-in实验，类似方法可以用来建立任何基因组抗体序列为起始的ramos细胞，作为后续抗体演化筛选过程初始起点。使用的基因原位knock-in方法多样，下述实验方法仅为其中一种。
143.实验过程：
144.1、克隆ramos重链抗体基因转录起始位点上游约2kb和重链抗体可变区下游增强子中约2kb的基因序列；
145.2、将egfp或其他可用于筛选的分子标记物通过同源重组插入到上、下游序列之间，建立传递质粒；
146.3、将人源1-69抗体基因通过同源重组插入到上、下游序列之间，建立目标质粒；
147.4、将步骤2获得的质粒转入天然分离获得的ramos细胞；
148.5、以分子标记物筛选稳定重组到基因组上的细胞株；
149.6、以southern-blot确认分子标记物成功重组到ramos细胞人体重链可变区位点上；
150.7、将步骤3获得的质粒转入经过步骤6鉴定的成功重组的ramos细胞；
151.8、在步骤7细胞群中筛选细胞表面表达igm的细胞克隆；
152.9、以southern-blot确认成功原位重组，该细胞克隆即为新的带有人源1-69抗体重链基因的新的ramos衍生细胞系；
153.10、重复实验步骤1-步骤9，可以建立在抗体重链基因位点上带有任何基因组编码
的人源重链抗体基因的ramos衍生系。
154.重复本实验操作，可以建立的一系列ramos细胞系将分别带有(但不仅限于)人体抗体可变区1-3(gene id:28473)，1-18(gene id:28468)，3-73(gene id:28409)等等(完整人体抗体重链可变区列表可见(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/？term＝igh％40))。按需要，将一定数量的2个或超过2个含不同的初始重组抗体基因的不同ramos衍生细胞系混合即建立了以ramos细胞为基础的多样化重组抗体重链细胞库。
155.实施例2，天然ramos细胞抗体重链基因自发体细胞突变产生抗原特异性抗体(具体实验方法试剂描述类似于(nature biotechnology 20,1129-1134(2002))：
156.本实施例以链霉亲和素模式抗原为例，利用ramos细胞成功的从初始对该模式抗原无亲和力的抗体基因经过一系列点突变而演化出对该模式抗原高亲和力的抗体基因，表明该细胞系有作为人源抗体体外演化的细胞分子生物学基础。
157.实验过程：
158.1、取100000个ramos细胞进行扩增，依次接种到6孔板，t-25，最终到t-175培养瓶中培养；
159.2、当细胞浓度达到150万每毫升时，收集所有大约50-100毫升培养体系；
160.3、以fitc标记的链霉亲和素为标记物与7500万到1亿细胞接触并标记；
161.4、使用流式细胞仪，以5000-10000个细胞每秒的速度分选回收染色信号最高的0.1％细胞亚群；
162.5、将回收的细胞放入24孔板培养，重复步骤1；
163.6、重复步骤2-4；
164.7、将回收的细胞放入24孔板培养，逐步放大培养到约1千万细胞；
165.8、以fitc标记的链霉亲和素为标记物对步骤7中细胞以fitc标记的链霉亲和素为标记物进行接触和标记，分选回收所有染色高于母细胞株的细胞群；
166.9、对分选回的细胞进行单细胞测序，选取主要的10种抗体基因进行重组表达，确认抗原特异性和亲和力。
167.实施例3，利用us20180179516a1公开的技术方案提高ramos细胞抗体基因多样性演化速度，抗原特异性抗体产生速度与突变率
