本发明涉及对三维扩展的样本的显微技术，特别是涉及共焦的激光-荧光显微技术、STED显微技术和MINFLUX显微技术。
更准确地说，本发明涉及根据权利要求1的前序的方法以及根据权利要求14或15的前序的扫描荧光显微镜。
背景技术
由美国专利US 6 473 228 B1已知具有用于校正像差的机构的显微镜和用于校正像差的方法。为了寻找校正调设，在轴向位置上采集样本的一系列图像，其中该系列的图像利用校正机构的不同调设进行。在此自动确定：在何种调设下图像对比度最大，为此提出“爬坡对比度探测方法(hill climbing contrast detecting method)”，其中如对比度由图像到图像上升那么长地同方向调节校正机构，且一旦对比度又减小，那么结束该方法。所属调设值是像差的最好校正。现在对于多个轴向位置采集这样系列的图像，对于多个轴向位置相应地确定校正机构的所属调设值。在如下情况下，其中对于三维扩展的样本实施该方法，如此也直接对于每个轴向位置获得图像，在像差的良好校正中采集该图像。代替样本可以利用具有与样本相同的光学特征的测试对象，以便根据轴向图像位置确定调设值。在该测试图像上获得的值被存储，在对样本的随后的观测中调用该值并且将其用于调设属于相应的轴向图像位置的校正。在该情况下可以足够的是，在该样本上对于每个轴向位置采集唯一图像。在获得调设值的情况下测试对象的温度可以被存储，在对样本观测的情况下可以在计算上进一步匹配像差校正或在测试对象与样本之间的温度差的调设，从而在观测中应用温度校正的调设值。自动地可以靠近轴向位置，以便对于不同轴向位置确定校正参数。
在文献EP 2 770 360 A2中一般性地描述了一种用于确定用于校正在轴向位置上的像差的机构的调设值的方法。在此描述和要求保护一种具有校正机构和控制机构的显微镜，控制机构设立为，在多个轴向位置上执行用于确定调设值的方法，且由对于多个位置的调设值借助于内插确定如下函数，该函数描述在轴向位置与调设值之间的关系；显微镜此外具有用于校正机构的驱动机构，其中对于每个轴向位置根据由控制机构确定的优化校正值调设驱动机构。调设值的确定各自根据在样本中的一个平面的观测实现，该平面垂直于光轴定向。
在文献EP 3 035 104 A2中描述了一种用于确定用于校正像差的机构的调设值的方法以及控制机构，该控制机构设立为，自动应用该方法。特别是涉及一种用于确定在轴向位置上的调设值的迭代方法，亦即用于确定对于垂直于光轴定向的图平面的调设值。在文献中对此指出：多次地校正值随着观测平面的提高的深度而线性提高，且如果在样本中紧接着具有一个折射率的区域的是一个具有其他折射率的这种区域，那么该线性提高发生改变，从而在校正值与轴向位置或观测深度之间的关系可以通过分段线性关系描述。此外描述：首先应采集样本的三维图像，无需调设校正机构；该图像被示出且示出给用户，该用户现在应根据图像选择如下区域，特别是在两个轴向位置之间的用户想要观测的区域。在该区域中，现在实施用于确定用于多个观测深度的调设值的方法。此外提出，在对于不同观测深度确定的调设值与观测深度之间的关系应通过图形描绘为函数关系；用户现在可以根据视图确定不同区域，在这些区域中应各自假定在调设值与观测深度之间的线性关系；替换地，对于每个或各个子区域的关系也可以确定为非线性函数关系。为了确定调设值，也可以沿垂直于光轴的方向确定如下子区域，在这些子区域中应各自应用用于确定调设值的方法。在样本的观测期间，根据观测深度并如果必要也有横向位置、按照之前确定的值调设校正机构。
在Booth,M.J.等的“Refractive-Index-Mismatch Induced Aberrations in Single-Photon and Two-Photon Microscopy and the Use of Aberration Correction,J.Biomed.Opt.6(3),266(2001)”和Booth等的“Aberration correction for confocal imaging in refractive-index-mismatched media,Journal of Microscopy,Vol.192,Pt 2,90-98(1998)”的出版物中提出对于如下的起源，即单独通过介质——样本可以嵌入该介质中——的折射率的错误匹配引起的像差可以通过径向对称的泽尼克多项式的和描述，其中总函数与介质中的轴向位置具有线性关系。泽尼克多项式也应理解为如下函数，该函数描述波前的中间相位的移动；这种移动不影响图像质量。第一重要的加数是对于二级的径向对称的泽尼克多项式，其描述散焦；第二加数是对于4级的径向对称的泽尼克多项式，其描述第一级的球面像差；第三加数属于6级且描述第二级的球面像差，等等。在随后的两个出版物中、亦即在“Refractive-Index-Mismatch Induced Aberrations in Single-Photon and Two-Photon Microscopy and the Use of Aberration Correction”中示出：该球面像差不仅在借助于利用共焦显微镜的单光子荧光激励对样本的观测中而且在双光子激励中导致随着升高的观测深度分辨率的近似线性的下降。在“Aberration correction for confocal imaging in refractive-index-mismatched media”中将图像亮度上的损耗和分辨率上的损耗称为像差的基本影响。在两个出版物中提出：将适应性元件集成到显微镜中，使得如此调制波前，使得调整由于错误匹配引起的像差。按照随后的出版物由此避免在信号和分辨率上的损耗。
在Patton,Brian R等的“Three-dimensional STED microscopy of aberrating tissue using dual adaptive optics,OPTICS EXPRESS,Vol.24,No.8,8862-8876(2016)”的出版物中提出具有集成的适应性的用于校正像差的光学设备的STED显微镜。适应性校正的调设根据对于在x-y平面中的图平面、亦即对于垂直于光轴的平面的图像的图像质量的评估实现。在此确定：除了球面像差之外也出现彗形像差和另外的更高的非径向对称的像差。根据彗形像差的影响命名建模。建模的结果在附图中示出，其示出：彗形像差的影响在STED射束的焦点在y-z截面中最显著地可见。在此应强调的是，在此涉及模型数据的显示，且在此还应指出：STED焦点本身在荧光探测中在通常情况下取消观测。
在Patton,Brian R等的“Is phase-mask alignment aberrating your STED microscope？”,Methods Appl.Fluoresc.3(2015)024002”的出版物中示出：用于波前成形的相位掩膜(Phasenmaske)的差的排列对于STED射束示出与彗形像差相似的影响。不仅根据模型数据而且根据在金珠(Gold-Beads)上采集的经验的数据示出：可以根据在STED焦点内x-z扫描识别干扰、亦即彗形像差或错误调整的原因。区分根据STED荧光图几乎是不可能的，从而可以混淆轻微的彗形像差与错误调整。
在国际公开文献WO 2014 029978 A1中描述一种具有用于校正像差的机构的显微镜。在此要求保护一种用于像差校正的方法，该方法作为基本采取对用于测量图像质量的特别的程度的参考。已经表明：不仅图像对比度而且图像亮度各自自身均不很好地适用作用于识别关于像差进行理想校正的图像的标准。因此确定如下标准，即不仅考虑亮度而且对比度。在此根据对于垂直于光轴的图像平面的图像找到调设。
在博士论文“Intelligent-Illumination STED, Heine, 2017(可在如下网址检索http://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-002E-E3B0-E)”中描述一种STED显微镜，其中作为波前调制器——其用于调制对于STED焦点的构成必要的波前——利用基于液晶技术的“空间光调制器”、简称SLM，其集成在特别的装置中。该装置用于可以三维地形成STED焦点。同时，SLM用于调整像差。在此示出来自体积或卷积图像(Volumenbildern)的x-z截面，一次是由共焦没有STED射束采集的图像、一次是没有像差校正采集的数据以及一次是具有像差校正采集的数据。
