SAFit2、培养基在促进人源诱导型多能干细胞向多巴胺能神经元分化中的应用

safit2、培养基在促进人源诱导型多能干细胞向多巴胺能神经元分化中的应用
技术领域
1.本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及safit2、培养基在促进人源诱导型多能干细胞向多巴胺能神经元分化中的应用。


背景技术：

2.现阶段针对人的神经精神类疾病的研究方法有限，主要原因是难以获得正常人及患者的神经细胞样品，仅极少数研究来源于患者尸检的神经细胞。但是，由于物种进化水平的差异，动物与人之间无保守性的基因缺陷无法建立对应的动物模型，且动物模型不能理想地反应人疾病的症状和病理变化本质，导致大多动物实验中有治疗效果的药物在临床前试验中因药物不良的安全性和有效性而以失败告终。因此，寻找合适的人源化的细胞模型一直是医药科学领域的关注的重点和解决的难点。
3.国际上的几个研究团队已成功建立人类胚胎干细胞(hesc，human embryonic stem cells)向多巴胺能神经元分化的方案。使用此方案于人诱导型多能干细胞(human inducedpluripotency stem cells，hipsc)向多巴胺能神经元分化，仅获得1.5～33％的th(酪氨酸羟化酶)阳性的多巴胺能神经元。与hesc相似，hipsc经诱导后可获得个体特异性的三个胚层的多种细胞类型，但细胞来源充分且无伦理学障碍，具有更为好的应用前景。因此，迫切需要开发有效的策略使hipsc高效且快速分化为多巴胺能神经元。safit2影响多巴胺神经元分化至今国内外未见相关报道。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供safit2、培养基在促进人源诱导型多能干细胞向多巴胺能神经元分化中的应用。本发明所述safit2能够促进hipsc高效分化为多巴胺能神经元。
5.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
6.本发明提供了safit2在促进人源诱导型多能干细胞向多巴胺能神经元分化中的应用。
7.本发明提供了一种促进人源诱导型多能干细胞向多巴胺能神经元分化的组合物，所述组合物包括safit2。
8.本发明一种促进人源诱导型多能干细胞向多巴胺能神经元分化的培养基，所述培养基包括含safit2的dap分化培养基和含safit2的dan分化培养基。
9.优选的，所述括含safit2的dap分化培养基和含safit2的dan分化培养基中safit2的浓度分别为0.01～10μm。
10.优选的，所述含safit2的dap分化培养基以dmem/f-12培养基和神经基础培养基为基本培养基，还包括n2补充剂、不含维生素a的b27补充剂、抗坏血酸、盐酸多索啡、sb431542、嘌呤吗啡胺和chir99021。
11.优选的，所述n2补充剂的添加体积为基本培养基体积的1％，不含维生素a的b27补
充剂的添加体积为基本培养基体积的2％；所述含safit2的dap分化培养基中抗坏血酸的浓度为1～1000mm，盐酸多索啡的浓度为0.1～10μm，sb431542的浓度为0.1～20μm，嘌呤吗啡胺的浓度为3～4μm，chir99021的浓度为0.8～1.6μm。
12.优选的，所述含safit2的dan分化培养基以神经基础培养基为基本培养基，还包括b27补充剂、脑源性神经营养因子、胶质细胞系源性神经营养因子、转化生长因子β3、抗坏血酸、db-camp和dapt。
13.优选的，所述b27补充剂的添加体积为基本培养基体积的2％；所述含safit2的dan分化培养基中脑源性神经营养因子的浓度为5～50ng/ml，胶质细胞系源性神经营养因子的浓度为5～50ng/ml，转化生长因子β3的浓度为0.1～5ng/ml，抗坏血酸的浓度为1～1000mm，db-camp的浓度为0.1～5mm和dapt的浓度为0.1～10μm。
14.本发明提供了上述技术方案所述培养基在促进人源诱导型多能干细胞向多巴胺能神经元分化的应用。
15.本发明提供了一种促进人源诱导型多能干细胞向多巴胺能神经元分化的方法，包括以下步骤：
16.将人源诱导型多能干细胞接种于含safit2的dap分化培养基中分化培养，得多巴胺能神经元祖细胞；
17.将所述神经元祖细胞接种于含safit2的dan分化培养基中分化培养，得多巴胺能神经元。
18.有益效果：
19.本发明提供safit2在促进人源诱导型多能干细胞(hipsc)向多巴胺能神经元高效分化中的应用。safit2为fkbp5(fk506结合蛋白5重组蛋白)的高选择性抑制剂，而fkbp5是多个蛋白的分子伴侣，参与多条细胞信号通路以调节细胞发育和功能，同时fkbp5与葡萄糖摄取的pkb(蛋白激酶b)的底物as160(akt丝氨酸/苏氨酸激酶160)相关联，调节糖代谢和能量代谢。fkbp5与核内转录因子ikkα(核因子κb抑制物激酶α)、ikkε(核因子κb抑制物激酶ε)、mapk(map激酶)等结合，调节细胞的增殖、存活、分化过程。fkbp5可与cdk(周期蛋白依赖性激酶)1/4/9/11a等相互作用，异构化tau(微管相关蛋白)并促进微管聚合，参与细胞骨架形成和微管的折叠，在调节神经细胞结构和功能方面发挥着重要作用。本发明实施例结果表明：添加safit2的培养基能够显著提高th(酪氨酸羟化酶)阳性细胞比例及提高th基因和蛋白的表达水平。由此可见，本发明所述safit2能够用于促进hipsc向多巴胺能神经元高效分化。
