一种用于JAK2基因突变检测的特异性探针及检测方法与流程

一种用于jak2基因突变检测的特异性探针及检测方法
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种用于jak2基因突变检测的特异性探针及检测方法。


背景技术：

2.骨髓增殖性肿瘤是一组异质性的、来源于克隆性造血干细胞的恶性肿瘤，以骨髓一系或多系过度增殖为特征，其中bcr-abl1基因阴性的mpn包括真性红细胞增多症(pv)、原发性血小板增多症(et)和原发性骨髓纤维化(pmf)等。jak2是一种非受体型酪氨酸激酶、jaks蛋白(janus kinases)家族成员之一，它通过jak-stat信号通路介导细胞因子的胞内信号转导，在造血干细胞的增殖和分化中起了重要的作用。研究表明，jak2基因v617f激活突变存在于约97％的pv患者、50-60％的et患者和50％的pmf患者中。2017年who造血和淋巴组织肿瘤分类(第4版)明确将jak2基因v617f突变作为mpn中的pv、et和pmf的主要诊断指标之一，美国nccn诊疗指南和中国专家指南均建议采用此标准。
3.以sanger核酸测序法为代表的一代测序测序技术已广泛应用于临床，在多种疾病的预防、诊断及鉴别诊断、预后预测、用药指导、疗效评价等方面都发挥着重要的作用。一代测序技术稳定、简便、自动化程度高、所得数据为直接基因组序列、数据准确、可重复性好，现被公认为基因检测的“金标准”。
4.sanger法又称作双脱氧链终止法，是目前应用最多的核酸测序技术，由sanger等人于1977年发明提出。目前国内外已经开发上市了多款基因分析仪。此类基因分析仪基于大小不同的分子在毛细管电泳中的迁移率不同的原理，当标记有荧光的分子逐一通过毛细管时，激光检测器即可对其逐个进行检测，并同步成像，随后分析软件自动将不同的荧光信号转变为核酸序列，从而实现测序目的。但是传统的sanger测序法的灵敏度只有20％左右，这极大的限制了其在临床实践中的应用。