在Lenz,Martin O等的“3-D stimulated emission depletion microscopy with programmable aberration correction\",J.Biophotonics 7,No.1–2,29–36(2014),”论文中描述另一种STED显微镜，其在功能上基本上相应于在 Heine的论文中的功能。而且在此示出像差校正的STED数据的x-z截面。其中未清楚描述如何获得校正值。但是，从说明“实时”可以推断出：允许分析处理对于垂直于光轴的平面的图像；此外实时校正看起来不可能，因为沿z方向的扫描相当缓慢。
由文献DE 10 2017 101 188 A1已知一种利用显微镜显微检验样本的方法以及相应的显微镜，该显微镜包括物镜和图像传感器，图像传感器用于转换由物镜描绘到图像传感器上的图像。显微镜的视野通过选择图像传感器的一个部段是可改变的。为了利用显微镜采集样本的至少一个子区域的初始图像，在显微镜上选择第一视野。初始图像被分析，以便求取至少两个相互区别的描绘子区域的视野，通过各视野描绘初始图像的各自一个子区域。对于求取的描绘子区域的视野中的每个采集样本的子区域的图像。附加地，采集具有深度信息的初始图像和显微图像中的多个，从而涉及三维图像。为了采集具有扩展的焦深和附加的深度信息的初始图像或显微图像，调节在显微镜的有源光学元件上的执行器。执行器涉及焦点执行器和/或像差执行器。在一个实施方式中，光学执行器构成为显微系统，其包括机械可动的用于采集扩展的焦深的微镜。通过改变微镜的位置，该显微系统允许要描绘的焦点平面的非常快速的调设。如此能实现如下，在短时间中采集在相邻的焦点平面中的多个采集。这样序列的图像——其采集在不同的焦点平面中——也称为焦点堆(Fokus-Stapel)。由焦点堆可以求取具有扩展的焦深的图像。各子区域的显微图像也可称为瓷砖式图像块(Kacheln)。已知的方法因此适用于大的样本、例如电路板的显微技术。各子区域的采集的显微图像在此拼合为样本的总图像。对于子区域中的每个确定描绘子区域的视野且将其用于采集相应的图像。除了视野之外，也匹配用于采集样本的子区域的显微图像的显微镜的另外的参数，这些另外的参数在初始图像的分析结果中被确定且在显微镜上各子区域的显微图像的采集中被选择。显微镜的另外的参数包括用于像差控制的参数和/或用于调节有源光学元件的执行器的参数。
技术实现要素：
本发明的任务在于，提出一种具有在三维扩展的样本中出现的像差的改善的校正的三维扩展的样本的显微图像采集的方法。另一任务在于，提出一种具有针对方法的用户界面的装置。
本发明的任务通过具有独立权利要求1的特征的方法和具有独立权利要求14或15的特征的扫描荧光显微镜解决。从属权利要求2至13涉及方法的优选实施方式，且从属权利要求16至19涉及扫描荧光显微镜的优选实施方式。
按照本发明用于三维扩展的样本的显微图像采集的方法具有如下步骤：在第一步骤中实现通过利用聚焦的激励光分布在与显微物镜的光轴平行的截面中扫描该第一样本采集与显微物镜的光轴平行的第一截面图，其中借助于可调设的校正机构按照像差校正函数的初始调设参数校正该激励光分布，且其中在每个扫描位置探测从样本发出的荧光；替换地实现采集第一数量的这种截面图；在第二步骤中，实现分析处理第一截面图或替换地第一数量的这种截面图；在第三步骤中，实现确定像差校正函数的新的调设参数；在第四步骤中，实现通过利用聚焦的激励光分布扫描是第一样本或另一样本的样本采集另外的图像数据，其中借助于可调设的校正机构按照像差校正函数的新的调设参数校正该激励光分布，且其中在每个扫描位置探测从样本发出的荧光。所述步骤以其命名的顺序执行。
如下说明——即第一截面图和所属截面与显微物镜的光轴平行——包括如下可能：显微物镜的光轴在第一截面图和所属的截面中延伸。对此替换地，显微物镜的光轴与第一截面图和所属的截面具有间隔地延伸。
如下说明——在第一步骤中按照像差校正函数的初始调设参数校正激励光分布——包括如下可能：在第一步骤中像差校正函数的初始调设参数还未促成像差校正。
像差校正函数典型地是在样本中沿着显微物镜的光轴变化的z位置的函数。亦即，至少当应用像差校正函数的新的调设参数的情况下，借助于可调设的校正机构、不对于在样本中所有的z位置相同地校正激励光分布。
像差校正函数的调设参数可以特别是像差校正函数的各个分量的放大系数和偏移。
如下说明——所述步骤以其命名的顺序执行——不包括如下可能：在所述四个步骤之间还执行另外的步骤，其中也可以涉及已经执行的步骤的重复。
如果采集“多个这种截面图”，那么可以以像差校正函数的相互相同或相互不同的调设参数采集这些多个这种截面图中的各个截面图。
如果在第二步骤中第一截面图或多个第一截面图的分析处理得到如下，即足够校正像差，那么在第三步骤中确定的新的调设参数和初始调设参数可以是相同的。通常得到如下分析处理，即未足够校正像差。在该情况下，在第三步骤中改变调设参数。
如果以像差校正函数的相互不同的初始调设参数采集多个截面图，那么多个截面图的分析处理得到如下：属于多个图像的初始调设参数引起足够像差校正。在该情况下，可以将属于该图像的初始调设参数确定为新的且同时最终的调设参数。
截面图或图像在此——如这也是通常那样——不仅理解为图像数据的图形的、视觉上可感知的表达，而且也将其理解为如下图像数据集，该图像数据集可分别作为图形表达的基础。
按照本发明的方法的特征在于，在截面中在第一步骤中利用聚焦的激励光分布扫描样本，该截面平行于显微物镜的光轴延伸，从而平行于显微物镜的光轴采集第一截面图。这种沿显微物镜的光轴的纵向方向延伸的截面图使得在分析处理的第二步骤中不仅容易地识别：是否而且如果必要还有如何可校正像差校正函数的初始调设参数，亦即如何可在第三步骤中确定像差校正函数的新的调设参数。这基于如下，即沿显微物镜的光轴的纵向方向延伸的截面图示出沿样本的深度方向尽管像差校正仍剩余的像差的影响的走向。由此，剩余的像差的类型和大小可以容易地、亦即也直观地被正确识别或者被相当准确地估计，并且由此可以同样好地估计在新的调设参数的确定中必要的变化。沿显微物镜的光轴的纵向方向延伸的截面图不仅关于其直观的可解读性而且其信息密度方面显著超过用于像差校正函数的优化的已知的基础、例如样本的三维图像或者与显微物镜的光轴法向延伸的截面图的堆，这两者难以显示和视觉检测。
第一截面图或第一数量的截面图的分析处理可以或者自动地借助于数学图像分析方法和用于确定像差——像差在截面图中或多个截面图中产生影响——的所属标准的利用实现或者其可以通过人员观测者的视觉检查实现。在后者情况下，该截面图或多个截面图或者由多个截面图获得的截面图图形地、在监视器或显示屏上、作为灰度图或作为使用彩色表的彩色图或者作为多个截面图的相应的图序列示出；且观测者根据图像或图像序列、例如根据在图像区域中或多个图像区域中如果可能变化的图像清晰度和/或在图像区域中或多个图像区域中如果可能变化的图像亮度估计像差。由现有技术已知的类似或相同标准也可以是用于自动分析处理截面图或多个截面图的基础。同样可以通过用于自动分析处理截面图或多个截面图的机器学习训练为此适合的控制器。
如果进行了处理截面图或多个截面图的自动分析，那么也可以自动进行新的调设参数的确定。
在这两种情况下、亦即不仅在自动分析处理中而且在视觉检查中可能的是——在分析处理的情况下、通过人员观测者的视觉检查例如基于其经验：基于在第三步骤中的分析处理可确定和已确定像差校正函数的直接最终的调设参数。特别简单地可能的是，在第一步骤中对于不同的初始调设参数采集多个图像。
如果在第三步骤中确定最终的调设参数，那么在第四步骤中另外的图像数据的采集已经是图像数据的获取，观测者作为其显微检查的结果对该图像数据感兴趣。
如果不能已经在第三步骤中确定像差校正函数的最终的调设参数或者存在对于如下的不确定性，即是否校正机构在应用确定的调设参数的情况下将引起像差的足够校正，那么在第四步骤中的另外的图像数据的采集可以是通过利用聚焦的激励光分布在与显微物镜的光轴平行的截面中扫描第一样本对另一截面图的采集或者对另一数量的这种截面图的采集。原则上，在该情况下在第四步骤中可以与如下无关，即是否在第一步骤中采集第一截面图或第一数量的截面图，采集单个截面图或多个截面图。
在上述第三步骤中获得的截面图或这些在上述步骤中获得的多个截面图现在在另一步骤中被分析处理，其中与在第二步骤中的分析处理的方式无关地、在另一步骤中的分析处理可以或者自动地借助于数学分析方法或者通过人员观测者的视觉检查实现。经常地，但是在另一步骤中的分析处理将根据在第二步骤中的分析处理实现，亦即紧接着自动分析处理是另一自动分析处理，且紧接着视觉检查是另一视觉检查。但是这不必总是适用，如在下文中所阐明的那样。