20.另外，本发明提供了促进hipsc向多巴胺能神经元高效分化的培养基，其中，嘌呤吗啡胺能够作为shh信号通路的激活剂，chir99021能够作为gsk3b通路抑制剂，这两个通路在胚胎时期协同作用促进中脑多巴胺能神经元发育。n2补充剂、不含维生素a的b27补充剂、b27补充剂、脑源性神经营养因子、胶质细胞系源性神经营养因子、转化生长因子β3为神经生长提供营养，抗坏血酸、db-camp和dapt等可发挥促进细胞分化，抑制细胞增殖作用。
21.通过将各个组分和用量的调控下，进一步保证促进hipsc向多巴胺能神经元分化的速度，具有高效的优势。
附图说明
22.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
23.图1为dap分化培养基中嘌呤吗啡胺(pm)浓度的优化；
24.图2为dap分化培养基中chir9901(ch)浓度的优化；
25.图3为hipsc分别在含有safit2的dap分化培养基和不含safit2的dap分化培养基中分化培养，在分化培养第1～11天的情况，其中标尺为50μm，d1、d3、d5、d7、d11分别为分化后第1天、第3天、第5天、第7天、第11天；
26.图4为hipsc分别在含有safit2的dap分化培养基和不含safit2的dap分化培养基分化培养16天后，多巴胺能神经元祖细胞(dap)特异性标志foxa2蛋白的表达染色图，其中标尺为50μm；
27.图5为hipsc向dap诱导后，所得多巴胺能神经元祖细胞特异性基因表达情况，以组成性表达的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)基因为内参，特异性基因相对表达量用特异性基因mrna表达量与gapdh基因的mrna表达量的比值mrna/gapdh表示；
28.图6为在含有safit2的dan分化培养基和dap分化培养基培养后得到多巴胺能神经元(dan)，多巴胺合成过程中的限速酶aadc和th的染色图及阳性比例图，其中a为多巴胺合成过程中的限速酶的染色图，b为收集培养第43天得到的细胞中的aadc和th比例图，aadc为芳香族氨基酸脱羧酶，th为酪氨酸羟化酶，dapi为二盐酸盐染色以显示细胞核的位置，merge图为三种荧光图片的叠加，以显示细胞中蛋白表达和细胞核的位置关系；
29.图7为hipsc诱导分化过程中培养基中加入safit2培养后和hipsc诱导分化过程中培养基中不加safit2培养后，多巴胺能神经元特异分子th、aadc、nurr1和vmat2的基因表达情况，以组成性表达的gapdh基因为内参基因，特异性基因相对表达量用特异性基因mrna表达量与gapdh的mrna表达量的比值mrna/gapdh表示，th为酪氨酸羟化酶，aadc为芳香族氨基酸脱羧酶，nurr1为nur相关因子1，vmat2为囊泡单胺转运蛋白2；
30.图8为hipsc诱导分化过程中培养基中加入safit2培养后和hipsc诱导分化过程中培养基中不加safit2培养，th蛋白表达情况，其中a为免疫印迹试验检测结果，th为酪氨酸羟化酶，gapdh为内参蛋白，th蛋白的相对表达量用th蛋白的表达量与组成性gapdh的蛋白表达量的比值th/gapdh表示。
具体实施方式
31.如无特殊要求，本发明所用组分均为本领域技术人员常规购买所得即可。
32.本发明提供了safit2在促进人源诱导型多能干细胞(hipsc)向多巴胺能神经元分化中的应用。在常见诱导培养多巴胺能神经元配方中加入小分子化合物safit2(mce-hy102080)，大大提高了hipsc向多巴胺能神经元分化的效率。本发明实施例结果表明：添加safit2的培养基能够显著提高th(酪氨酸羟化酶)阳性细胞的比例，及提高th基因和蛋白的表达水平。由此可见，本发明所述safit2能够用于促进hipsc向多巴胺能神经元高效分化。
33.本发明提供了一种促进人源诱导型多能干细胞向多巴胺能神经元分化的组合物，所述组合物包括safit2。
34.本发明提供了一种促进人源诱导型多能干细胞向多巴胺能神经元分化的培养基，
所述培养基包括含safit2的dap(多巴胺能神经元祖细胞)分化培养基和含safit2的dan(多巴胺神经元)分化培养基。在本发明中，所述括含safit2的dap分化培养基和含safit2的dan分化培养基中safit2的浓度分别优选为0.01～10μm，进一步优选为0.1～8μm，更优选为0.5～5μm，最优选为1μm。
35.在本发明中，所述含safit2的dap分化培养基以dmem/f-12培养基和神经基础培养基(neuralbasal培养基)为基本培养基，优选还包括n2补充剂、不含维生素a的b27补充剂、抗坏血酸(vc)、盐酸多索啡(dorsomorphindihydrochloride，dm)、sb431542、嘌呤吗啡胺(purmorphamine)和chir99021。本发明对所述dmem/f-12培养基、神经基础培养基、n2补充剂、不含维生素a的b27补充剂、抗坏血酸、盐酸多索啡、sb431542、嘌呤吗啡胺和chir99021来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规购买所得即可。在本发明具体实施例中，所述dmem/f-12培养基优选购自gibco，货号为11320033，神经基础培养基优选购自gibco，货号为21103049，盐酸多索啡优选购自sigma，chir99021优选购自tocris。
36.在本发明中，所述含safit2的dap分化培养基中dmem/f-12培养基和神经基础培养基的体积比优选为1:1；所述n2补充剂的添加体积优选为基本培养基体积的1％，不含维生素a的b27补充剂的添加体积优选为基本培养基体积的2％。
