一种甲基化肽段的富集方法

1.本发明属于蛋白质组学研究方向甲基化蛋白质组学技术领域，具体涉及富集甲基化肽段的方法。
技术背景
2.蛋白质甲基化是一种常见的蛋白质翻译后修饰，其修饰位点受到甲基化转移酶和去甲基化转移酶动态调控。目前已知的甲基化修饰大多发生于赖氨酸残基和精氨酸残基上，赖氨酸残基上可以发生单甲基化、二甲基化和三甲基化，精氨酸甲基上可以发生单甲基化、二甲基化，而精氨酸二甲基化又可具体地分为对称型和和非对称型。甲基化修饰在很多的生理过程的调控中发挥着重要的调控作用，涉及rna加工、转录调控、信号转导、dna修复等多种细胞过程，并参与调节蛋白质与蛋白质之间的相互作用。甲基化修饰后除了增加空间位阻和减少氢键作用力外，并没有显著改变精氨酸或赖氨酸残基的物理化学性质，这使得高效分离富集精氨酸或赖氨酸甲基化修饰的肽段较为困难。目前，甲基化肽段的富集主要依赖于抗体(gua a,gu h,et al.molecular&cellular proteomics,2014,13(1):372-387；geoghegan v,guo a,et al.nature communications,2015,6(1):1-8；musiani d,bok j,massignani e,et al.science signaling,2019,12(575):eaat8388.)，但基于抗体的富集往往需要十毫克以上的蛋白起始量，同时抗体价格昂贵，批次重现性存在问题。
3.相比抗体，强阳离子交换色谱是一种价格便宜的甲基化肽段富集方法(uhlmann t,geoghegan v l,et al.molecular&cellular proteomics,2012,11(11):1489-1499)。该方法利用甲基化肽段在酸性条件下高价态的特征将其富集。然而，含有组氨酸的肽段与此类肽段有相同的特征，因此会被共富集出来，严重干扰甲基化肽段的质谱检测。丙烯醛是一种常见的脂质过氧化产物，可以与组氨酸发生反应，使组氨酸上修饰一个醛基基团。本发明利用这一特征，将强阳离子交换色谱富集产物中的含组氨酸肽段修饰醛基基团，再利用酰肼化学，将含有组氨酸的肽段从中去除，有效提高了甲基化肽段的富集特异性，实现了更低丰度甲基化位点的鉴定。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于改进基于强阳离子交换的甲基化肽段富集方法，通过丙烯醛与组氨酸的反应以及酰肼化学，实现了强阳离子交换色谱富集产物中含组氨酸肽段的去除，从而提高甲基化肽段的富集特异性，实现更低丰度甲基化肽段的鉴定。
5.本发明公开了一种甲基化肽段的富集方法，使用强阳离子交换色谱富集蛋白酶解物中含有至少两个碱性氨基酸的肽段，收集富集物，然后利用丙烯醛与组氨酸的反应，将醛基修饰在富集物中含有组氨酸的肽段上，最后用酰肼化学方法去除富集物中修饰后的含有组氨酸的肽段，得到甲基化肽段。
6.所述方法的步骤为：
7.(a)蛋白质样品于水中分散均匀，加入蛋白酶进行酶解，得到蛋白酶解液；蛋白酶
解液中加入氨基封闭试剂进行孵育，除盐冻干，得蛋白酶解物；
8.(b)蛋白酶解物复溶后，使用强阳离子交换色谱富集蛋白酶解物中含有至少两个碱性氨基酸的肽段，直接冻干，得肽段混合物a；
9.(c)肽段混合物a复溶后加入终浓度10-1000mm(优选100mm)丙烯醛进行孵育，除盐冻干，得肽段混合物b；
10.(d)肽段混合物b复溶后加入酰肼微球进行孵育，过滤收集滤液，除盐冻干，得甲基化肽段。
11.1.所述方法中的蛋白质样品来源包括动物细胞蛋白提取物、植物细胞蛋白提取物、动物组织蛋白提取物、植物组织蛋白提取物或其他蛋白提取物中的一种或两种以上；
12.优选，实验室可培养的动物癌细胞蛋白提取物。
13.2.所述方法中的蛋白质样品为采用有机溶剂沉淀法或超滤离心法获取的细胞和/或组织的蛋白提取物；
14.优选，蛋白质样品为采用丙酮沉淀法获取的细胞和/或组织的蛋白提取物。
15.3.所述方法中的蛋白酶为胰蛋白酶、赖氨酰内切酶、梭菌蛋白酶、金黄色葡萄球菌v8蛋白酶、糜蛋白酶等蛋白酶或蛋白酶组合，但不局限于这些酶中的一种或两种以上；
16.优选，采用胰蛋白酶、赖氨酰内切酶和金黄色葡萄球菌v8蛋白酶三种蛋白酶(细胞/或组织的蛋白提取物与三种酶的质量比均在1:20-1:100范围内)联合使用。