现在如根据在第二步骤中的分析处理那样又可能的是，基于在该另一步骤中的分析处理、在紧接着该另一步骤的步骤中可确定和已确定像差校正函数的直接最终的调设参数，或者未已经在该紧接着的步骤中可以确定像差校正函数的最终的调设参数，或者存在关于如下的不确定性，即是否校正机构在应用在紧接着的步骤中确定的调设参数的情况下将引起像差的足够校正。如果确定最终的调设参数，那么紧接着或随后使用确定的调设参数实现图像数据的采集，观测者作为其显微检查的结果对该图像数据感兴趣。如果在分析处理之后确定调设参数，该调设参数未假定为最终的调设参数，那么重新通过利用聚焦的激励光分布在与显微物镜的光轴平行的截面中扫描第一样本来采集另一截面图或者多个这种截面图且紧接着将其分析处理，且基于该分析处理实现重新确定新的调设参数。
按照本发明的方法的这种迭代的执行也可以如此描述，即在执行第四步骤之前，在第三步骤之后或者至少一次重复第一步骤和第二步骤或者第一步骤、第二步骤和第三步骤，其中在第四步骤中实现图像数据的采集，观测者作为其显微检查的结果对该图像数据感兴趣。
如果或者基于紧接着截面图采集或多个截面图的相应的采集的分析处理可确定和已确定最终的调设参数，因为该调设参数例如与之前确定的调设参数的偏差小于用于值得的另外的变化的下边界；或者如果一个截面图或相应多个截面图的分析处理得到如下，即像差是足够校正的，那么中断迭代。在该情况下，在紧接着分析处理的下一步骤中将最后确定的调设参数确定为最终的调设参数。
如果调设参数的数量较少且如果在调设参数与在图像采集中有效的像差之间存在简单的关系，那么调设参数的这种迭代式确定可以在没有大的困难的情况下实现。因为这样就可以在分析处理之后、例如在截面图的视觉检查之后在确定步骤中试验性地确定新的调设参数且在利用新的调设参数进行截面图采集之后比较最后采集的截面图的质量与更早采集的截面图的质量。由该比较可以断定：是否该变化已经促成改善或导致变差。于是，由这种比较得到如下，即是否调设参数的另一变化应以与第一变化相同的方向或以相反的方向实现。这样简单的关系例如在如下情况下产生，即如果校正机构设立为，校正这种像差，该像差通过样本的嵌入介质的折射率与应用的浸入介质的折射率的错误匹配引起。这种像差可以按照在现有技术部分中所述的Booth,M.J和相应的合著者的两个出版物“Refractive-Index-Mismatch Induced Aberrations in Single-Photon and Two-Photon Microscopy and the Use of Aberration Correction”以及“Aberration correction for confocal imaging in refractive-index-mismatched media”中的表达通过偶数级的径向对称的泽尼克多项式的和描述。像差的强度与在错误匹配的介质中的轴向或z位置具有线性关系。像差校正函数在该情况下是在样本中z位置的线性函数。作为调设参数那么应用像差校正偏移值和像差校正斜度。
如上所述，经常是一个自动分析处理紧接着一个自动分析处理以及一个视觉检查一个紧接着视觉检查。特别是对于促成调设参数的最后确定的最终的分析处理步骤这不必适用。例如可以有意义的是，首先进行一系列的自动分析处理和新的调设参数的确定，直至例如达到确定数量的分析处理之后或者达到截面图的确定的图像质量——根据确定的标准测量——之后；或者如果由一个至下一个迭代步骤未产生由一个至随后截面图的图像质量的改善，那么中断该系列的自动分析处理和确定，且紧接着观测者实施视觉检查。观测者那么有责任决定：将调设参数确定为最终的调设参数或者确定自身改变的新的调设参数，或者作为最终的调设参数或者作为进一步迭代的基础。也可以考虑的是，观测者中断过程，例如如果图像质量不足够，且例如检查：是否任意错误存在，例如在浸入介质中的气泡、盖玻片的损坏或者诸如此类。相反地也可以考虑的是，首先通过观测者实施一系列的视觉检查和确定，且紧接着在后续步骤中自动地根据确定的标准确定截面图的图像质量，从而在将调设参数确定为像差校正函数的最终的调设参数之前，可以给观测者提供客观的度量数(Maβzahl)，根据该客观的度量数观测者可以客观地检验其主观印象。
将调设参数这样确定为最终的调设参数也可以隐含地或自动地实现，亦即用户没有明确地实施用于将调设参数确定为最终的调设参数的动作，例如其方法是在例如显微观测的开始时——无论如何实施该开始——将最后选择的调设参数假定为最终的调设参数。
在确定最终的调设参数之后现在可以采集如下图像数据，观测者作为其显微检查的结果对该图像数据感兴趣。原则上，像差校正函数的最终的调设参数的确定可以根据如下图像数据实现，其中在同样的样本上采集该图像数据，紧接着或随后检查该样本。但是这不是在每种情况下都是必要的。如果应检查例如一系列相似样本、例如一系列在受控的、相同条件下制造的样本，可以足够的是，根据单个要检查的样本的图像数据确定最终的调设参数，且将确定的调设参数用于在该系列的所有或至少多个样本上的图像获取中。也可以考虑的是，准备好特别的参考样本且将其用于最终的调设参数的确定。这特别是在如下情况下可很好实现，即如果通过可调设的校正机构应该校正单独由于其中可嵌入样本的介质的折射率错误匹配于浸入介质——其也可以是空气——的折射率所引起的球面像差。根据参考样本或样本系列的单个样本确定为最终的校正参数随后可以用于每个样本的透镜检查中，其中每个样本的嵌入介质具有与参考样本或样本系列的单个样本的嵌入介质同样的折射率。
原则上也可能的是，类似于在美国专利US 6 473 228 B1中那样提出，在获取像差校正函数的最终的调设参数中共同存储参考对象的温度，且在样本的随后的观测中、亦即在如下图像数据的获取中——观测者作为其显微检查的结果对该图像数据感兴趣——根据样本的温度修改像差校正函数的最终的调设参数。如果图像采集应在37℃的生理条件下实现，那么这例如是特别有利的。同样地，可以在样本或参考样本上进行图像采集时考虑浸入介质的相应的温度和/或在样本或参考样本与浸入介质之间的温度差。为了这种校正可以形成模型，该模型足够好地反映温度效应，例如以温度有关的Sellmeier等式的形式。替换地，也可以在参考样本或在要检查的样本系列的用作参考样本的样本上实施对于不同温度或温度对的测量系列。这种方法看起来虽然是昂贵的，但是与该方法相关的成本可以特别是结合相互相似的样本的筛选或者在样本或包含在样本中的对象、例如亚细胞结构对温度变化的反应的检查中是完全合理的。该方法那么不仅具有如下优点，即要筛选的量的样本的检查要求更少的时间，而且也具有如下优点，即未已经在原本的检查之前给要检查的样本施加激励光，该激励光可以导致涉及的样本区域的漂白或变白。
在如下情况下，即未已经在第三步骤中、而是在迭代的过程中确定像差校正函数的最终的调设参数，那么除了与显微物镜的光轴平行的第一截面图——通过利用聚焦的激励光分布、在与显微物镜的光轴平行的截面中扫描样本获取该第一截面图——或多个这种截面图还采集一个或多个另外的截面图——其通过利用聚焦的激励光分布、在与显微物镜的光轴平行的截面中扫描样本而获取——或一个或多个大量的这种截面图。在如下情况下，即各自采集各个截面图、亦即不采集多个截面图，样本的与在连续的迭代步骤中获得的不同截面图对应的截面可以是相同的，但是不必须如此。在如下情况下，即在迭代过程的一个或多个步骤中采集大量截面图，样本的与截面图对应的截面或大量截面可以完全或部分重合或覆盖，但是不必须如此。
对于样本的与同属的大量截面图的不同的截面图对应的截面相应地适用，亦即这些截面也可以相互相同，但是不必须如此。这些截面例如可以属于各自平行的平面或者一个平面的并列的区域。
如果样本的在迭代过程的连续步骤中用于寻找调设参数的截面重合，那么这具有如下效果，即正好对于这个截面可以找到像差校正函数的特别适合的调设参数。此外，各截面图相互间的相似性是特别好的。缺点在于，在涉及的截面中给样本多次施加激励光，且因此可以使得样本比较强地变白。另一缺点在于，在如下情况下，即样本沿横向方向是非均匀的，例如如果样本的折射率沿横向方向变化，在对于截面的相邻区域中的校正具有较低质量。
在很多、但是非所有情况下，截面变为截平面，其中在此应将其理解为非完全无限扩展的平面——截面属于该平面——而是将其理解为平坦的截面自身。