37.在本发明中，所述含safit2的dap分化培养基中抗坏血酸的浓度优选为1～1000mm，进一步优选为10～900mm，还优选为100～700mm，更优选为150～500mm，最优选为200mm；所述盐酸多索啡的浓度优选为0.1～10μm，进一步优选为1～9μm，还优选为2～8μm，更优选为3～7μm，最优选为5μm；所述sb431542的浓度优选为0.1～20μm，进一步优选为2～18μm，还优选为4～16μm，更优选为6～14μm，最优选为10μm；所述嘌呤吗啡胺的浓度优选为3～4μm，更优选为3μm；所述chir99021的浓度优选为0.8～1.6μm。
38.在本发明中，所述含safit2的dan分化培养基以神经基础培养基为基本培养基，优选还包括b27补充剂、脑源性神经营养因子、胶质细胞系源性神经营养因子、转化生长因子β3、抗坏血酸、db-camp和dapt。本发明对所述神经基础培养基、b27补充剂、脑源性神经营养因子、胶质细胞系源性神经营养因子、转化生长因子β3、抗坏血酸、db-camp和dapt的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规购买所得即可；在本发明具体实施例中，所述脑源性神经营养因子优选购自bdnf，货号为peprotech 450-02-100，胶质细胞系源性神经营养因子优选购自gdnf，货号为peprotech 450-10-100，转化生长因子β3(tgf-β3)，购自gdnf，货号为peprotech 100-36e-100，抗坏血酸购自sigma，货号为1043003，db-camp购自sigma，货号为d0627，dapt购自sigma，货号为：d5942。
39.在本发明中，所述含safit2的dan分化培养基中b27补充剂的添加体积优选为基本培养基体积的2％；所述含safit2的dan分化培养基中脑源性神经营养因子的浓度优选为5～50ng/ml，进一步优选为10～40ng/ml，更优选为15～30ng/ml，最优选为20ng/ml；所述胶质细胞系源性神经营养因子的浓度为5～50ng/ml，进一步优选为8～40ng/ml，更优选为11～30ng/ml，最优选为20ng/ml；所述转化生长因子β3的浓度为0.1～5ng/ml，进一步优选为1～4.5ng/ml，更优选为1～3.5ng/ml，最优选为1ng/ml；所述抗坏血酸的浓度优选为1～1000mm，进一步优选为10～900mm，还优选为100～700mm，更优选为150～500mm，最优选为200mm；所述db-camp的浓度优选为0.1～5mm，进一步优选为0.2～4.3mm，更优选为0.4～3.7mm，最优选为0.5mm；所述dapt的浓度优选为0.1～10μm，进一步优选为0.4～4.3μm，更优
选为1.3～3.6μm，最优选为2.5μm。
40.本发明提供了上述技术方案所述培养基在促进人源诱导型多能干细胞向多巴胺能神经元高效分化的应用。本发明采用含safit2的培养基能够显著提高th(酪氨酸羟化酶)阳性细胞的比例及提高th基因和蛋白的表达水平。
41.本发明提供了一种促进人源诱导型多能干细胞向多巴胺能神经元高效分化的方法，包括以下步骤：
42.将人源诱导型多能干细胞(hipsc)接种于含safit2的dap分化培养基中分化培养，得多巴胺能神经元祖细胞(dap)；
43.将所述多巴胺能神经元祖细胞接种于含safit2的dan分化培养基中分化培养，得多巴胺能神经元(dan)。
44.本发明将人源诱导型多能干细胞接种于含safit2的dap分化培养基中分化培养，得多巴胺能神经元祖细胞(dap)。本发明所述含safit2的分化培养基已经在前面进行了详细的描述，在此不作赘述。在本发明中，所述分化培养的温度优选为37℃；所述分化培养的时间优选为分化5～30天，进一步优选为7～25天，还优选为9～20天，更优选为15～20天。在本发明中，所述分化培养优选在培养皿中进行；所述分化培养时，以培养皿的底面积计，人源诱导型多能干细胞的接种密度优选为优选(0.5～5)
×
105个/cm2，进一步优选为(0.6～4)
×
105个/cm2，还优选为(0.7～3)
×
105个/cm2，更优选为(0.6～4)
×
105个/cm2，最优选为1
×
105个/cm2。
45.在人源诱导型多能干细胞接种前，本发明优选对人源诱导型多能干细胞进行细胞消化；所述细胞消化时，采用的细胞消化液优选为accutace。在本发明中，所述细胞消化优选在培养基中进行；所述细胞消化时，以培养皿的底面积计，所述细胞消化液的用量优选为0.1～0.3ml/cm2；所述细胞消化的时间优选为1～5min；所述细胞消化的温度优选为37℃。
46.所述细胞消化后，本发明优选收集细胞消化后所得细胞。在本发明中，所述收集优选采用dmem/f-12培养基收集。
47.本发明所述收集后，本发明优选对收集所得细胞进行离心；离心所得细胞团为人源诱导型多能干细胞。在本发明中，所述离心的转速优选为1000rpm，时间为5～10min，进一步优选为6～9min，更优选为7～8min。
48.本发明对所述人源诱导型多能干细胞的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员常规所得即可。在本发明具体实施例中，所述人源诱导型多能干细胞购买于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库(https://www.cellbank.org.cn/)，货号为dyr0100。
49.所述分化培养后，本发明还优选对多巴胺能神经元祖细胞进行细胞消化；所述细胞消化时，采用的细胞消化液优选为accutace。在本发明中，所述细胞消化优选在培养基中进行；所述细胞消化时，以培养皿的底面积计，所述细胞消化液的用量优选为0.1～0.3ml/cm2；所述细胞消化的时间优选为1～5min；所述细胞消化的温度优选为37℃。
