一种羰基还原酶及利用该酶制备(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法

一种羰基还原酶及利用该酶制备(r)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法
技术领域
1.本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种羰基还原酶及利用该酶制备(r)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法。


背景技术：

2.4-氯-3-羟基丁酸乙酯(chbe)，是一种重要的有机合成的中间体，可经由氯的置换反应，还原反应等，引入多种药物中间体。例如：(r)-chbe可以用来合成减肥营养补充品l-肉碱。目前以4-氯乙酰乙酸乙酯(cobe)为原材料来制备chbe主要有化学法和生物催化法两种方法。化学合成方法反应条件苛刻，需在高温、高压条件下反应，能耗较高且对反应器要求苛刻，同时使用的金属催化剂价格昂贵成本较高。生物催化合成chbe具有效率高、立体选择性高、成本低、绿色环保等优势，近年来受到广泛关注。


技术实现要素：

3.本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种羰基还原酶及利用该酶制备(r)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法。
4.本发明通过使用生物信息学的挖掘手段，挖掘出活力和立体选择性较高的羰基还原酶cr1。同时构建了辅酶循环再生反应体系(将羰基还原酶与葡萄糖脱氢酶同时加入反应体系)，提供一种绿色环保、成本较低、产物光学纯度高的(r)-chbe的制备方法。
5.本发明的第一个目的是提供一种羰基还原酶，其氨基酸序列如seq id no.1所示。
6.所述的羰基还原酶分离自酵母菌。
7.本发明的第二个目的是提供一种上述羰基还原酶的编码基因，该编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
8.本发明的第三个目的是提供一种含有上述编码基因的重组载体或重组菌。
9.本发明的第四个目的是提供上述的羰基还原酶，以及表达该羰基还原酶的重组载体或重组菌在催化4-氯乙酰乙酸乙酯转化制备(r)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用。
10.本发明的第五个目的是提供一种制备(r)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，该制备方法包括以下步骤：将4-氯乙酰乙酸乙酯溶于正辛醇，得到油相；将表达羰基还原酶的工程菌湿细胞、表达葡萄糖脱氢酶的工程菌湿细胞、葡萄糖和nadph加入到磷酸盐缓冲液中，得到水相；将油相和水相混合，调节ph值，于室温下搅拌反应；反应结束后用乙酸乙酯萃取，将萃取液减压蒸馏除去有机溶剂，得到目标化合物(r)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。
11.进一步的，所述的表达羰基还原酶的工程菌湿细胞的构建方法为：将上述的羰基还原酶的编码基因导入pet28a，酶切位点为ndei、ecori，得到重组质粒，然后将重组质粒导入e.coli bl21(de3)，即得。
12.进一步的，所述的表达葡萄糖脱氢酶的工程菌湿细胞的构建方法为：将如seq id no.3所示的葡萄糖脱氢酶的编码基因导入pet28a，酶切位点为ndei、ecori，得到重组质粒，
然后将重组质粒导入e.coli bl21(de3)，即得。
13.进一步的，所述的4-氯乙酰乙酸乙酯、表达羰基还原酶的工程菌湿细胞、表达葡萄糖脱氢酶的工程菌湿细胞和葡萄糖的质量比为(10～80):1:1:1.5；所述的葡萄糖与nadph的质量比为(25～100):1。优选的，所述的4-氯乙酰乙酸乙酯、表达羰基还原酶的工程菌湿细胞、表达葡萄糖脱氢酶的工程菌湿细胞和葡萄糖的质量比为80:1:1:1.5；所述的葡萄糖与nadph的质量比为25:1。
14.进一步的，所述的磷酸盐缓冲液为0.1mol/l，ph＝7.5的kh2po
4-k2hpo4缓冲液；所述的正辛醇与磷酸盐缓冲液的体积比为1:(2～20)。优选的，所述的正辛醇与磷酸盐缓冲液的体积比为1:19。
15.进一步的，所述的调节ph值为调节ph至7，所述反应的反应时间为2～3h。优选的，所述反应的反应时间为2h。
16.本发明的有益效果：
17.本发明通过优化(r)-chbe合成工艺中的催化酶、反应体系及ph的因素，以本发明人团队挖掘的新型羰基还原酶cr1作为催化酶，该酶对cobe催化活力高、立体选择性好，可有效催化cobe转化为(r)-chbe；以ph 7的正辛醇/磷酸盐缓冲液作为双相反应体系，相较于传统的催化反应体系对酶的毒性小，并能显著提高反应底物浓度，提高生物转化效率，缩短反应时间，最终在较短的反应时间(2h)内合成光学纯度ee值高达99.5％的(r)-chbe，且收率为97％，转化率为100％，显著优于现有的技术水平。
具体实施方式