如果样本的在迭代过程的连续步骤中用于寻找调设参数的截平面中的至少一些不同，那么这具有如下效果，即在寻找调设参数期间利用横向扩展的区域。虽然那样相比于利用重合的截平面样本的更大的区域变白，但是每个单个的截平面更小地变白。可以特别有利的是，作为在确定最终的调设参数或确定在之前的确定步骤中确定的调设参数之前最终的截平面选择如下这种截平面，该截平面在迭代的更早的步骤之一中被选择。在此可以断定：是否在之前描绘的截平面中获取的调设参数同样适用于在最后选择的截平面中的像差校正。类似地适用于如下情况，即如果代替截平面而应用非平截面。
在迭代过程的第一步骤中和/或在相应的随后的步骤中对于样本的多个不同的截平面采集多个截面图具有如下效果，即在每个所属的分析处理步骤中获取关于横向间隔的截平面或者关于相互成角度定向的截平面的信息。例如可能和有意义的是，在第一步骤中选择大量截平面，其中之一位于在样本的横向的第一边缘区域中或者在样本的观测者想要显微检查的区域中、亦即感兴趣的区域中，而其中另一相应地横向地对置。是否以及如果必要对于在这两个各自位于在边缘区域中的截平面之间多少截平面采集截面图，这可以取决于感兴趣的区域的横向扩展以及样本的类型。在分析处理步骤中——其中分析处理更多截平面的利用校正机构的相同的调设采集的截面图——可以通过截面图的比较、通过视觉或自动比较得知：是否在不同截平面中相似或甚至相同的像差有效，或者是否在各个横向位置之间的像差不同。那么可能的是，根据截面图的分析处理——沿横向方向看去——确定样本的子区域，对于该子区域应各自分别地确定校正函数的调设参数。这种确定可以已经在分析处理大量第一截面图之后实现。但是也可能的是，首先基于所有截面图确定如下调设参数，该调设参数在随后的步骤中用于对于相应的截平面采集另一数量的截面图；且如果在已经利用像差的部分校正采集的截面图中示出：为了对于样本的不同横向区域的完全或无论如何足够的校正各自不同的调设参数是必要的，那么仅仅在随后紧接着的步骤之一中实现子区域的确定。相应的截平面应理解为这种平面，其对于已经应用的截平面相同或者与已经应用的截平面紧密相邻。
此外可能的是，根据单个截面图的分析处理确定：是否出现的像差沿着截面的横向扩展方向相同或者沿着该方向变化。这那么也适用于对于多个截平面的多个截面图中的每个单个的截面图。这表示：根据对于平行的平面的多个截面图的采集可以得知：是否对于样本沿两个横向方向应确定子区域，对于该子区域应各自单独地确定校正函数的调设值。在此也适用的是，可能的是：子区域的确定仅仅在之前部分校正之后的随后的迭代步骤中实现。
另一种可能在于，确定不同定向的截平面。特别是可能的是，确定垂直相交的截平面。如果例如确定两个截平面，这两个截平面沿横向方向在感兴趣的区域中或者靠近其中间相交且各自延伸直至感兴趣的区域的边缘、超过边缘或者直至边缘的附近，那么可以通过特别简单的方式得知：是否样本应沿横向方向分为各子区域，以便实现足够的校正。
样本分为子区域可以基于通过用户的视觉检查实现或者也可以自动地实现。可能的是，组合各个变型，例如可以在第一步骤中采集两个垂直相交的截平面，紧接着根据单个截面图实现一个或多个分析处理和确定步骤，且紧接着采集多个平行的截面图，对其进行分析处理且将其用于确定新的调设参数。
也可以存在如下需求，即将样本或样本的相应的横向子区域轴向分为各部段。这例如适用于如下情况，即如果样本的嵌入介质的折射率或者样本的有效的、局部平均的折射率沿轴向方向变化。这例如但是也适用于如下情况，即如果在样本中包含的结构局部引起像差。后者经常是在荧光显微技术中在生物样本上的情况。如果例如一个单元位于在照明和探测路径中，那么经常地沿着照明路径后置于该单元的区域涉及强的像差，而直至该单元且如果可能进入该单元且横向在该单元旁边的区域涉及显著更小的像差。根据单元结构和单元的形状，像差可以类似于彗形像差、散光或任意其他已知类型的像差或者这些的组合。而且球面像差也可以通过这种局部结构引起。但是通过局部结构引起的像差具有如下共同点，即这些像差局部产生影响，亦即也在如下局部意义上，即影响也轴向地沿着照明方向或相反于探测方向随着提高的间隔而降低。正是结合这种局部结构按照本发明的方法的特别的优点日益明显。如果如由现有技术已知的那样由垂直于光轴定向的截面图确定校正项，那么考虑局部效果是完全不可能的或者仅仅以大的成本才是可能的。因为在各个图像中均不同时包含通过、进入和位于涉及的局部结构之下的区域。但是在按照本发明的方法中是这种情况，因为对于在考虑的截平面内的每个结构获取截面图，其中正好通过、进入和位于涉及的局部结构之下的区域属于图像。如此基于截面图可以容易地决定：是否利用全局调设参数的全局校正对于更大的图像区域足够，或者是否在临近区域中分别的、如果必要附加地添加给全局校正的校正是必要的或者无论如何是有意义的。
样本分为轴向子区域可以基于通过用户的视觉检查实现或者自动地实现。着眼于考虑局部结构，基于视觉检查的划分可更简单地实现。因为无论如何如果根据同样的样本——用户想要检查该样本——确定调设参数，用户可以根据截面图容易地决定：是否局部出现的像差是相关的。如果用户例如对位于在单元之下的区域不感兴趣，而是仅仅对单元内部和对例如轴向如此远离以便局部像差不产生作用的区域感兴趣，那么用户将省去确定子区域。如果这种情况存在于样本中的一个位置上或者这种情况存在于多个截面图中，那么存在大的可能在于，在整个样本中或者无论如何在整个子区域中可以省去局部紧密受限的校正。在如下情况下，即观测者例如对在单元的边缘区域中或者在一个单元之外的生物结构感兴趣、但是对这种单元不感兴趣，该观测者将对正好该局部区域的校正感兴趣。观测者可以如此获得这种校正，其方法是对于局部子区域、如果必要附加于全局校正实施分别的校正，对于该分别的校正确定像差校正函数的调设参数。但是在多种情况下可以足够的是，对于较大的子区域如此确定调设参数，使得正是在用户特别感兴趣的区域中的图像质量特别好。
在上述段落中在一些章节中基于如下，即根据要检查的样本的截面图确定调设参数，其中该截面图再者属于用户想要显微检查的截平面。调设参数的确定的方式具有多种优点，例如如上文各自描述的那些优点。但是其具有如下缺点，即至少要显微检查的样本的子区域已经在显微检查之前施加激励光且因此变白。在多种情况下可以避免这一点，亦即当样本沿横向方向足够均匀。该条件可以多次满足，因为在多种情况下基本的像差通过样本的折射率与浸入介质的折射率的错误匹配所引起。这的错误匹配经常与横向位置无关。同样与横向位置无关地像差的另一源例如是浸入介质自身的未正确选择或确定的折射率，特别是也由于与额定值具有偏差的环境温度或者盖玻片厚度的错误匹配。如果应校正这种像差，那么有利的是，将根据其用于确定调设参数的一个或多个截平面放入一个或多个样本区域中，该样本区域横向地位于在感兴趣的区域之外。该方法此外可如此执行，如上所述，例如可以有利地描绘一个截平面或多个截平面，该截平面虽然横向地位于在感兴趣的区域之外、但是靠近相邻该感兴趣的区域；此外有利地可以各自选择一个或多个截平面，该截平面各自沿横向方向平行或相切于边缘或者平行于边缘的切线定向。
也可能的是，代替一个或多个截平面选择非平截面，例如这种平面，该平面横向地在感兴趣的区域之外平行于感兴趣的区域的边缘延伸。自然也可能的是，选择多个这种截面。在截面图的分析处理中那么应注意的是，根据截面的弯曲、如果必要局部不同的弯曲描绘的结构显得歪曲，以及例如在图像数据的平面的视图中图点示出在一个平面中，这些图点属于目标点，目标点正好还未位于在一个平面中。即便如此，这种方法可以是有意义和有利的，因为如此在环绕感兴趣的区域的区域中像差中的区别在一个图像中变得可见；如果不存在区别，这也可以在一个图像中得知。
如不仅在现有技术中而且在本专利申请中所多次提及的那样，像差的基本的原因是折射率的错误匹配。对此适用的是，所属的像差可通过偶数级的径向对称的泽尼克多项式的和表示，亦即，所属的像差由散焦和所有可能的级的球面像差的和组成，其中随后最终的和总体上称为球面像差。这例如更一般地在如下意义上适用，即各自在由第一介质到具有另一折射率的第二介质的过渡中导入散焦和球面像差。不仅散焦而且球面像差的强度随着在第二介质中焦点的额定位置与两个介质的边界面的间隔而增大，亦即如此调设物镜，使得物镜在统一的介质中与如下地点具有第一轴向间隔地产生焦点，其中在非统一的介质中边界面位于在该地点，如此物镜在存在边界面的情况下产生异常的焦点(aberrierten Fokus)，该异常的焦点与边界面具有间隔，该间隔由第一轴向间隔与常数的乘法产生。而且，球面像差的强度由间隔和无论如何在涉及的泽尼克多项式的适合的标准化或表示的情况下相同的常数产生。现在在到第三介质中的过渡上添加第二边界层，在第三介质中同样如在第二介质中那样适用，其中导入直至第二边界层的散焦和导入的球面像差保持存在。在第三介质中出现的总散焦和总球面像差因此相加地由导入直至第二边界层的像差和由另一常数和与第二边界层的间隔的乘法产生的像差组成。在此所述的常数在下文中称为像差校正斜度。相应的关系适用于具有不同的折射率的如下层。