50.所述细胞消化后，本发明优选收集细胞消化后所得细胞。在本发明中，所述收集优选采用dmem/f-12培养基收集。
51.本发明所述收集后，本发明优选对收集所得细胞进行离心；离心所得细胞团为离心细胞。在本发明中，所述离心的转速优选为1000rpm，时间为5～10min。
52.得多巴胺能神经元祖细胞后，本发明将所述离心细胞接种于含safit2的dan分化
培养基中分化培养，得多巴胺能神经元。在本发明中，所述分化培养的温度优选为37℃；所述分化培养的时间优选为10～100天，进一步优选为15～90天，还优选为20～80天，更优选为23～70天，最优选为25～50天；在本发明中，所述分化培养优选在培养基中进行；所述分化培养时，以培养皿的底面积计，多巴胺能神经元祖细胞的接种密度为(0.5～5)
×
105个/cm2，进一步优选为(0.6～4)
×
105个/cm2，还优选为(0.7～3)
×
105个/cm2，更优选为(0.6～4)
×
105个/cm2，最优选为1
×
105个/cm2。
53.为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的safit2在促进人源诱导型多能干细胞向多巴胺能神经元分化中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
54.实施例1
55.hipsc的培养和传代
56.hipsc为商业化购买的细胞系，购买于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库(https://www.cellbank.org.cn/)，货号：dyr0100，是将人包皮细胞诱导成诱导性多能干细胞，通过转入重编程转录因子oct4、sox2、klf4、myc而诱导建立的hipsc。细胞源于atcc网站(acs-1011
tm
)，是国际上进行hipsc研究普遍接受的细胞系。
57.按照购买细胞时的说明书，采用无滋养层方式进行细胞培养，培养基为mtesr1(stem cells公司，货号：05850)，每日全量换液，2ml/孔(6孔板)。每4天应用accutace(stem cells公司，货号：07920)消化细胞5分钟，将细胞悬液移至15毫升离心管中，1000rpm离心10分钟，将细胞沉淀1:10进行传代，即1个孔细胞传10个孔继续培养，得hipsc。
58.实施例2
59.hipsc向多巴胺能神经元分化
60.含safit2的dap分化培养基(dap分化培养基 safit2)：配制100ml培养基时，以dmem/f-12培养基(gibco，货号：11320033)和神经基础培养基(gibco，货号：21103049)为基本培养基(两种培养基按体积比1:1混合，其中dmem/f-12培养基和神经基础培养基的用量分别为47.8885ml)，还有如下组分：1ml的n2补充剂(n2补充剂和基本培养基的质量比为1:100，即按说明书添加体积比为1％)、2ml的不含维生素a的b27补充剂(不含维生素a的b27补充剂和基本培养基的体积比为1:50，即按说明书添加体积比为2％)、1ml浓度为20m的抗坏血酸(sigma，货号：1043003)、100μl浓度为5mm的盐酸多索啡(dm，购于tocris，货号：3039，)、100μl浓度为10mm的sb431542(购于tocris,货号：1614)、3μl浓度为100mm的嘌呤吗啡胺(stemgent，货号：04-0009，嘌呤吗啡胺的)、10μl浓度为8mm的chir99021(chir，购于tocris，货号：4423)和10μl浓度为10mm的safit2。
61.含safit2的dan分化培养基(dan分化培养基 safit2)：配制100ml培养基时，以96.58ml神经基础培养基为基本培养基，还有如下组分：2ml b27补充剂(b27补充剂和基本培养基的体积比为1:50)、100μl浓度为20μg/ml的脑源性神经营养因子(bdnf，peprotech450-02-100)、100μl浓度为20μg/ml的胶质细胞系源性神经营养因子(gdnf，peprotech 450-10-100)、10μl浓度为10μg/ml转化生长因子β3(tgf-β3，peprotech 100-36e-100)、1ml浓度为20m的抗坏血酸(sigma，货号：1043003)、100μl浓度为0.5m的db-camp(sigma，货号：d0627)、100μl浓度为2.5mm的dapt(sigma，货号：d5942，dapt的)和10μl浓度为10mm的safit2。
62.将实施例1得到的hipsc用accutace(stem cells公司，货号：07920)进行常规细胞消化后，其中以培养皿的底面积计，所述细胞消化液的用量为0.2ml/cm2，时间为3min，温度为37℃；采用dmem/f-12培养基收集，1000rpm离心8min，弃上清，得离心人源诱导型多能干细胞；
63.将人源诱导型多能干细胞接种于含safit2的dap分化培养基中分化培养，以培养皿的底面积计，接种密度为1
×
105个/cm2；在37℃分化后第16天，得dap。用accutace(stem cells公司，货号：07920)进行常规细胞消化后，其中以培养皿的底面积计，所述细胞消化液的用量优选为0.2ml/cm2，用dmem/f-12培养基收集细胞，1000rpm离心5分钟，弃上清，得离心细胞；
64.将上述离心细胞在细胞台盼蓝计数，在含safit2的dan分化培养基进行分化培养，37℃分化培养45天，以培养皿的底面积计，分化培养时，接种密度为1
×
105/cm2，得dan。
65.对比例1