技术实现要素：

5.针对以上述背景技术的不足，本发明提供一种用于jak2基因突变检测的特异性探针及检测方法，解决了传统的sanger测序法的灵敏度不高，基因突变的检出率低的问题。
6.一方面，本发明提供一种用于jak2基因突变检测的特异性探针，关键在于：由包含两个片段的核苷酸链组成；
7.第一片段，其全部或者一部分具有用于对靶核酸进行分子识别的识别序列；
8.第二片段，包括但不限于c3 spacer、c6 spacer、c12 spacer、spacer 9或spacer18。
9.优选的，所述第一片段的序列为
10.seq id no.1：ggagtatgtgtctgtggagacg。
11.优选的，所述第一片段和第二片段通过3-3’结合。
12.另一方面，本发明提供一种jak2基因突变的检测方法，关键在于包括以下步骤：
13.s1.体系配置：将提取血液样本中的基因组为模板、pcr扩增预混液、权利要求1所述的特异性探针、jak2上游引物、jak2下游引物，配置成扩增体系；
14.s2.进行多重pcr扩增，将扩增产物纯化；
15.s3.将纯化产物作为模板，加入m13r测序引物，进行测序反应；
16.s4.将测序产物中依次加入醋酸钠-乙醇混合物、70％乙醇进行纯化；
17.s5.将纯化的测序产物进行测序分析。
18.优选的，jak2上游引物的序列如下：
19.seq id no.2：gcatttggttttaaattatggagt；
20.jak2下游引物的序列如下：
21.seq id no.3：
22.aggaaacagctatgaccctgacacctagctgtgatcctg；
23.m13r测序引物的序列如下：
24.seq id no.4：caggaaacagctatgacc。
25.优选的，s1中的pcr扩增预混液包括taq dna聚合酶和荧光染料。
26.优选的，s2的扩增程序为：95℃/10min；95℃/15s，60℃/20s，72℃/30s，40个循环；72℃/5min。
27.优选的，s2的纯化条件具体为：取6.0μl的pcr扩增产物、1.0μl的核酸外切酶exoi、0.2μl的小牛肠碱性磷酸酶和2.8μl的纯化水，进行pcr扩增产物的酶解纯化反应；纯化程序为：37℃/60min；80℃/15min；25℃/1min。
28.优选的，s3的测序反应程序为：37℃/10min；96℃/1min；96℃/10s，50℃/5s，60℃/2min，35个循环；60℃/2min；25℃/1min。
29.优选的，s4的纯化条件具体为：将测序产物中加入16μl醋酸钠-乙醇混合物，涡旋振荡后避光静置，于4℃下离心分离，弃上层液体后加入70μl预冷的70％乙醇，涡旋振荡后，于4℃离心分离，弃上层液体，加入甲酰胺溶解dna。
30.有益效果：与现有技术相比，本发明提供的种用于jak2基因突变检测的特异性探针及检测方法，通过设计特异性结合野生型基因序列的探针，抑制野生型序列的扩增，从而实现了对突变型序列的选择性扩增和富集，可以将sanger测序法的测序灵敏度由目前的20％左右提升为0.5％～1％左右，提高了jak2基因突变的检出率。
附图说明
31.图1为本发明与普通sanger测序法检测结果对比图。
具体实施方式
32.为使本领域技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图和具体实施方式对本发明作详细说明。
33.实施例1一种用于jak2基因突变检测的特异性探针
34.探针序列如下：
35.ggagtatgtgtctgtggagacg-c3 spacer。
36.实施例2一种用于jak2基因突变检测的特异性探针
37.探针序列如下：
38.ggagtatgtgtctgtggagacg-c6 spacer。
39.实施例3一种用于jak2基因突变检测的特异性探针
40.探针序列如下：
41.ggagtatgtgtctgtggagacg-c12 spacer。
42.实施例4一种用于jak2基因突变检测的特异性探针
43.探针序列如下：
44.ggagtatgtgtctgtggagacg-spacer 9。
45.实施例5一种用于jak2基因突变检测的特异性探针
46.探针序列如下：
47.ggagtatgtgtctgtggagacg-spacer 18。
48.实施例6一种jak2基因突变的检测方法
49.1.以细胞系和临床血液样本提取的基因组为模板，模板上样量为2μl，加入12.5μl的pcr扩增预混液，jak2上游引物、jak2下游引物和实施例1的特异性探针，其余以纯化水补充至25μl的扩增体系，jak2上游引物、jak2下游引物和jak2探针的终浓度均为200nm，混匀后快速离心；
50.其中，pcr扩增预混液为包括taq dna聚合酶和荧光染料的superreal premix plus(购于天根生化科技(北京)有限公司)；
51.jak2上游引物和jak2下游引物的序列如下：
52.seq id no.2：gcatttggttttaaattatggagt；
53.seq id no.3：aggaaacagctatgaccctgacacctagctgtgatcctg；
54.2.将扩增体系置于pcr仪中进行扩增，扩增程序为：95℃/10min；95℃/15s，60℃/20s，72℃/30s，40个循环；72℃/5min，然后取6.0μl的pcr扩增产物、1.0μl的核酸外切酶exoi、0.2μl的小牛肠碱性磷酸酶和2.8μl的纯化水配置成混合体系，将混合体系置于pcr仪中进行pcr扩增产物的酶解纯化反应，纯化程序为：37℃/60min；80℃/15min；25℃/1min；