由此得到如下，即用于校正对于具有沿轴向方向均匀的折射率的区域——如在现有技术中例如在文献EP 2 770 360 A2中提出——的散焦和/或球面像差的像差校正函数可以由对于在均匀的区域内两个轴向位置的校正值获取。在根据现有技术的方法中，最后上述像差校正斜度由对于轴向间隔的焦点位置的两个像差校正值确定。两个像差校正值中之一可以考虑为像差校正偏移值。
对于如下一般的情况，即样本的折射率沿轴向方向未在边界层上跳跃式改变；或者在如下情况下，即具有不变折射率的各个层非常薄，用于散焦和/或球面像差的必要的像差校正由在整个厚度上直至焦点位置的积分并考虑各自轴向局部存在的折射率产生。如果折射率例如线性地随着轴向位置改变，那么球面像差和散焦的必要的校正的大小根据二次函数变化。对于该最后所述的情况，可以基于具有三个调设参数的像差校正函数获得散焦和/或球面像差的良好的校正。按照现有技术，可以由对于至少三个垂直于光轴定向的平面的校正值获得这种三参数校正函数。
按照本发明的方法，现在未总体上由对于两个轴向间隔的焦点位置的校正值确定像差校正斜度以及像差校正函数，而且也未由对于至少三个轴向间隔的焦点位置的校正值确定三参数函数。如上所述，对于各截面、在多种情况下对于平行于光轴定向的截平面采集截面图。对于第一采集可以假定初始的像差校正偏移值和像差校正斜度。在此可以基于关于浸入介质、如果必要关于盖玻片且特别是关于样本的嵌入介质的信息确定初始值。初始值在此也可以单个地或共同地设置为值0(null)。像差校正偏移值在此直接地且与像差校正斜度的值无关地影响在样本的固定的、垂直于光轴定向的第一平面中像差的校正。间接或相加地该像差校正偏移值影响在所有另外的垂直于光轴定向的平面中的像差校正。第一平面例如可以是在盖玻片与样本之间的边界层的平面，第一平面但是也可以是任意的可自由选择的参考平面。优选地，该参考平面但是与光轴在轴向区域内相交，对于该轴向区域应实施像差校正。用于像差校正斜度的值在所有垂直于光轴定向的平面中、除了在上述参考平面中之外产生影响，其中影响随着与参考平面的间隔线性增大。在该部分中的所述内容着眼于散焦和/或球面像差的校正适用，非或者无论如何非强制适用于其他像差的校正。
如上所述，该方法也可以单个地用于多个轴向子区域，从而结果获得分段线性的校正函数。在多种情况下这是必要的，但是也是足够的。
对于第一采集，也可以假定三参数的、例如二次像差校正函数的三个初始调设参数用于校正散焦和/或球面像差。这些调设参数中之一也可以在此具有像差校正偏移值的函数，两个其他调设参数随着在样本中的深度、亦即z位置影响像差校正函数的变化，其中第三调设参数特别是可以影响变化的弯曲。这种校正函数的确定和应用例如在如下情况下可以是有意义的，即如果在样本中构成温度梯度且该温度梯度在观测期间维持。这例如在如下情况下是可能的，即如果在物镜与样本支架的温度之间存在差别。介质的折射率通常与温度连续和单调地具有关系，从而这种温度梯度可以引起折射率的对应的梯度，从而那么折射率的曲线可以通过线性函数至少近似。而且在此可以自动地或根据视觉检查来确定最终的调设或校正参数。
原则上也可能的是，利用按照本发明的方法确定具有四个或更多调设参数的用于校正散焦和/或球面像差的校正函数。应找到越多的调设参数，那么自然找到校正函数的用于校正的调设参数就越困难。这引起：例如在具有折射率的更复杂的涂层的样本中最终可以更好的是，确定分段线性的校正函数。
着眼于球面像差应确定的是，对图像质量的影响随着球面像差的增大的级而降低。在实践中因此可以足够的是，实际上非关于所有级实施校正，而是仅仅关于较小的级实施校正。在下文中尽管如此言及球面像差的和，因为该和通过较小的级的泽尼克多项式的和以及已经通过描述第一级的球面像差的泽尼克多项式近似地描述。
现在必须在理想化考虑的情况下区分两种情况。在第一种情况下，全部通过偶数级的径向对称的泽尼克多项式可描述的像差的校正机构仅仅校正球面像差而不校正散焦；不同于球面像差的其他像差或散焦的附加的校正在该情况下也是可能的。对于该情况的表征决定性的是，散焦正好不由校正机构校正。在该情况下，成功的校正促成：构成非异常的焦点，该焦点的位置相对于在不存在错误匹配或边界层的情况下所具有的位置是移动的，其中移动的程度与焦点的轴向位置有关。在该情况下在应用校正的情况下获得如下数据集，该数据集根据像差校正斜度的值是歪曲的。因为另一方面获得像差校正斜度作为调设参数，所以可以校正该歪曲。该方法的优点在于，通过校正机构对波前的必要的影响总体上小于也校正散焦时的情况。如果作为校正机构例如应用可变形的镜，该镜具有受限的行程，那么在该方法的应用中虽然该受限的行程也可以对于样本大的厚度和/或对于折射率的大的错误匹配实施像差校正。此外，该方法具有如下优点，即像差校正偏移值在固定轴向位置的情况下不仅关于样本而且关于图像直接影响图像质量。
在第二种情况下，全部通过偶数级的径向对称的泽尼克多项式可描述的像差的校正机构那么也校正散焦；不同于球面像差的其他像差或散焦的附加的校正在该情况下也是可能的。这促成：在成功校正的情况下构成非异常的焦点，该焦点的位置相对于在不存在错误匹配或边界层的情况下所具有的位置是正好不移动的。但是因为在没有校正以及在不足的校正的情况下焦点是移动的，所以该方法的应用促成：在实施期间、特别是在确定最终的调设参数之前在第一截面图采集与最终的截面图采集之间、在图像中包含的结构相互间显得移动。该方法具有如下优点，即由一开始获得不歪曲的图像。该方法具有的缺点在于，通过校正机构对波前的必要的影响总体上大于不校正散焦时的情况。如果作为校正机构例如应用可变形的镜，该镜具有受限的行程，那么在该方法的应用中该受限的行程使得对于样本大的厚度和/或对于折射率的大的错误匹配的像差校正成为不可能。另一确定可以在如下情况下产生，即如果用作校正机构的某一装置不仅应用于校正像差、而且也用于改变焦点位置、亦即用于沿轴向方向扫描样本，因为在此可变形的镜的行程如果可能已经对于焦点位置的变化是可需要的。
着眼于这两种情况应注意如下：如果焦点位置的变化通过物镜相对于样本的移动实现，如这是在多少应用情况下的情况，那么该移动不仅促成焦点相对于边界层或参考平面的位置的变化，而且也促成被照射的浸入介质的层的厚度的变化。这然而并不影响方法的原则上的可应用性。因为像差校正偏移值属于物镜的固定位置，且对于校正必要的像差校正斜度始终与在样本中焦点的轴向位置具有线性关系。该斜度由两个线性关系的叠加产生，因为正是浸入介质的影响也随着厚度且因此随着焦点位置线性变化。相应地，三参数的像差校正函数——如其在样本中构成折射梯度的情况下可以是有意义的——的确定也是可能的；或者四参数的像差校正函数的确定或者这种具有大于四个调设参数的像差校正函数的确定也是可能的。
在实践应用中，球面像差的校正与散焦校正的明确分离涉及一些成本，但是是可能的，例如在参见Travis J.Gould等的“Adaptive optics enables 3D STED microscopy in aberrating specimens,OPTICS EXPRESS,Vol.20,No.19,20998-21009(2012)”中所阐明的那样。
但是结合本发明特别是更重要的是根据经验获取的如下认识：球面像差的好的校正和好的图像质量在如下情况下也是可能的，即如果由于缺乏实施的校准必须忍受如下，即像差校正引起焦点的移动。由此虽然涉及图像的歪曲，但是该歪曲不降低图像清晰度和图像亮度。
如多次所提及的那样，利用按照本发明的方法也可以校正不同于球面像差或散焦的像差。如果这种像差非通过局部结构引起、而是例如通过盖玻片的变形或诸如此类引起，那么这些像差在整个样本中产生影响，其中在此也存在位置与轴向位置的关系、在此如果必要附加地也存在与横向位置的关系。这种像差可以根据在图像中已知形状的结构的变形得知和识别。这首先一方面适用于在对于垂直于光轴定向的图平面的图像中的变形。但是例如散光也导致沿着物镜光轴的歪曲，亦即导致在对于平行于光轴定向的平截面图中的歪曲。因此原则上可能的是，给像差校正函数补充针对另外的像差的校正的项，且利用按照本发明的方法确定所属的调设参数。