66.不含safit2的dap分化培养基：配制100ml培养基时，以dmem/f-12培养基(gibco，货号：11320033)和神经基础培养基(gibco，货号：21103049)为基本培养基(两种培养基按体积比1:1混合，其中dmem/f-12培养基和神经基础培养基的用量分别为47.8935ml)，还有如下组分：1ml的n2补充剂(n2补充剂和基本培养基的质量比为1:100，即按说明书添加体积比为1％)、2ml的不含维生素a的b27补充剂(不含维生素a的b27补充剂和基本培养基的体积比为1:50，即按说明书添加体积比为2％)、1ml浓度为20m的抗坏血酸(sigma，货号：1043003)、100μl浓度为5mm的盐酸多索啡(dm，购于tocris，货号：3039)、100μl浓度为10mm的sb431542(购于tocris，货号：1614)、3μl浓度为100mm的嘌呤吗啡胺(stemgent，货号：04-0009)、10μl浓度为8mm的chir99021(chir，购于tocris，货号：4423)。
67.不含safit2的dan分化培养基：配制100ml培养基时，以96.59ml神经基础培养基为基本培养基，还有如下组分：2ml b27补充剂(b27补充剂和基本培养基的体积比为1:50)、100μl浓度为20μg/ml的脑源性神经营养因子(bdnf，peprotech 450-02-100)、100μl浓度为20μg/ml的胶质细胞系源性神经营养因子(gdnf，peprotech450-10-100)、10μl浓度为10μg/ml的转化生长因子β3(tgf-β3，peprotech 100-36e-100)、1ml浓度为20m的抗坏血酸(sigma，货号：1043003)、100μl浓度为0.5m的db-camp(sigma，货号：d0627，db-camp的浓度为0.5m)、100μl浓度为2.5mm dapt(sigma，货号：d5942)。
68.将实施例1得到的hipsc(人源诱导型多能干细胞)用accutace(stem cells公司，货号：07920)进行常规细胞消化后，其中以培养皿的底面积计，所述细胞消化液的用量为0.2ml/cm2，时间为3min，温度为37℃；采用dmem/f-12培养基收集，1000rpm离心8min，弃上清，得离心人源诱导型多能干细胞；接种于含safit2的mdap分化培养基中分化培养，以培养皿的底面积计，接种量为1
×
105/cm2，得dap；在分化后第20天，用accutace(invitrogen，货号：00-4555-56)进行常规细胞消化后，其中以培养皿的底面积计，所述细胞消化液的用量优选为0.2ml/cm2，用dmem/f-12培养基收集细胞，1000rpm离心5分钟，弃上清，得离心细胞；
69.将上述离心细胞在细胞台盼蓝计数，在含safit2的dan分化培养基进行分化培养，37℃分化培养15天，得中脑多巴胺能神经元dan以培养皿的底面积计，分化培养时，接种密度为1
×
105/cm2。
70.应用例1
71.不同浓度的嘌呤吗啡胺的筛选
72.处理1：dap分化培养基，嘌呤吗啡胺的浓度为0μm：配制100ml培养基时，以dmem/f-12培养基(gibco，货号：11320033)和神经基础培养基(gibco，货号：21103049)为基本培养基(两种培养基按体积比1:1混合，其中dmem/f-12培养基和神经基础培养基的用量分别为47.9ml)，还有如下组分：1ml的n2补充剂(n2补充剂和基本培养基的质量比为1:100，即按说明书添加体积比为1％)、2ml的不含维生素a的b27补充剂(不含维生素a的b27补充剂和基本培养基的体积比为1:50，即按说明书添加体积比为2％)、1ml浓度为20m的抗坏血酸(sigma，货号：1043003)、100μl浓度为5mm的盐酸多索啡(dm，购于tocris,货号：3039)、100μl浓度为10mm的sb431542(购于tocris，货号：1614)。
73.处理2：dap分化培养基，嘌呤吗啡胺的浓度为1μm：配制100ml培养基时，以dmem/f-12培养基(gibco，货号：11320033)和神经基础培养基(gibco，货号：21103049)为基本培养基(两种培养基按体积比1:1混合，其中dmem/f-12培养基和神经基础培养基的用量分别为47.8995ml)，还有如下组分：1ml的n2补充剂(n2补充剂和基本培养基的质量比为1:100，即按说明书添加体积比为1％)、2ml的不含维生素a的b27补充剂(不含维生素a的b27补充剂和基本培养基的体积比为1:50，即按说明书添加体积比为2％)、1ml浓度为20m的抗坏血酸(sigma，货号：1043003)、100μl浓度为5mm的盐酸多索啡(dm，购于tocris，货号：3039)、100μl浓度为10mm的sb431542(购于tocris，货号：1614)、1μl浓度为100mm的嘌呤吗啡胺(stemgent，货号：04-0009)。
74.处理3：dap分化培养基，嘌呤吗啡胺的浓度为2μm：配制100ml培养基时，以dmem/f-12培养基(gibco，货号：11320033)和神经基础培养基(gibco，货号：21103049)为基本培养基(两种培养基按体积比1:1混合，其中dmem/f-12培养基和神经基础培养基的用量分别为47.899ml)，还有如下组分：1ml的n2补充剂(n2补充剂和基本培养基的质量比为1:100，即按说明书添加体积比为1％)、2ml的不含维生素a的b27补充剂(不含维生素a的b27补充剂和基本培养基的体积比为1:50，即按说明书添加体积比为2％)、1ml浓度为20m的抗坏血酸(sigma，货号：1043003)、100μl浓度为5mm的盐酸多索啡(dm，购于tocris，货号：3039)、100μl浓度为10mm的sb431542(购于tocris，货号：1614)、2μl浓度为100mm的嘌呤吗啡胺(stemgent，货号：04-0009)。