18.以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
19.本发明下述实施例中的重组质粒、基因工程菌均通过本领域常规方法构建得到。
20.实施例1
21.1、基因工程菌e.coli bl21(de3)/pet28a-cr1构建及培养
22.将如seq id no.2所示的羰基还原酶cr1的基因序列克隆至pet28a质粒，酶切位点为ndei、ecori，得重组质粒pet28a-cr1，然后将重组质粒pet28a-cr1导入大肠杆菌e.coli bl21(de3)，构建得到基因工程菌e.coli bl21(de3)/pet28a-cr1。
23.将上述构建的工程菌e.coli bl21(de3)/pet28a-cr1接种至含有卡那霉素(50μg/ml)的lb培养基中，37℃，200rpm培养，当菌液的吸光密度(od600)达到0.6-0.8时，加入0.1mm异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)进行诱导，诱导温度为16℃，诱导时间20小时，培养结束后经过离心处理，即得到高效表达羰基还原酶cr1的基因工程菌湿细胞。
24.2、基因工程菌e.coli bl21(de3)/pet28a-gdh构建及培养
25.将如seq id no.3所示的葡萄糖脱氢酶gdh的基因序列克隆至pet28a质粒，酶切位点为ndei、ecori，得重组质粒pet28a-gdh，然后将重组质粒pet28a-gdh导入大肠杆菌e.coli bl21(de3)，构建得到基因工程菌e.coli bl21(de3)/pet28a-gdh。
26.将上述构建的工程菌e.coli bl21(de3)/pet28a-gdh接种至含有卡那霉素(50μg/ml)的lb培养基中，37℃，200rpm培养，当菌液的吸光密度(od600)达到0.6-0.8时，加入0.1mm异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)进行诱导，诱导温度为16℃，诱导时间20小时，培养结束后经过离心处理，即得到高效表达羰基还原酶gdh的基因工程菌湿细胞。
27.3、(r)-chbe的合成
28.(r)-chbe的合成路线如下：
[0029][0030]
具体包括以下步骤：
[0031]
(1)将10g cobe溶于16ml正辛醇中，得到油相；将1.0g gr1工程菌湿细胞(e.coli bl21(de3)/pet28a-cr1)、1.0g gdh工程菌湿细胞(e.coli bl21(de3)/pet28a-gdh)、1.5g葡萄糖和0.02g nadph加入到34ml 0.1mol/l，ph＝7.5的kh2po
4-k2hpo4缓冲液中，得到水相；将油相和水相混合，调节ph值在7.0左右，于室温下搅拌反应3h，反应结束后用等体积的乙酸乙酯萃取三遍，合并萃取液并将萃取液减压蒸馏除去有机溶剂，得到9.32g(r)-chbe(ee值＞99.0％，收率为93％，转化率为100％)。
[0032]
实施例2
[0033]
本实施例是以实施例1构建及培养得到的基因工程菌e.coli bl21(de3)/pet28a-cr1、基因工程菌e.coli bl21(de3)/pet28a-gdh进行合成(r)-chbe，具体包括以下步骤：
[0034]
将40g cobe溶于20ml正辛醇中，得到油相；将2.0g gr1工程菌湿细胞(e.coli bl21(de3)/pet28a-cr1)、2.0g gdh工程菌湿细胞(e.coli bl21(de3)/pet28a-gdh)、3.0g葡萄糖和0.03g nadph加入到90ml 0.1mol/l，ph＝7.5的kh2po
4-k2hpo4缓冲液中，得到水相；将油相和水相混合，调节ph值在7.0左右，于室温下搅拌反应3h，反应结束后用等体积的乙酸乙酯萃取三遍，合并萃取液并将萃取液减压蒸馏除去有机溶剂，得到37.9g(r)-chbe(ee值＞99.1％，收率为95％，转化率为100％)。
[0035]
实施例3
[0036]
本实施例是以实施例1构建及培养得到的基因工程菌e.coli bl21(de3)/pet28a-cr1、基因工程菌e.coli bl21(de3)/pet28a-gdh进行合成(r)-chbe，具体包括以下步骤：
[0037]
将400g cobe溶于50ml正辛醇中，得到油相；将5.0g gr1工程菌湿细胞(e.coli bl21(de3)/pet28a-cr1)、5.0g gdh工程菌湿细胞(e.coli bl21(de3)/pet28a-gdh)、7.5g葡萄糖和0.3g nadph加入到950ml 0.1mol/l，ph＝7.5的kh2po
4-k2hpo4缓冲液中，得到水相；将油相和水相混合，调节ph值在7.0左右，于室温下搅拌反应2h，反应结束后用等体积的乙酸乙酯萃取三遍，合并萃取液并将萃取液减压蒸馏除去有机溶剂，得到388.2g(r)-chbe(ee值＞99.5％，收率为97％，转化率为100％)。
[0038]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