17.4.所述方法中的氨基封闭试剂包括氰基硼氢化钠与甲醛组合、酸酐、n-羟基丁二酰亚胺或邻苯二甲醛中的一种或两种以上，但不局限于这些与活性氨基反应的试剂；
18.优选，采用氰基硼氢化钠与甲醛组合对肽段中的活性氨基进行二甲基标记。
19.5.所述方法中的孵育条件如下所述：
20.步骤(a)反应的孵育条件可适当调整；优选，孵育条件为25℃，反应时长1h；
21.步骤(c)反应的孵育条件可适当调整；优选，孵育条件为37℃，反应时长1h；
22.步骤(d)反应的孵育条件可适当调整；优选，孵育的条件为25℃，反应1h。
23.6.所述方法中的除盐采用的是c18微球填充的固相微萃取柱；优选，样品除盐使用waters公司开发的hlb填料填充的固相微萃取柱。
24.7.所述方法中的冻干采用的是真空冷冻干燥法。
25.8.所述方法中采用的复溶溶剂如下所述：
26.步骤(b)采用的复溶溶剂为带有一定比例乙腈的磷酸盐缓冲液水溶液，与蛋白酶解物的比例在1:10-10:1(v/w)之间；优选，溶剂为70％水溶液(水溶液中包含5mm磷酸二氢钠，ph＝2.7)/30％(v/v)乙腈，蛋白酶解物与复溶溶剂的比例为1：1(w/v)；
27.步骤(c)采用的复溶溶剂为水，溶剂体积为步骤(b)复溶溶剂体积的70％；
28.步骤(d)采用的复溶溶剂为醋酸钠缓冲溶液，溶剂体积为步骤(c)复溶溶剂体积的十分之一左右；优选，溶剂为100mm醋酸钠，150mm水溶液(ph＝5.5)。
29.9.所述方法中的强阳离子交换色谱填料包括不同类型间隔臂及不同类型基质材料组合而成的商品化材料或实验室自制材料；
30.优选，采用赛分科技公司的polar mc系列强阳离子交换填料。
31.10.所述方法中的酰肼微球包括不同类型间隔臂及不同类型基质材料组合而成的商品化材料或实验室自制材料；
32.优选，采用thermo公司的ultralink系列酰肼树脂微球。
33.本发明具有如下特性：
34.1.该方法可以同时富集精氨酸和赖氨酸甲基化肽段。
35.2.相比传统的基于强阳离子交换色谱的甲基化肽段鉴定方法，该方法可有效鉴定到更多低丰度的甲基化肽段。
36.3.实验成本低。该方法不需要使用抗体，克服了抗体富集存在的缺陷，包括抗体价格昂贵、蛋白质样品使用量大及抗体生产过程中的抗体批次差异性造成的实验重现性差等问题。
附图说明
37.图1为所述一种甲基化肽段的富集方法的流程图。
具体实施方式
38.下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
39.实施例1
40.一种甲基化肽段富集方法用于jurkat t细胞的蛋白酶解液中甲基修饰肽段的富集。
41.(1)向5e7个jurkat t细胞中加入500μl裂解液(6m盐酸胍,100mm三羟甲基氨基甲烷盐酸盐,ph 8.5)、10μl 0.5m三(2-羟乙基)膦和40μl 0.5m氯代乙酰胺，混合后在100℃中反应5min，然后将样品放置在冰浴(0-4℃)中冷却；冷却后的细胞用超声波细胞破碎仪破碎，然后将其放在100℃下反应5min使蛋白巯基完全烷基化，再将其放在冰浴中冷却；第二次冷却后的样品在4℃下离心30min(转速8000rpm)，使得细胞碎片沉淀，然后收集上清液；使用bca方法测上清液中的蛋白浓度，取其中1mg蛋白，加入与蛋白溶液等体积的4℃去离子水，再加入8倍体积-20℃丙酮，混匀后放置在-20℃下过夜。
42.(2)将溶液于4℃下离心15min(转速2000rpm)，使得蛋白沉淀；去除上清后，加入-20℃80％(v/v)丙酮水溶液洗涤沉淀两次，然后将沉淀放置于室温下晾置10min去除丙酮；加入400μl 10mm三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液(ph 8.0)，将蛋白超声分散开后加入20μg的胰蛋白酶和20μg的赖氨酰内切酶，37℃下反应16h；酶解液在100℃下放置10min使蛋白酶灭活，然后将其冰浴冷却；冷却后加入60μl的50mm三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液(包含50mm二硫苏糖醇,2mm乙二胺四乙酸,ph 7.65)和6μl 0.5m氯化钙，混匀后加入20μg的金黄色葡萄球菌v8蛋白酶，37℃下反应16h；反应结束后加入6μl 0.5m氯代乙酰胺，100℃下反应10min将溶液中的二硫苏糖醇活性淬灭；冰浴下冷却至室温。