这种扩展特别是也适用于由局部结构引起的像差的校正。为此也在别处已经发现相应的实施方案。
对于在利用视觉检查的情况下应用按照本发明的方法，可以给用户提供调设元件，例如在显示屏上作为滑动调节器，该调设元件那么例如借助于对计算机鼠标的利用是可调设的。为了校正仅仅球面像差以及如果必要还有散焦，仅仅需要两个调设元件。如果应校正通过折射率的梯度所引起的球面像差以及如果必要还有散焦，那么需要第三调设元件。
优选地不仅给用户各自提供来自一个迭代步骤的截面图，而且也提供连续的迭代步骤的截面图，从而用户可以通过比较确定：是否新的调设参数的确定及其应用已经促成像差校正相比于在更早的步骤中所应用的像差校正实现改善。用户那么此外可以容易地得知：是否例如在某一轴向子区域中出现改善，而在另一子区域中没有出现改善。如果例如在中间的轴向区域中实现好的校正，而在之上和之下的轴向区域中没有，那么用户例如可以特别是为像差校正斜度确定新的值。通过对于不同的像差校正斜度、但是相同的像差校正偏移值的图像的比较，用户可以推断出：参考平面各自位于何处。
同样可以自动化地实施该方法。只要利用各平截面图，为了评估图像质量可以利用每个品质标准，该品质标准也适用于评估对于垂直于光轴定向的平截面图的质量。由现有技术例如已知的是，利用图像亮度或图像对比度。同样在现有技术中已知的是用于应用这种品质标准的迭代方法，如果标准本身不允许决定：在何种意义上、亦即是否必须将校正参数改变到更大或更小的值，那么品质标准自身能实现找到好的调设。
该方法有利地可以用于使用共焦的荧光显微镜的共焦荧光显微技术中。属于该方法的还有如下方法，在该方法中实现通过单光子吸收的激励。荧光发射那么在比激励波长更大的波长下实现，其中发射波长与激励波长仅仅具有微小区别。对于这种类型的荧光显微技术，提供和典型地利用消色差的物镜、亦即这种物镜，该物镜关于其在典型的激励与发射波长之间的纵向色差与横向色差方面是良好校正的。因此，在反射光下的共焦荧光显微技术的情况下，良好地校正激励光束的像差的校正以相应的方式促成探测或发射光的像差的良好的校正。用于调整用于相对于在样本中聚焦的激励光束进行共焦探测的探测光路的方法是已知的。该方法原则上也可以用于在两个光路中存在像差的情况下。这种调整的实施在此成为前提。
在利用这种共焦的荧光显微镜实施按照本发明的方法的情况下现在适用如下：如果照明实现差的校正，那么在焦点平面中的如下区域——在该区域中激励荧光——大，而激励强度比较小。在激励光路中的差的校正因此导致弱对比和不清晰的图像。只要用于激励和探测的焦点位置准确地或者良好近似地重合，那么这无论如何适用。如果应用消色差的物镜，且如果同时像差校正函数的调设参数也用于在探测光路中的校正机构，那么满足该条件。通过特别简单的方式如下实现相同校正参数应用在两个光路中，其方法是在两个光路径中利用同一个校正机构，亦即其中校正机构放置在一个共同的激励和探测路径中。对于如下情况，即色差、特别是在激励与探测波长之间的纵向色差的校正不足够，那么可以提前确定该纵向色差。至少对于其折射率不或者仅仅弱地与波长具有关系的样本那么可能的是，通过计算确定：如何必须利用在样本中焦点的轴向位置相互间相对地校正激励路径和探测路径，以便引起：激励与探测焦点重合。那么可以各自根据像差校正函数的调设参数的确定对于激励路径选择在探测路径中对校正机构的对应的调设；只要在共同的激励和探测路径中放置共同的校正机构，那么附加地在路径中的仅仅之一中、优选地仅仅在探测路径中放置另一校正机构，如此对应地调设该另一校正机构，使得实施基于色差必要的剩余校正。通常，在共焦荧光显微技术的范围中但是足够的是，在激励和探测路径中利用同样的调设或同样的校正机构。虽然可考虑且很可能的是，在相应的射束横截面上的强度分布对像差校正的影响导致在激励校正与探测校正的品质之间的偏差，但是过去按照经验的检验结果示出：该偏差不是主要的。
该方法此外可以有利地用于STED显微技术(STED：受激发射损耗)以及另外的超分辨显微技术方法，亦即纳米显微方法，其中应用一种类型的关断光(Ausschaltlicht)或荧光阻止光，其确保：荧光仅仅可以由环绕焦点相比于限制衍射的一般的激励点那么大更小的位置区域发射。在没有一般性限制的情况下，在下文中一般涉及STED显微技术，其中关断光或荧光阻止光是所谓的耗损光(Depletionslicht)。在STED显微技术的应用中，耗损光的波长在多数情况下仅仅略大于荧光发射的波长。通常应用如下物镜，该物镜对于由激励直至耗损波长的整个范围关于色差是良好校正的。由此，用于像差校正函数的调设参数良好近似地也可用于在耗损光路中的像差校正。因此可能的是，如此实施按照本发明的方法，其方法是已经在如果必要迭代的过程期间共同利用激励和耗损光用于确定调设参数。在激励和耗损光路径中对调设参数的这种利用最简单地可由此实现，即将校正机构放置在一个共同的光路径中。总体上最有利的是，将校正机构放置在一个对于激励光、耗损光和探测共同的路径中。不仅关于可校正的像差、亦即例如具有或没有散焦的校正、关于对于球面像差的模型、借助于视觉检查或作为自动方法的可执行性以及关于另外的方面、例如补偿在激励与探测波长之间的色差的可能性，如上所述内容也适用于具有激励和耗损光的共同利用的方法。因此但是也可能的是，首先借助于共焦的显微技术实施按照本发明的方法，且紧接着将获取的调设参数也用于耗损光束。后者无论如何在如下情况下是优选的，即如果调设参数根据样本的感兴趣的区域——用户想要显微检查该感兴趣的区域——的截面图实现，因为在该后者的方法中给样本仅仅施加激励光而不附加地施加耗损光，且因此样本不怎么变白。
但是，在STED显微技术中此外应注意的是，测量的图像质量、例如关于亮度、对比度和图像清晰度方面相比于激励焦点的品质更大程度上与耗损焦点的品质有关。此外，应注意的是，STED显微技术的分辨率显著高于共焦荧光显微技术的分辨率。这表示：足以确保借助于共焦荧光显微技术的高图像质量的像差校正未必足以确保STED图像的高质量。这例如表示：在共焦显微技术中不具有相关影响的色差在STED显微技术中大幅不利地产生影响。因此，有意义的是，利用在利用激励和耗损光的情况下的按照本发明的方法，以便对于校正机构利用像差校正函数的调设参数，该校正机构作用于耗损光束、但是不作用于探测光束。这也是可能的且在多种情况下可简单实现。在现有技术中已经已知如下显微镜，其中对于STED焦点、例如圆环(Donuts)的构成必要的波前成形通过可调节的波前调制器进行。在现有技术中(参见文献WO 2014 029978A1)也已知如下方法，其中根据垂直于光轴定向的截面图实施这种校正。
在用于确定用于像差校正函数的调设参数的方法的实施中对于仅仅耗损光实现：-i)通过利用聚焦的激励光分布和如此聚焦的耗损光分布——使得该耗损光分布在激励焦点的中间具有局部最小值——在与显微物镜的光轴平行的截面中扫描该样本采集与显微物镜的光轴平行的第一截面图，其中借助于可调设的校正机构、按照像差校正函数的最终的调设参数校正激励光分布，且借助于可调设的校正机构、按照用于耗损光的附加的像差校正函数的初始调设参数校正耗损光分布，其中在每个扫描位置探测从样本发射的荧光；或者采集第一数量的这种截面图；-ii)分析处理第一截面图或第一数量的这种截面图；-iii)确定附加的像差校正函数的新的调设参数。
只要已经可以在该步骤中确定附加的像差校正函数的最终的调设参数，紧接着实现借助于STED显微技术检查样本或另一相应的样本。否则，首先重复实施上述步骤，其中各自新的调设参数代替附加的像差校正函数的初始调设参数，直至确定最终的调设参数。
通常在STED显微技术中——只要其中实现激励作为单光子激励——实施共焦的探测，例如使用共焦的遮光物。在确定附加的像差校正函数的调设参数之前因此应对于激励光并相应地对于探测光确定像差校正函数的调设参数。如果应用该调设参数，那么确保：激励焦点与探测焦点在所有轴向位置上重合。在附加的像差校正函数的调设参数的确定中，现在为了获得完全的利用，必须校正不仅相对于激励焦点并特别是探测焦点的散焦而且还有球面像差。所属的校正函数此外可以相应于如上所述的校正函数，相应地可以确定所属的调设参数。