75.处理4：dap分化培养基，嘌呤吗啡胺的浓度为3μm：配制100ml培养基时，以dmem/f-12培养基(gibco，货号：11320033)和神经基础培养基(gibco，货号：21103049)为基本培养基(两种培养基按体积比1:1混合，其中dmem/f-12培养基和神经基础培养基的用量分别为47.8985ml)，还有如下组分：1ml的n2补充剂(n2补充剂和基本培养基的质量比为1:100，即按说明书添加体积比为1％)、2ml的不含维生素a的b27补充剂(不含维生素a的b27补充剂和基本培养基的体积比为1:50，即按说明书添加体积比为2％)、1ml浓度为20m的抗坏血酸(sigma，货号：1043003)、100μl浓度为5mm的盐酸多索啡(dm，购于tocris，货号：3039)、100μl浓度为10mm的sb431542(购于tocris,货号：1614)、3μl浓度为100mm的嘌呤吗啡胺(stemgent，货号：04-0009)。
76.处理5：dap分化培养基，嘌呤吗啡胺的浓度为4μm：配制100ml培养基时，以dmem/f-12培养基(gibco，货号：11320033)和神经基础培养基(gibco，货号：21103049)为基本培养基(两种培养基按体积比1:1混合，其中dmem/f-12培养基和神经基础培养基的用量分别为
47.898ml)，还有如下组分：1ml的n2补充剂(n2补充剂和基本培养基的质量比为1:100，即按说明书添加体积比为1％)、2ml的不含维生素a的b27补充剂(不含维生素a的b27补充剂和基本培养基的体积比为1:50，即按说明书添加体积比为2％)、1ml浓度为20m的抗坏血酸(sigma，货号：1043003)、100μl浓度为5mm的盐酸多索啡(dm，购于tocris，货号：3039)、100μl浓度为10mm的sb431542(购于tocris，货号：1614)、4μl浓度为100mm的嘌呤吗啡胺(stemgent，货号：04-0009)。
77.将hipsc在dap分化培养基中培养，分别添加不同浓度的嘌呤吗啡胺(pm，0μm、1μm、2μm、3μm和4μm)，培养后第16天收集处理1～5培养得到的细胞，进行rt-pcr检测(检测方法同应用例6)，观察多巴胺能神经元祖细胞特异性基因foxa2、corin、lmx1b和lmx1a的表达情况，以组成性表达的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)基因为内参，特异性基因相对表达量用特异性基因mrna表达量与gapdh基因的mrna表达量的比值mrna/gapdh表示，结果如图1所示，多巴胺能神经元祖细胞特异性基因的表达水平在嘌呤吗啡胺在3μm和4μm组达到高水平的平台，因此，dap分化培养基的嘌呤吗啡胺的最优浓度定位3μm和4μm。在嘌呤吗啡胺的浓度为3μm或4μm得到的dap培养基能够提高dap特异性分子的表达情况。且在3μm pm有着较好的效果。
78.应用例2
79.不同浓度的chir9901的筛选
80.处理1：dap分化培养基，chir9901浓度为0：配制100ml培养基时，以dmem/f-12培养基(gibco，货号：11320033)和神经基础培养基(gibco，货号：21103049)为基本培养基(两种培养基按体积比1:1混合，其中dmem/f-12培养基和神经基础培养基的用量分别为47.8985ml)，还有如下组分：1ml的n2补充剂(n2补充剂和基本培养基的质量比为1:100，即按说明书添加体积比为1％)、2ml的不含维生素a的b27补充剂(不含维生素a的b27补充剂和基本培养基的体积比为1:50，即按说明书添加体积比为2％)、1ml浓度为20m的抗坏血酸(sigma，货号：1043003)、100μl浓度为5mm的盐酸多索啡(dm，购于tocris,货号：3039)、100μl浓度为10mm的sb431542(购于tocris，货号：1614)、3μl浓度为100mm的嘌呤吗啡胺(stemgent，货号：04-0009)。
81.处理2：dap分化培养基，chir9901浓度为0.4μm：配制100ml培养基时，以dmem/f-12培养基(gibco，货号：11320033)和神经基础培养基(gibco，货号：21103049)为基本培养基(两种培养基按体积比1:1混合，其中dmem/f-12培养基和神经基础培养基的用量分别为47.896ml)，还有如下组分：1ml的n2补充剂(n2补充剂和基本培养基的质量比为1:100，即按说明书添加体积比为1％)、2ml的不含维生素a的b27补充剂(不含维生素a的b27补充剂和基本培养基的体积比为1:50，即按说明书添加体积比为2％)、1ml浓度为20m的抗坏血酸(sigma，货号：1043003)、100μl浓度为5mm的盐酸多索啡(dm，购于tocris，货号：3039)、100μl浓度为10mm的sb431542(购于tocris,货号：1614)、3μl浓度为100mm的嘌呤吗啡胺(stemgent，货号：04-0009)、5μl浓度为8mm的chir99021(chir，购于tocris，货号：4423)。
82.处理3：dap分化培养基，chir9901浓度为0.8μm：配制100ml培养基时，以dmem/f-12培养基(gibco，货号：11320033)和神经基础培养基(gibco，货号：21103049)为基本培养基(两种培养基按体积比1:1混合，其中dmem/f-12培养基和神经基础培养基的用量分别为47.8935ml)，还有如下组分：1ml的n2补充剂(n2补充剂和基本培养基的质量比为1:100，即