55.3.取3.5μl的酶解纯化产物，2.5μl的bigdye terminator 3.1 ready reaction mix(购于life technologies)、1.0μl的bigdye terminator v1.1&v3.1 5x sequencing buffer(购于life technologies)、3μl的m13r测序引物配置成测序混合体系，将混合体系置于pcr仪中进行测序反应，测序反应程序为：37℃/10min；96℃/1min；96℃/10s，50℃/5s，60℃/2min，35个循环；60℃/2min；25℃/1min；其中，m13r测序引物的序列如下：
56.seq id no.4：caggaaacagctatgacc；
57.4.将测序产物中加入16μl醋酸钠-乙醇混合物，涡旋振荡后避光静置，于4℃下离心分离，弃上层液体后加入70μl预冷的70％乙醇，涡旋振荡后，于4℃下，离心分离，弃上层液体，让乙醇在室温挥发干净后，加入甲酰胺溶解得到纯化的测序产物，将纯化的测序产物在高通量测序仪(illumina)上完成测序，测序实验操作按照生产商提供地操作说明书进行。
58.对骨髓增殖性肿瘤患者的血液样本同时采用本发明和普通sanger测序法进行进行对比分析，测试结果如图1所示：
59.从图1可以看到，相较于普通sanger测序只能检测到10％以上的突变比例，本发明
添加了与野生型序列匹配的特异性探针后，可以检测到低至0.5％的突变比例，其中左侧是普通sanger测序法检测不同突变比例的检测结果峰图，右侧为本发明高灵敏sanger测序法检测不同突变比例的检测结果峰图。
60.最后需要说明，上述描述仅为本发明的优选实施例，本领域的技术人员在本发明的启示下，在不违背本发明宗旨及权利要求的前提下，可以做出多种类似的表示，这样的变换均落入本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种用于jak2基因突变检测的特异性探针，其特征在于：由包含两个片段的核苷酸链组成；第一片段，其全部或者一部分具有用于对靶核酸进行分子识别的识别序列；第二片段，包括但不限于c3 spacer、c6 spacer、c12 spacer、spacer 9或spacer 18。其中，所述第一片段的序列为seq id no.1：ggagtatgtgtctgtggagacg。2.根据权利要求1所述的一种用于jak2基因突变检测的特异性探针，其特征在于：所述第一片段和第二片段通过3-3’结合。3.一种jak2基因突变的检测方法，其特征在于包括以下步骤：s1.体系配置：将提取血液样本中的基因组为模板、pcr扩增预混液、权利要求1所述的特异性探针、jak2上游引物、jak2下游引物，配置成扩增体系；s2.进行多重pcr扩增，将扩增产物纯化；s3.将纯化产物作为模板，加入m13r测序引物，进行测序反应；s4.将测序产物纯化后进行测序分析。4.根据权利要求3所述的一种jak2基因突变的检测方法，其特征在于jak2上游引物的序列如下：seq id no.2：gcatttggttttaaattatggagt；jak2下游引物的序列如下：seq id no.3：aggaaacagctatgaccctgacacctagctgtgatcctg；m13r测序引物的序列如下：seq id no.4：caggaaacagctatgacc。5.根据权利要求3所述的一种jak2基因突变的检测方法，其特征在于s1中的pcr扩增预混液包括taq dna聚合酶和荧光染料。6.根据权利要求3所述的一种jak2基因突变的检测方法，其特征在于s2的扩增程序为：95℃/10min；95℃/15s，60℃/20s，72℃/30s，40个循环；72℃/5min。7.根据权利要求3所述的一种jak2基因突变的检测方法，其特征在于s2的纯化体系为：取6.0μl的pcr扩增产物、1.0μl的核酸外切酶exoi、0.2μl的小牛肠碱性磷酸酶和2.8μl的纯化水，进行pcr扩增产物的酶解纯化反应。8.根据权利要求3所述的一种jak2基因突变的检测方法，其特征在于s2的纯化程序为：37℃/60min；80℃/15min；25℃/1min。9.根据权利要求3所述的一种jak2基因突变的检测方法，其特征在于s3的测序反应程序为：37℃/10min；96℃/1min；96℃/10s，50℃/5s，60℃/2min，35个循环；60℃/2min；25℃/1min。10.根据权利要求3所述的一种jak2基因突变的检测方法，其特征在于s4的纯化条件具体为：将测序产物中加入16μl醋酸钠-乙醇混合物，涡旋振荡后避光静置，于4℃下离心分离，弃上层液体后加入70μl预冷的70％乙醇，涡旋振荡后，于4℃离心分离，弃上层液体，加入甲酰胺溶解。

技术总结
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种用于JAK2基因突变检测的特异性探针及检测方法，特异性探针由包含两个片段的核苷酸链组成；第一片段，其全部或者一部分具有用于对靶核酸进行分子识别的识别序列；第二片段，包括但不限于C3 Spacer、C6 Spacer、C12 Spacer、Spacer 9或Spacer 18。与现有技术相比，本发明提供的种用于JAK2基因突变检测的特异性探针及检测方法，通过设计特异性结合野生型基因序列的探针，抑制野生型序列的扩增，从而实现了对突变型序列的选择性扩增和富集，可以将Sanger测序法的测序灵敏度由目前的20％左右提升为0.5％～1％左右，提高了JAK2基因突变的检出率。提高了JAK2基因突变的检出率。提高了JAK2基因突变的检出率。


技术研发人员：刘金超 王天阳 牛孝亮 段小红
受保护的技术使用者：求臻医学科技（北京）有限公司
技术研发日：2022.02.11
技术公布日：2022/5/25