但是也可以出现如下情况，其中不必以相同程度的校正克服散焦和球面像差，因为正是必须将耗损焦点移动到探测焦点，探测焦点在校正之后也非强制位于在未得到形成的像差的耗损焦点将位于的地方。在这些条件下，那么附加的像差校正函数的调设参数的确定可以如下实现，使得首先寻找仅仅用于校正散焦而非球面像差的调设参数，且仅仅紧接着寻找用于校正球面像差的另一调设参数。这表示，用于校正通过偶数级的径向对称的泽尼克多项式可表示的像差的调设参数的数量必须翻倍；或者无论如何在该调设参数的数量翻倍时可以实现良好的校正。因为即使耗损焦点是异常的，也可以由截面图得知：何时散焦是校正的；且如果散焦是校正的，那么可以由截面图得知，是否焦点是异常或校正的。如此似乎首先对于所有轴向位置将差的耗损焦点移动到正确的位置，且随后紧接着改善放置在正确的位置上的焦点。这与如下无关地是可能的，即是否多个或单个校正机构对于激励光和探测光校正相应的散焦。而且在如下情况下，即在散焦校正与球面像差校正之间的严格的分离是不可能的，因为将不实施为此必要的校准或建模，可以至少迭代地实现良好的校正，因为通常在用于激励光的像差校正函数的之前获取的校正参数应用到耗损光束上的应用中仅仅弱地移动焦点，且焦点是弱异常的。
本发明此外有利地可用于多光子荧光显微技术中。如果在厚的样本上实施该方法，那么通常不共焦地探测。图像质量那么仅仅或无论如何非常主要地与激励焦点的质量有关。按照本发明的方法对此可以基本上以与在共焦的荧光显微技术中的应用中同样的方式和方法实现，其中省去对于探测路径实施像差校正的必要性。对此，在激励波长与探测波长之间的色差通常是不重要的。在特别的情况下，自然也在多光子荧光显微技术中、共焦地或者利用位于在共焦平面中的位置分辨的探测器实现探测。在这种情况下，例如可以首先实现在除去或完全打开的共焦的遮光物的情况下对于激励光确定像差校正函数的调设参数，且紧接着实现对于探测光路确定另一像差校正函数的调设参数。
本发明原则上也可以用于这种显微技术，其中将多光子激励与耗损光的应用组合。
本发明此外可以用于改善MINFLUX显微技术。在此，该方法可在利用MINFLUX激励波长和实施通常的共焦成像的情况下实施用于寻找调设参数。像差校正函数的由此获得的调设参数那么可用于MINFLUX方法的实施。
三维图像的荧光显微图像采集的进一步改善由此实现，其方法是依次采集样本的多个垂直定向的、亦即平行于显微物镜的光轴且相互平行的截面图，其中图平面沿垂直于光轴的方向相互间隔。体积数据集(Volumendatensatz)那么由垂直定向的截面图的堆产生。这种类型的图像数据获取相比于获取作为水平定向的截面图的堆的体积数据集具有如下优点：图像数据沿光轴的方向具有局部平均的图像亮度的更小的梯度。这具有其原因在于，垂直于光轴定向的、亦即水平定向的平面在应用这种类型的图像数据获取的情况下直至如下时刻——在该时刻对于这种平面的样本部分体积获取图像数据——相互间成比例地更均匀地变白。如果采集水平定向的图像且将其组合为图像堆，那么第一平面的如下子体积(Teilvolumina)——对此子体积采集图像数据，在没有一般性限制的情况下在此称为最上的平面——直至图像数据获取的时刻不变白或仅仅非常少地变白，而如下平面的子体积在采集所有之前的平面的情况下变白。因为激励光束在焦点之前和之后相比于在焦点处进一步扩展，所以激励光束不仅使得在激励光束的轴上的荧光团(Fluorophore)变白，而且也有在几乎锥形沿轴延伸的区域中。直至如下时刻——在该时刻对于在此称为最小的图平面的体积中间获取图像数据——该体积因此通过光束变白，该光束用于在光轴上和环绕该光轴设置的图像点之上的数据获取。相比之下，相同的体积在采集垂直定向的图平面的情况下通过沿着水平线的扫描和各自随后的进给直至数据获取的时刻仅仅通过光束变白，该光束为了对于位于在上部或者沿垂直定向的图平面的方向相邻的体积的数据获取或者沿垂直于垂直定向的图平面的方向属于这种平面，对于该平面采集在时间上更早的图像数据。属于随后采集的垂直定向的平面的光束直至数据获取的时刻未有助于变白。对于在上平面中的图像获取相反地适用，亦即位于在上平面中间的子体积在数据获取的时刻之前相比于在从水平定向的图像堆获取体积数据集的情况下更大程度地变白。总体上，如此沿光轴的方向产生局部平均图像亮度的更小的梯度，亦即图像亮度的更好的均匀性。
更好的均匀性在如下情况下实现，即如果扫描步骤的顺序在获取垂直定向的图像的情况下在如下意义上被交换，即各自首先对于沿着光轴的体积采集图像数据，亦即沿着光轴扫描，紧接着各自是水平的扫描步骤。这进一步降低光量，该光量在对于该子体积获取图像数据之前到达位于下部的子体积。
这种类型的图像采集结合在下文中进一步描述的按照本发明的装置展示其完全的优点。三维图像数据集或体积图像的特别高的质量如此实现，即在利用按照本发明的方法确定用于校正机构的调设参数之后再应用这种类型的图像采集。实际上，但是这种类型的图像采集也可以与用于确定校正机构的调设参数的方法无关或者甚至与校正机构的存在无关地有利地得到应用。用于沿轴向方向改善图像亮度的均匀性的方法因此也可与在此所要求保护的本发明无关地应用，该方法也独立地表示一种本发明的解决方案。
上述描述在一些地方、特别是如下地方——在此涉及探测路径和照明路径的方向——基于如下情况，即激励和探测通过同样的物镜实现，亦即利用反射光照明。但是本发明不应被局限于此。而是本发明也可以应用于如下情况，即如果利用透射光装置或者例如4-Pi显微镜，例如如下，其中两个相互对置的物镜用于照明和探测。在后者情况下适合如下，对于每个单个的物镜的路径单独确定调设参数且仅仅紧接着同时利用两个路径。对于本领域内技术人员来说清楚的是：如何其可以将这些陈述——只要该陈述直接或隐含地涉及反射光中的显微技术——传递给其他显微技术装置或方法。
按照本发明的扫描荧光显微镜设立为用于实施按照本发明的方法。扫描荧光显微镜具有：用于激励光的激励光源；用于聚焦激励光的激励光分布的显微物镜；用于安装样本的机构；用于沿三个空间方向相对于安装的样本移动激励光束的机构；可调设的校正机构，用于激励光的像差校正；以及用于探测荧光的探测机构以及用于存储图像数据集的存储机构。此外，按照本发明的扫描荧光显微镜具有用于调设校正机构的控制器。再者，扫描荧光显微镜或者具有分析处理单元，其用于分析处理图像数据集且用于确定像差校正函数的新的和最终的调设参数，根据调设参数校正用于激励光的像差校正的可调设的校正机构；扫描荧光显微镜或者具有显示单元，其用于结合用于接收关于新的和最终的调设参数的确定的用户输入的输入单元显示图像数据。扫描机构构成为用于实施按照本发明的方法的第一步骤和第四步骤；且或者分析处理单元构成为用于实施按照本发明的方法的第二步骤和第三步骤，或者显示单元构成为用于显示在按照本发明的方法的第一步骤中采集的和与显微物镜的光轴平行的第一截面图。在后者情况下，按照本发明的方法的第二步骤和第三步骤由人员观测者基于显示的截面图执行，其中人员观测者进行到输入单元中的用户输入，用户输入相应于由其重新确定的调设参数。
在一个优选的实施方式中，校正机构是可变形的镜，其设置在激励光和探测光的共同的路径中。
更优选地，按照本发明的扫描荧光显微镜附加地具有耗损光源和用于形成耗损焦点的机构。优选地，可变形的镜在该情况下设置在激励光、探测光和耗损光的共同的路径中。
可变形的镜用作校正机构具有如下优点，即其光学特征与波长或偏振状态无关。可变形的镜可以除了作为校正机构之外同时也可以用于使焦点移动。因此可变形的镜能实现沿轴向方向的快速扫描。这着眼于针对图像亮度的均匀性的改善的图像采集方法也并且特别是有利的。
本发明有利的改进由权利要求和说明书产生。在此，权利要求不应如下理解，即仅仅这种内容、装置或方法——其除了独立权利要求1、14和15的特征之外各自仅仅具有一个从属权利要求的所有特征或者不具有一个从属权利要求的任何特征——可以是本发明的可能的改进。而是，另外的改进可以由在从属权利要求中或在说明书中所述的特征——该特征可以单个或累积地产生效果——中的每个单个的特征产生。
附图说明
在下文中，根据附图阐述本发明的可执行性，并进一步阐明本发明。
图1：在没有应用像差校正函数的情况下获得的通过样本的平行于荧光显微镜的光轴的截面图；
图2：在使用像差校正函数的新的非最终的调设参数的情况下获得的如图1中的相应的截面图；
图3：在使用像差校正函数的最终的调设参数的情况下获得的如图1和2中的相应的截面图；
图4：样本的体积数据集的视图；
图5：按照本发明的方法的第一实施方式的流程图；
图6：按照本发明的方法的第二、迭代的实施方式的流程图；
图7：按照本发明的方法的第三、同样迭代的实施方式的流程图；以及
图8：按照本发明的扫描荧光显微镜的一个实施方式的方框图。
具体实施方式