按说明书添加体积比为1％)、2ml的不含维生素a的b27补充剂(不含维生素a的b27补充剂和基本培养基的体积比为1:50，即按说明书添加体积比为2％)、1ml浓度为20m的抗坏血酸(sigma，货号：1043003)、100μl浓度为5mm的盐酸多索啡(dm，购于tocris，货号：3039)、100μl浓度为10mm的sb431542(购于tocris，货号：1614)、3μl浓度为100mm的嘌呤吗啡胺(stemgent，货号：04-0009)、10μl浓度为8mm的chir99021(chir，购于tocris,货号：4423)。
83.处理4：dap分化培养基，chir9901浓度为1.2μm：配制100ml培养基时，以dmem/f-12培养基(gibco，货号：11320033)和神经基础培养基(gibco，货号：21103049)为基本培养基(两种培养基按体积比1:1混合，其中dmem/f-12培养基和神经基础培养基的用量分别为47.891ml)，还有如下组分：1ml的n2补充剂(n2补充剂和基本培养基的质量比为1:100，即按说明书添加体积比为1％)、2ml的不含维生素a的b27补充剂(不含维生素a的b27补充剂和基本培养基的体积比为1:50，即按说明书添加体积比为2％)、1ml浓度为20m的抗坏血酸(sigma，货号：1043003)、100μl浓度为5mm的盐酸多索啡(dm，购于tocris,货号：3039)、100μl浓度为10mm的sb431542(购于tocris，货号：1614)、3μl浓度为100mm的嘌呤吗啡胺(stemgent，货号：04-0009)、15μl浓度为8mm的chir99021(chir，购于tocris，货号：4423)。
84.处理5：dap分化培养基，chir9901浓度为1.6μm：配制100ml培养基时，以dmem/f-12培养基(gibco，货号：11320033)和神经基础培养基(gibco，货号：21103049)为基本培养基(两种培养基按体积比1:1混合，其中dmem/f-12培养基和神经基础培养基的用量分别为47.8885ml)，还有如下组分：1ml的n2补充剂(n2补充剂和基本培养基的质量比为1:100，即按说明书添加体积比为1％)、2ml的不含维生素a的b27补充剂(不含维生素a的b27补充剂和基本培养基的体积比为1:50，即按说明书添加体积比为2％)、1ml浓度为20m的抗坏血酸(sigma，货号：1043003)、100μl浓度为5mm的盐酸多索啡(dm，购于tocris,货号：3039)、100μl浓度为10mm的sb431542(购于tocris，货号：1614)、3μl浓度为100mm的嘌呤吗啡胺(stemgent，货号：04-0009)、20μl浓度为8mm的chir99021(chir，购于tocris，货号：4423)。
85.将hipsc在dap分化培养基中培养，嘌呤吗啡胺浓度为3μm基础上分别添加不同浓度的chir99201(ch，0μm、0.4μm、0.8μm、1.2μm和1.6μm)，培养后第16天收集处理1～5培养得到的细胞，进行rt-pcr检测(检测方法同应用例6)，观察多巴胺能神经元祖细胞特异性基因foxa2、corin、lmx1b和lmx1a的表达情况，以组成性表达的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)基因为内参，特异性基因相对表达量用特异性基因mrna表达量与gapdh基因的mrna表达量的比值mrna/gapdh表示，结果如图2所示，结果显示多巴胺能神经元祖细胞特异性基因foxa2、lmx1a的表达水平在chir99201在0.8μm组达到高水平的平台，因此，dap分化培养基的chir99201的最优浓度定位0.8～1.6μm。
86.应用例3
87.对实施例2和对比例1培养的第1d～第11d的细胞分化情况进行观察，观察结果如图3，实施例2和对比例1分化的细胞在数量和细胞形态上没有明显区别。
88.应用例4
89.细胞免疫荧光染色
90.对实施例2和对比例1培养的第16天进行细胞免疫荧光染色，具体步骤如下：
91.采用pbs分别清洗实施例2和对比例1培养所得细胞1次，用4wt.％多聚甲醛固定细胞20分钟(按培养板底面积计算1ml/10cm2)弃去多聚甲醛，0.1wt.％triton 100透膜10分
钟，之后用3wt.％bsa封闭1小时(按培养板底面积计算1ml/10cm2)；按照体积比1：100将th抗体(immunostar，货号：22941)加在1wt.％bsa中，培养板4℃冰箱中过夜；用pbs缓冲液(thermo fisher，货号:10010072)洗孔3遍后，按照体积比1:1000加入二抗(abcam，货号：ab205718)，室温放置2小时，之后pbs缓冲液洗孔3遍，加入4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(dapi，abcam，货号：ab228549)以显示细胞核，显微镜下照相，结果如图4所示：在含有safit2的培养基中培养得到的中脑多巴胺能神经元特异性标志foxa2蛋白的表达明显升高。
92.应用例5
93.细胞免疫荧光染色
94.收集实施例2和对比例1培养的第43d的细胞，对收集所得细胞进行基因的mrna表达水平检测，试验步骤同应用例4，结果如图6所示：在含有safit2的培养基中培养，可大大提高hipsc向多巴胺能神经元的诱导效率，而且在含有safit2的培养基中培养得到的细胞表达aadc，th比例明显升高。