技术特征：
1.一种羰基还原酶，其氨基酸序列如seq id no.1所示。2.一种权利要求1所述的羰基还原酶的编码基因，其特征在于，所述的编码基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。3.一种含有权利要求2所述的编码基因的重组载体或重组菌。4.权利要求1所述的羰基还原酶和权利要求3所述的重组载体或重组菌在催化4-氯乙酰乙酸乙酯转化制备(r)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯中的应用。5.一种制备(r)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法，其特征在于，包括以下步骤：将4-氯乙酰乙酸乙酯溶于正辛醇，得到油相；将表达权利要求1所述的羰基还原酶的工程菌湿细胞、表达葡萄糖脱氢酶的工程菌湿细胞、葡萄糖和nadph加入到磷酸盐缓冲液中，得到水相；将油相和水相混合，调节ph值，于室温下搅拌反应；反应结束后用乙酸乙酯萃取，将萃取液减压蒸馏除去有机溶剂，得到目标化合物(r)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的表达权利要求1所述的羰基还原酶的工程菌湿细胞的构建方法为：将权利要求1所述的羰基还原酶的编码基因导入pet28a，酶切位点为ndei、ecori，得到重组质粒，然后将重组质粒导入e.coli bl21(de3)，即得。7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的表达葡萄糖脱氢酶的工程菌湿细胞的构建方法为：将如seq id no.3所示的葡萄糖脱氢酶的编码基因导入pet28a，酶切位点为ndei、ecori，得到重组质粒，然后将重组质粒导入e.coli bl21(de3)，即得。8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的4-氯乙酰乙酸乙酯、表达权利要求1所述的羰基还原酶的工程菌湿细胞、表达葡萄糖脱氢酶的工程菌湿细胞和葡萄糖的质量比为(10～80):1:1:1.5；所述的葡萄糖与nadph的质量比为(25～100):1。9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的磷酸盐缓冲液为0.1mol/l，ph＝7.5的kh2po
4-k2hpo4缓冲液；所述的正辛醇与磷酸盐缓冲液的体积比为1:(2～20)。10.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的调节ph值为调节ph至7，所述反应的反应时间为2～3h。

技术总结
本发明公开了一种羰基还原酶及利用该酶制备(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法。该羰基还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的制备步骤为：将4-氯乙酰乙酸乙酯溶于正辛醇，得到油相；将表达羰基还原酶的工程菌湿细胞、表达葡萄糖脱氢酶的工程菌湿细胞、葡萄糖和NADPH加入到磷酸盐缓冲液中，得到水相；将油相和水相混合，调节pH值，于室温下搅拌反应；反应结束后用乙酸乙酯萃取，将萃取液减压蒸馏除去有机溶剂，得到目标化合物(R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯。本发明方法反应时间短，产物的ee＞99.5％，收率为97％，转化率为100％，显著优于现有的技术水平。显著优于现有的技术水平。


技术研发人员：周佳海 陈剑 许雪霞 余长泉 杨林松
受保护的技术使用者：中国科学院深圳先进技术研究院
技术研发日：2022.02.10
技术公布日：2022/5/25