43.(3)加入60μl 0.6m氰基硼氢化钠水溶液和60μl 4％(v/v)甲醛水溶液，混匀后在25℃下反应1h；加入100μl 1m三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(ph7.0)，继续反应30min；加入三氟乙酸至1％(v/v)酸化溶液，并高转速离心去除溶液中的气泡，用60mg hlb填料填充的固相微萃取柱(waters公司产品)对样品进行除盐，最后将萃取出来的样品冷冻干燥。其中，除盐过程如下。使用1ml甲醇活化柱子，然后用3ml 0.1％(v/v)三氟乙酸水溶液平衡柱子，此后将全部样品加入，待样品完全流过柱管后，用0.8ml的0.1％三氟乙酸水溶液冲洗柱子，最后
用0.9ml的20％的水(水相中含有0.1％(v/v)的三氟乙酸)/80％(v/v)乙腈洗脱肽段。
44.(4)将冻干后的肽段复溶于900μl的70％的水(水相中含有5mm磷酸二氢钾，ph 2.7)/30％(v/v)乙腈中，将200μl polar mc30-sp类型的强阳离子交换填料(赛分科技)加入到2.5ml规格的固相微萃取柱管中，用900μl的70％的水(水相中含有5mm磷酸二氢钾,500mm氯化钾，ph 7.2)/30％(v/v)乙腈冲洗柱子，1800μl的70％的水(水相中含有5mm磷酸二氢钾，ph 2.7)/30％(v/v)乙腈平衡柱子，然后将900μl肽段溶液上样至柱中，用1800μl的70％的水(水相中含有5mm磷酸二氢钾,40mm氯化钾，ph 2.7)/30％(v/v)乙腈冲洗柱子，最后用900μl的70％的水(水相中含有5mm磷酸二氢钾,500mm氯化钾，ph 7.2)/30％(v/v)乙腈洗脱目标肽段，洗脱产物通过冷冻干燥去除溶剂。
45.(5)将冻干样品复溶于600μl去离子水中，加入66μl 1m丙烯醛水溶液，混匀后在37℃下反应1h；然后样品用10mg的hlb填料制备的固相微萃取柱除盐(步骤同上，所用试剂量等比例缩减)，洗脱样品用同上方法冷冻干燥，冻干后的样品复溶到50μl 100mm醋酸钠，150mm氯化钠水溶液(ph 5.5)中；取30μl酰肼树脂微球(thermo公司)，用200μl 100mm醋酸钠，150mm氯化钠(ph 5.5)水溶液洗3次后，与复溶肽段混合，在25℃下孵育1h；最后将溶液过滤收集，树脂微球再用200μl 100mm醋酸钠，150mm氯化钠(ph 5.5)水溶液洗涤，滤液同样收集，并与此前滤液合并，滤液中加入三氟乙酸至1％(v/v)；向2mg hlb填料中加入50μl甲醇，混匀后，加入到带有聚四氟乙烯柱塞的200μl枪头中，将甲醇滤掉，加入600μl 0.1％(v/v)三氟乙酸水溶液平衡填料，此后将酸化后的滤液加入到枪头中，待样品完全流出后，加入50μl 0.1％(v/v)三氟乙酸水溶液冲洗填料，最后用20％的水(水相中包含0.1％(v/v)三氟乙酸)/80％(v/v)乙腈溶液300μl洗脱肽段，洗脱液冷冻干燥得到甲基化肽段。
46.(6)用lc-ms对样品进行检测。得到的raw文件采用蛋白质组学分析软件maxquant进行数据检索。最终三针质谱重复可鉴定到263个甲基化位点，相比传统的强阳离子交换色谱方法，鉴定效率提高了30％以上。

技术特征：
1.一种甲基化肽段的富集方法，其特征在于：使用强阳离子交换色谱富集蛋白酶解物中含有至少两个碱性氨基酸的肽段，收集富集物，然后利用丙烯醛与组氨酸的反应，将醛基修饰在富集物中含有组氨酸的肽段上，最后用酰肼化学方法去除富集物中修饰后的含有组氨酸的肽段，得到甲基化肽段。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法的步骤为：(a)蛋白质样品于水中分散均匀，加入蛋白酶进行酶解，得到蛋白酶解液；蛋白酶解液中加入氨基封闭试剂进行孵育，除盐冻干，得蛋白酶解物；(b)蛋白酶解物复溶后，使用强阳离子交换色谱富集蛋白酶解物中含有至少两个碱性氨基酸的肽段，直接冻干，得肽段混合物a；(c)肽段混合物a复溶后加入终浓度10-1000mm(优选100mm)丙烯醛进行孵育，除盐冻干，得肽段混合物b；(d)肽段混合物b复溶后加入酰肼微球进行孵育，过滤收集滤液，除盐冻干，得甲基化肽段。