95.应用例6
96.实时定量聚合酶链反应(rt-pcr)
97.对实施例2和对比例1培养第16天和第19天的细胞进行收集，对收集所得细胞和实施例1制备的得到的hipsc进行基因的mrna表达水平检测，其中实施例2中收集的细胞记为dap safit2，对比例1中收集的细胞记为dap，具体步骤如下：
98.提取上述收集的细胞和hipsc的总rna，提取总rna采用康为世纪公司的ultrapure rnakit试剂盒(cw0581m，康为世纪，中国)，按试剂盒说明书操作；rna的转录采用凯捷公司的quantitect
tm reverse transcription kit试剂盒(cat.205313，凯捷公司，德国)，按试剂盒说明书进行操作。实时定量pcr扩增采用德国凯捷公司的quantitect
tm sybr green pcr kit试剂盒(cat.204145，凯捷公司，德国)，按试剂盒说明书操作，采用的引物对具体如表1所示。
99.表1序列的具体信息
100.引物序列seq id no.hth-ftcatcacctggtcaccaagtt1hth-rggtcgccgtgcctgtact2hen1-fccctggtttctctgggactt3hen1-rgcagtctgtggggtcgtatt4hnurr1-fcctggctgttgggatggtcaaag5hnurr1-rcctgtgggctcttcggtttcg6hlmx1b-fccgtgaagagcgaggatgaagatg7hlmx1b-rgctgctgcgtggtgaggatg8hlmx1a-factcaacagaggcgagcattcaag9hlmx1a-racctggacgacacggacactc10hfoxa2-fatccgccactcgctctccttc11hfoxa2-rggtagcagccgttctcgaacatg12hcorin-fcatatctccatcgcctcagttg13
hcorin-rggcaggagtccatgactgt14haadc-fagaacagacttaacgggagcct15haadc-rctggacatgcttgcggatataa16hdat-fggcagttcagcgacgacatcc17hdat-rccacgaccacgaacaggagaaag18hvmat2-fgtccttctgctggtggtgctattg19hvmat2-rttcttctttggcaggtggacttcg20
101.mrna表达水平检测结果如图5所示：在含有safit2的培养基中培养得到的细胞中脑多巴胺能神经元特异性基因lmx1a、foxa2、en1和corin的表达明显升高。
102.应用例7
103.收集实施例2和对比例1培养的第35d和培养第39d的细胞，对收集所得细胞进行基因的mrna表达水平检测，其中实施例2中收集的细胞记为dap safit2，对比例1中收集的细胞记为dap，具体步骤同应用例4。mrna表达水平检测结果如图7所示：在含有safit2的培养基进行培养能够显著提高多巴胺合成过程限速酶的表达，即提高氨酸羟化酶(th)、芳香族氨基酸脱羧酶(aadc)的表达，能提高孤儿核受体的超家族中nur相关因子1(nurr1)的高效表达，而nur相关因子1(nurr1)在中脑多巴胺系统中高度表达，与中脑多巴胺能神经元的发生、发育和存活有密切关系，还能够提高囊泡单胺转运蛋白2(vmat2)的表达，囊泡单胺转运蛋白2是囊泡单胺转运蛋白家族(vmats)成员之一，主要参与单胺类神经递质的转运，可将胞质内有害的单胺隔离到囊泡中，均是多巴胺能神经元特异性标记。
104.应用例8
105.蛋白免疫印迹检测(westen blot)
106.收集实施例2和对比例1培养的第45天的细胞，对收集所得细胞进行蛋白免疫印迹检测，对收集得到的实施例2和对比例1的细胞分别采用ripa裂解液(santa cruze,货号：sc-24948)收集细胞总蛋白。
107.具体步骤如下：在培养皿中移除培养基，并用室温1
×
pbs(10倍液体pbs:sc-24946)冲洗细胞单层，应在冰上使用新鲜的冰冷缓冲液执行以下步骤：将0.6ml ripa缓冲液添加到平板中的单层细胞中，之后在4℃下轻轻摇动平板15分钟，用细胞刮刀清除粘附细胞，将得到的裂解液转移到微量离心管中用0.3ml ripa缓冲液清洗平板一次，并与第一次裂解液结合，在冰上培养30分钟后，在4℃下以10000
×
g离心细胞裂解液10分钟，上清液为总细胞裂解液；
108.将上清液转移到新的微量离心管中，即为全细胞裂解液。采用bca试剂盒(abcam，货号：ab102536)测定蛋白浓度。
109.按照体积比1:1000的比例加入th抗体(immunostar，货号：22941)和体积比1:5000的比例加入aadc(millipore，货号：ab1569)，4℃孵育过夜，按照体积比1∶5000的比例加入加入辣根过氧化物酶标记的二抗(abcam，货号：ab205718)，室温孵育1h，采用immun-star
tm hrp化学发光试剂盒(bio-rad，货号：1705060)，对蛋白条带进行可视化，采用image j软件进行图像分析。
110.图像分析条带浓度的结果如图8所示，可见诱导培养基中加入safit2组细胞表达th蛋白量明显升高。
111.由上述实施例和应用例记载的可知，添加safit2的培养基能够显著提高th(酪氨酸羟化酶)阳性细胞比例及th基因和蛋白表达增加。由此可见，本发明所述safit2能够用于促进hipsc向多巴胺能神经元高效分化。
112.尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。