168.使用电穿孔将外源基因或shrna通过慢病毒介导的转导递送到ramos细胞中。对于外源基因的构建体，使用pcdh载体，并且通过将外源基因的pcr产物插入载体中的多个克隆位点而将基因克隆到pcdh载体中。人类spt5的shrna构建体如(a source of the single-stranded dna substrate for activation-induced deaminase during somatic hypermutation.wang x,fan m,kalis s,wei l,scharff m d.nat commun.2014jun.13；5:4137.)中所述。对于外源表达tat家族成员及其变体的情况，使用慢病毒颗粒将编码相应蛋白质的基因片段引入ramos报道细胞。pcdh载体中的egfp用作成功递送目的外源基因的指示。
169.在另一个试验中，将hiv-1tat蛋白的各种截短形式引入ramos报道细胞。tat的48aa形式是保留结合真核转录机制能力的最小单位。
170.实施例4.通过ramos多样型抗体重链细胞库的高效自发体细胞突变筛选抗原特异性抗
171.以下实验过程仅为使用此类ramos抗体多样化库作人源抗体展示和筛选的诸多方法之一，目的是提供范例而不对实际使用方法做限定。
172.实验过程：
173.1、按实施例1所述方法建立由n(n≥2)个不同的基因组抗体重链重组ramos衍生系组成的多样型细胞库(例如，每个衍生系取1000个细胞，将1000xn个细胞混合)；
174.2、按照实施例3或us20180179516a1所述对该库进行优化；
175.3、对该多样化库ramos细胞进行扩增，并按照优化的体细胞突变方案依次接种到6孔板，t-25，最终到t-175培养瓶中培养；
176.4、当细胞浓度达到150万每毫升时，收集所有大约50-100毫升培养体系；
177.5、以fitc标记的链霉亲和素为标记物对7500万到1亿细胞进行接触标记；
178.6、使用流式细胞仪，以5000-10000个细胞每秒的速度，分选回收所有染色高于母细胞株x倍的细胞群；
179.7、对步骤6分选回的细胞取样进行单细胞测序，选取主要的10种抗体基因进行重组表达，确认抗原特异性和亲和力；
180.8、如有必要，可以对步骤6回收获得初步抗体亚群按照优化的体细胞突变方案进行进一步演化；
181.9、以低于步骤5染色用fitc标记的链霉亲和素浓度10倍的条件，步骤8获得的细胞进行接触标记；
182.10、使用流式细胞仪，以500-1000个细胞每秒的速度，分选回收染色信号最高的2％的细胞亚群，作为候选的产生高亲和力抗体的细胞；
183.11、对步骤10分选回的细胞取样进行单细胞测序，选取主要的10种抗体基因进行重组表达，进一步确认抗原特异性和亲和力。

技术特征：
1.一种多样型抗体产生细胞的细胞库，所述细胞库中的抗体产生细胞的抗体基因包含多种抗体重链可变区的编码序列。2.如权利要求1所述的细胞库，其特征在于，所述抗体重链可变区包含来自不同供体细胞的抗体重链可变区基因的重链v区段、重链d区段、或重链j区段，或其任意组合。3.如权利要求1或2所述的细胞库，其特征在于，所述细胞库中的抗体产生细胞的抗体基因包含多种重链v区段，优选地，所述重链v区段选自gene id:3492中的任何一个或多个重链v区段，和/或所述细胞库中的抗体产生细胞的抗体基因包含多种重链d区段，优选地，所述重链d区段选自gene id:3492中的任何一个或多个重链d区段，和/或所述细胞库中的抗体产生细胞的抗体基因包含多种重链j区段，优选地，所述重链j区段选自gene id:3492中的任何一个或多个重链j区段，更优选地，所述抗体重链可变区选自gene id:3492所示抗体重链基因座中所列的任意重链可变区。4.如权利要求1或2所述的细胞库，其特征在于，所述抗体产生细胞是分离的哺乳动物抗体产生细胞，优选地，所述分离的哺乳动物抗体产生细胞是人源b细胞系细胞。5.