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(a)所述的蛋白质样品来源包括动物细胞蛋白提取物、植物细胞蛋白提取物、动物组织蛋白提取物、植物组织蛋白提取物或其他蛋白提取物中的一种或两种以上；优选，实验室可培养的动物癌细胞蛋白提取物。4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，步骤(a)所述的蛋白质样品为采用有机溶剂沉淀法或超滤离心法获取的细胞和/或组织的蛋白提取物；优选，蛋白质样品为采用丙酮沉淀法获取的细胞和/或组织的蛋白提取物。5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(a)所述的蛋白酶为胰蛋白酶、赖氨酰内切酶、梭菌蛋白酶、金黄色葡萄球菌v8蛋白酶、糜蛋白酶等蛋白酶或蛋白酶组合，但不局限于这些酶中的一种或两种以上；优选，采用胰蛋白酶、赖氨酰内切酶和金黄色葡萄球菌v8蛋白酶三种蛋白酶(细胞/或组织的蛋白提取物与三种酶的质量比均在1:20-1:100范围内)联合使用。6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(a)所述的氨基封闭试剂包括氰基硼氢化钠与甲醛组合、酸酐、n-羟基丁二酰亚胺或邻苯二甲醛中的一种或两种以上，但不局限于这些与活性氨基反应的试剂；优选，采用氰基硼氢化钠与甲醛组合对肽段中的活性氨基进行二甲基标记。7.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(a)所述的反应的孵育条件可适当调整；优选，孵育条件为25℃，反应时长1h；步骤(c)所述的反应的孵育条件可适当调整；优选，孵育条件为37℃，反应时长1h；步骤(d)所述的反应的孵育条件可适当调整；优选，孵育的条件为25℃，反应1h。8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的除盐采用的是c18微球填充的固相微萃取柱；优选，样品除盐使用waters公司开发的hlb填料填充的固相微萃取柱；所述的冻干采用的方法是真空冷冻干燥。9.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(b)所述的复溶采用的溶剂为带有一定比例乙腈的磷酸盐缓冲液水溶液，与蛋白酶解物的比例在1:10-10:1(v/w)之间；优选，溶剂为70％水溶液(水溶液中包含5mm磷酸二
氢钠，ph＝2.7)/30％(v/v)乙腈，蛋白酶解物与复溶溶剂的比例为1：1(w/v)；步骤(c)所述的复溶采用的溶剂为水，溶剂体积为步骤(b)所述的复溶溶剂体积的70％；步骤(d)所述的复溶采用的溶剂为醋酸钠缓冲溶液，溶剂体积为步骤(c)所述的复溶溶剂体积的十分之一左右；优选，溶剂为100mm醋酸钠，150mm水溶液(ph＝5.5)。10.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(b)所述的强阳离子交换色谱填料包括不同类型间隔臂及不同类型基质材料组合而成的商品化材料或实验室自制材料；优选，采用赛分科技公司的polar mc系列强阳离子交换填料；步骤(d)所述的酰肼微球包括不同类型间隔臂及不同类型基质材料组合而成的商品化材料或实验室自制材料；优选，采用thermo公司的ultralink系列酰肼树脂微球。

技术总结
本方法涉及一种甲基化肽段的富集方法，利用强阳离子交换柱富集全蛋白酶解液中含有至少两个碱性氨基酸的肽段，然后利用丙烯醛与组氨酸的反应，将醛基修饰在含组氨酸肽段上，最后利用酰肼化学，将含有组氨酸的肽段去除，从而实现更高特异性的甲基化肽段富集。本方法结合质谱检测及软件分析可实现蛋白质中所有精氨酸与赖氨酸甲基化位点的鉴定。与传统强阳离子交换色谱相比，本方法对甲基化肽段的富集特异性高，可以鉴定到更多低丰度的甲基化肽段。可以鉴定到更多低丰度的甲基化肽段。


技术研发人员：叶明亮 王麒 李宙显
受保护的技术使用者：中国科学院大连化学物理研究所
技术研发日：2020.11.23
技术公布日：2022/5/25