在图1中示出样本的截面图。该采集作为平行于共焦的激光扫描荧光显微镜的物镜的光轴的平截面实现。沿轴向方向的扫描通过物镜的移动实现。在图像中检测如下区域，该区域沿轴向方向延伸大约140μ米。上图像边缘大约相应于盖玻片的位置。所使用的显微镜在激励和探测路径的公共部段中具有可变形的镜。在轴向扫描期间根据初始调设参数调设该镜。可见的是，特别是靠近下图像边缘的结构显得不清晰，但是靠近上图像边缘的结构也显得不清晰。
在图2中示出同一样本的另一相应地采集的截面图。在轴向扫描期间实现利用新的调设参数对波前的校正，其中基于第一截面图的视觉检查来确定该新的调设参数。可见的是，不仅靠近上图像边缘而且靠近下图像边缘的结构更清晰地显示。此外，在比较图1与图2时可见的是，特别是靠近下图像边缘的结构在第二图像中相比于在第一图像中显得更移近上图像边缘。对此在下文中还将进一步探讨。
在图3中示出同一样本的另一相应地采集的截面图。在轴向扫描期间实现利用新的调设参数对波前的校正，其中基于第二截面图的视觉检查来确定该新的调设参数。紧接着在采集第三截面图之后将该调设参数确定为最终的调设参数。可见的是，不仅靠近上图像边缘而且靠近下图像边缘的结构进一步更清晰地显示，且这两个区域中的图像清晰度类似地好。相比于第二图像，现在不仅在上图像边缘上的结构而且在下图像边缘上的结构显得更移近上图像边缘。对此在下文中还将进一步探讨。
示出的数据涉及实际的按照经验的数据。也就是说，实际上在一个过程中利用视觉检查通过两个分析处理和确定步骤实现如下校正，该校正促成图像质量的非常显著的改善。这仅仅在第三步骤中被检验。在本申请人工作的范围中还实施过另外的校正过程，在这些校正过程中已经证实：利用少量步骤就能实现非常好的校正。
在图4中示出另一样本的体积数据集。该图像区域检测样本的如下区域，该区域沿轴向方向延伸大约50μ米。该样本的扫描在应用像差校正的情况下实现。在图像中可见的是，在整个区域中的图像清晰度沿着光轴大约保持相同。
在图1至3中可见的移动在该方法的实际实现中具有其原因。如上所述，确定的像差可通过偶数级的径向对称的泽尼克多项式表达。泽尼克多项式在单位圆上形成一组正交函数。这表示，具有在其横截面上一致的强度的平面波前在其不同的、各自通过确定的泽尼克多项式可描述的像差方面的校正可相互无关地进行。换言之：散焦是可校正的，而无需校正另一球面像差，且反之亦然。但是实际上，只有当波前在其横截面上的强度是恒定的情况下，才严格满足该条件。在此可能的是，在波动光学上平均的场强的恒定性是决定性的，但是如果该平均的场强是恒定的，那么强度也是恒定的。对于进一步的考虑这是无所谓的。
波前的校正可通过简单的方式实现，其方法是利用可变形的镜。替换地也可以利用作为SLM已知的、基于液晶技术的波前调制器。而且，镜或SLM和变焦透镜或可移动透镜的组合也是可考虑的，其中光学透镜元件主要适用于使焦点移动。在此，可变形的镜应用在对于激励和探测共同的光路中，该光路以小的角度、亦即几乎垂直地由波前加载且反射该波前。该镜现在被如此变形，使得形状相应于偶数级的径向对称的泽尼克多项式的和，其中不应用散焦项。因为该镜同时也放置在探测光路中，所以用于激励光路的校正也直接用于探测光路。在理想情况下，亦即在如下条件下——即波前在其横截面上的强度是恒定的，通过镜引起的波前修改仅仅具有如下效果，即改善焦点，但不改变其位置。为了实现这一点，此外必须提出的是，可变形的镜放置在与返程孔径(Rückapertur)共轭的平面中，且按照泽尼克多项式变形的面的图像正好填充该返程孔径。后者条件以非常好的近似被满足，其方法是可变形的镜的轴定位在这种与返程孔径共轭的平面中，且其方法是较小地选择如下角度——在该角度下所述镜由波前加载，且其方法是也是使用和变形所述镜的正好一个面，该面成像到所述返程孔径中。这即使在物镜并且从而返程孔径移动的情况下也以良好的近似适用，该移动结合样本的轴向扫描实施，因为该移动相比于焦距非常小。
移动的原因现在在于，所使用的激励光束恰恰不具有在横截面上恒定的强度，而是相应于高斯分布。由此违背泽尼克多项式相互间的正交性。结果是，如在图1至3中可见的那样，波前调制的施加——其在理想情况下不校正散焦、而是仅仅校正球面像差——也使焦点移动。但是同时根据附图可知的是，即便如此仍能实现好的校正。由此，附图同时证明：关于激励光和探测光在返程孔径和与之共轭的平面中的不同强度分布的可能存在的效果足够小，从而用于激励光束的像差校正应用到探测光上促成良好的校正。只需要考虑的是，在轴向方向上，图像视校正而定被拉长或压缩。在示出的示例中，图像在校正之后被压缩。如果样本是均匀的，那么该效应的干扰很微小且可容易地被校正。如果样本如此不均匀，使得在不同的横向位置上通过偶数级的径向对称的泽尼克多项式可表示的像差的不同校正是必要的，那么这导致：在同一平面内垂直于光轴的各点可以在体积图像中显得轴向错位。该效应在多种很多情况下小到可忽略不计。如果该效应大，那么这由确定的校正参数已知，从而可考虑该效应。
图5是按照本发明的方法的第一实施方式的流程图。在第一步骤中实现通过利用聚焦的激励光分布扫描样本采集与光轴平行的截面图，其中按照像差校正函数的初始调设参数校正该激励光分布。由此例如获得图1的截面图。在紧接着的步骤2中实现该截面图的分析处理。在步骤3中随后实现确定像差校正函数的新的调设参数，以便尽可能完全消除根据截面图还确定的像差。利用该新的调设参数随后在步骤4中实现通过扫描来采集另外的图像数据。于是，在该步骤4中例如可以采集图3的截面图。
图6是按照本发明的方法的第一迭代的实施方式的流程图。在此，紧接着步骤3中新的调设参数的确定进行检验：新的调设参数是否是最终的。如果是，那么在步骤4中实现采集另外的图像数据。假如新的调设参数还不是最终的，因为例如相对于更早的调设参数的变化还非常大，那么重复步骤1至3。
图7同样是按照本发明的方法的迭代的实施方式的流程图。在此，紧接着步骤2中的分析处理实现检验：利用像差校正函数的初始调设参数是否已经足够校正所有像差。仅仅当不是这种情况下，在步骤3中确定新的调设参数，且随后由此重复步骤1和2。只有当在在步骤2中的分析处理中确定：像差是足够校正的时，才利用完全经像差校正的激励光分布进行步骤4、亦即采集另外的图像数据，该图像数据是原本感兴趣的图像数据。而且，在按照本发明的方法的该迭代实施方式中，只要在步骤3中确定了新的调设参数，哪怕只有一次，第一步骤1、第二步骤2、第三步骤3和第四步骤4就以该顺序依次进行。然而，在实施第四步骤之前，紧接着是第一步骤1和第二步骤2的重复。
图8示出按照本发明的扫描荧光显微镜5的一个实施方式的方框图。激励光源6提供激励光。显微物镜8将激励光7的激励光分布聚焦到样本9中。样本9安装在机构10上。机构10的样本支架11相对于具有在此标明为压电堆的执行器13的底座12沿显微物镜8的光轴的z方向是可移动的。替换或附加地，显微物镜8也可以沿z方向是调设或移动。用于沿所有三个空间方向以聚焦的激励光分布扫描样本的扫描机构14此外包括x/y扫描器15。探测机构16用于对于在样本9中聚焦的激励光分布的每个扫描位置探测从样本发出的荧光17。存储机构18用于存储图像数据集，该图像数据集通过组合器19由扫描器15和执行器13的位置和探测机构16的所属的输出信号组合。可调设的校正机构20设定为，用于校正样本9中激励光分布的像差。为此可以调设利用校正机构实现的像差校正函数的参数。像差校正函数是在样本9中聚焦的激励光分布的z位置的函数、亦即聚焦的激励光分布沿着显微物镜8的光轴的位置。校正机构20包括可变形的镜21。为了调设校正机构20设有控制器22。该控制器由分析处理机构24获得用于像差校正函数的调设参数23。分析处理单元24分析处理按照本发明的方法采集的和平行于显微物镜8的光轴延伸的截面图的图像数据集，以便自动确定调设参数23。替换地可以基于显示在显示单元25上的截面图实现手动确定，确切地说通过替换或附加地存在的另一控制器26，该另一控制器具有输入单元27，在此包括两个滑动调节器28和29用于调设像差校正函数的两个调设参数。校正机构20设定在激励光7和荧光17的共同的路径中，确切地说在样本9与分束器30之间，该分束器用于将荧光17输出耦合至探测机构16。在此，校正机构20也位于耗损光源32的附加的耗损光31、例如STED光的路径中，该耗损光借助于分束器33与激励光7结合。另一校正机构34仅仅设置在耗损光31的路径中，且可以除了特别是耗损光31的像差校正之外也设定为用于有目的地如此形成耗损光31的波前，使得耗损光31例如具有在激励光分布的中间强度最大值的位置的局部的强度最小值。