如权利要求1或2所述的细胞库，其特征在于，所述抗体产生细胞的抗体基因的重链可变区编码序列的体细胞超突变增加，优选地，所述抗体产生细胞经工程改造使得spt5的表达降低，和/或所述抗体产生细胞表达hiv tat蛋白或其具有转录因子结合功能的片段，和/或所述抗体产生细胞表达激活诱导脱氨酶或其具有激活诱导脱氨功能的片段。6.一种扩展抗体产生细胞的细胞库多样性的方法或制备多样型抗体产生细胞的细胞库的方法，包括(1a)通过基因改造在细胞库的抗体产生细胞中引入多种抗体重链可变区的编码序列，或(1b)通过基因改造在细胞库的抗体产生细胞中引入多种重链可变区编码序列的区段，优选地，多种重链可变区编码序列的区段选自以下的一项或多项：多种重链v区段、多种重链d区段和多种重链j区段，和(2)使抗体产生细胞与增加抗体基因座体细胞超突变的试剂接触，和任选的(3)通过基因改造在抗体产生细胞中引入多种抗体重链恒定区、多种抗体轻链可变区和/或多种抗体轻链恒定区的编码序列。7.一种体外进化筛选细胞的方法，所述细胞生产具有抗原特异性活性的抗体，所述方法包括(1a)通过基因改造在细胞库的抗体产生细胞中引入多种抗体重链可变区的编码序列，或(1b)通过基因改造在细胞库的抗体产生细胞中引入多种重链可变区编码序列的区段，优选地，多种重链可变区编码序列的区段选自以下的一项或多项：多种重链v区段、多种重链d区段和多种重链j区段，和(2)使抗体产生细胞与增加抗体基因座体细胞超突变的试剂接触，和任选的(3)通过基因改造在抗体产生细胞中引入多种抗体重链恒定区、多种抗体轻链
可变区和/或多种抗体轻链恒定区的编码序列，(4)在使细胞生产抗体的条件下培养多样型抗体产生细胞的细胞库，(5)根据抗体的抗原特异性活性选择生产抗体的细胞，所述选择优选利用包含细胞克隆筛选技术、流式细胞仪或光电微流控技术的方法。8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1a)包括：使细胞与含有所述多种抗体重链可变区编码序列的同源重组载体接触，或使细胞与含有针对所述多种抗体重链可变区编码序列的引导rna和编码cas蛋白的核酸构建物接触；和/或步骤(1b)包括：使细胞与含有所述多种重链可变区编码序列的区段的同源重组载体接触，或使细胞与含有所述多种重链可变区编码序列的区段的引导rna和编码cas蛋白的核酸构建物接触，所述区段如权利要求2中所述；和/或步骤(2)的试剂是具有选自以下的一种或多种序列的核酸分子：(a)表达hiv tat蛋白或其具有转录因子结合功能的片段的核酸序列，(b)降低细胞的spt5表达的rnai核酸序列，(c)表达激活诱导脱氨酶或其具有激活诱导脱氨功能的片段的核酸序列；和/或步骤(4)中使细胞生产抗体的条件包括使抗原与细胞接触和/或诱导抗体基因体细胞超突变的条件；和/或所述方法还包括在步骤(5)后再次进行一次或多次步骤(4)和(5)，其中，每次步骤(4)中的使细胞生产抗体的条件相同或不同，每次步骤(4)中诱导抗体基因体细胞超突变的条件相同或不同，和/或每次步骤(5)中所述选择生产抗体的细胞的条件相同或不同。9.由权利要求7或8所述的方法筛选得到的细胞。10.一种生产抗体的方法，包括在使细胞在生产抗体的条件下培养由权利要求7或8所述的方法筛选得到的细胞并收集该细胞生产的抗体。

技术总结
本发明提供一种多样型抗体产生细胞的细胞库，所述细胞库中的抗体产生细胞的抗体基因包含多种抗体重链可变区的编码序列。其中，所述抗体重链可变区包含来自不同供体细胞的抗体重链可变区基因的重链V区段、重链D区段、或重链J区段，或其任意组合。本发明还提供扩展抗体产生细胞的细胞库多样性的方法、制备多样型抗体产生细胞的细胞库的方法和体外进化筛选生产具有抗原特异性活性的抗体的细胞的方法。生产具有抗原特异性活性的抗体的细胞的方法。


技术研发人员：汪晓静
受保护的技术使用者：祥德生物医药(上海)有限公司
技术研发日：2020.11.23
技术公布日：2022/5/25