一种肿瘤细胞化疗药物敏感性标志物及其应用

1.本发明涉及肿瘤细胞药物敏感性检测技术领域，具体涉及一种肿瘤细胞化疗药物敏感性标志物及其应用。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.基因损伤药物引起的细胞死亡是抗肿瘤治疗的核心。虽然目前抗肿瘤治疗取得巨大进展，但是基因损伤药物耐药性的出现极大制约了肿瘤治疗的有效性。因此，深入研究肿瘤耐药的原因以及如何及时检测药物敏感性对肿瘤药物治疗至关重要。dna损伤压力应激被认为是影响dna损伤药物有效性的原因，dna损伤压力会导致dna双链或者单链损伤，进而激活细胞内dna损伤修复系统，修复dna损伤，抑制细胞死亡，从而导致肿瘤耐药。然而，细胞内存在一类高保真dna错配修复(mmr)系统，对细胞内碱基之间的错配和碱基的插入/删除的错配进行修复，保持基因组稳定性。而且mmr对dna损伤造成的凋亡起到重要的起始作用。在缺乏或失活mmr的肿瘤细胞中，会造成单个或两个核苷酸重复序列缺失的产生，导致不同长度的重复，引起基因组不稳定性，也叫做微卫星不稳定(msi)，引起肿瘤对药物的耐受性。大量研究已经证明msi成为肿瘤耐药的标志。因此，如何有效快速检测微卫星的状态将有效预测肿瘤药物敏感性与耐受性。
4.mmr系统蛋白主要由mutsα(msh2-msh6)和mutsβ(msh2-msh3)两种复合体组成，mutsβ(msh2-msh3)主要负责识别大的插入/缺失异源双链核酸分，而mutsα(msh2-msh6)主要负责识别单个碱基突变和1-2个核苷酸插入/缺失的错配，也是导致msi发生的调控复合体。mmr参与错配修复首先是起始于mutsα或者mutsβ结合到dna错配位点，然后招募mutlα(mlh1-pms2)、增殖细胞核内抗原(pcna)、复制蛋白a(rpa)组成一个复合体，最后招募内切酶(exo1)到dna损伤位点，exo1将错误的新生的dna一小段链切下来形成一个单链的缺口，然后以母本的dna链为模板，由聚合酶delta延伸，最后由dna连接酶i连接完整。
5.dna损伤药物会造成mmr蛋白降低，而mmr蛋白msh2、msh6、pms2、mlh1蛋白的水平直接影响细胞中微卫星的稳定与否。因此，mmr蛋白稳定性对于检测微卫星稳定性至关重要，对于预测肿瘤对药物的敏感性也非常有意义。


技术实现要素：

6.为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种高灵敏度、高特异性、可实际应用于肿瘤细胞化疗药物敏感性标志物及其应用。
7.所述肿瘤细胞化疗药物敏感性标志物是dna损伤错配修复系统蛋白msh2的k882乙酰化形式。肿瘤细胞微卫星稳定性取决于dna损伤修复系统蛋白的稳定性，预示肿瘤对化疗药物的敏感性。msh2-k882是msh2重要的乙酰化修饰位点，乙酰化修饰状态参与msh2的稳定
性，决定了微卫星稳定性，标识肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。
8.本发明制备了特异的msh2-k882乙酰化抗体ac-msh2-k882，可特异性检测到接受化疗药物处理的肿瘤细胞中msh2是否发生k882位的乙酰化，标志msh2的稳定性，从而预见肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。
9.具体地，本发明的技术方案如下所述：
10.在本发明的第一方面，提供乙酰化修饰的msh2作为肿瘤细胞化疗药物敏感性检测标志物中的应用，
11.优选的，所述化疗药物包括：etoposide，mitomycin c及烷化剂，所述烷化剂包括氮芥类、乙撑亚胺类、磺酸酯及多元醇类、亚硝基脲类、三氮烯咪唑类和肼类。
12.在本发明的第二方面，提供一种预测肿瘤细胞化疗药物敏感性的标志物，所述标志物为乙酰化修饰的msh2；
13.优选的，所述乙酰化修饰的位点为k882，将在k882位点乙酰化修饰的msh2，即所述标志物记为ac-msh2-k882。
14.在本发明的第三方面，提供一种预测肿瘤细胞化疗药物敏感性的特异性抗原多肽，所述抗原多肽的氨基酸序列为ylereqgek(ac)iiqefls；
15.所述抗原多肽的氨基酸序列为基本骨架，任意延长、缩短、氨基酸修饰、以及氨基酸突变都在本发明的保护范围之内。
16.在本发明的第四方面，提供一种预测肿瘤细胞化疗药物敏感性的特异性抗体ac-msh2-k882，所述抗体是由第三方面所述抗原多肽免疫动物制备得到的。
17.在本发明的第五方面，提供一种核酸，其由编码第三方面所述多肽抗体的碱基序列组成；
18.所述的碱基序列为基本骨架，任意延长、缩短、碱基修饰以及碱基突变都在本发明的保护范围之内。
19.在本发明的第六方面，提供一种第三方面所述特异性抗原多肽和/或第四方面所述的特异性抗体ac-msh2-k882在肿瘤细胞微卫星不稳定性检测中的应用；
20.或者第三方面所述特异性抗原多肽和/或第四方面所述的特异性抗体ac-msh2-k882在制备肿瘤细胞微卫星不稳定性检测试剂盒中的应用。
21.在本发明的第六方面，提供一种第三方面所述特异性抗原多肽和/或第四方面所述的特异性抗体ac-msh2-k882在肿瘤细胞化疗药物敏感性检测中的应用；
22.或者第三方面所述特异性抗原多肽和/或第四方面所述的特异性抗体ac-msh2-k882在制备肿瘤细胞化疗药物敏感性检测试剂盒中的应用。
23.本发明的具体实施方式具有以下有益效果：
24.对于肿瘤细胞对化疗药物的敏感性检测具有高灵敏度、高特异性，可实际应用于肿瘤细胞化疗药物敏感性检测；
25.将msh2-k882乙酰化修饰作为肿瘤细胞化疗药物敏感性检测指标，为肿瘤化疗药物的针对性选择提供可能性，为肿瘤精准治疗提供新思路。
附图说明
26.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示
意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
27.图1.msh2的乙酰化位点的鉴定及验证；图1a为质谱鉴定的msh2的乙酰化位点；图1b为msh2-k882位点去乙酰化形式(k882r)及模拟乙酰化形式(k882q)的蛋白稳定性。
28.图2.特异的ac-msh2-k882乙酰化抗体的制备及特异性验证；图2a为抗体特异性验证；图2b为ac-msh2-k882抗体指示msh2在化疗药物胁迫下的乙酰化变化。
29.图3.在化疗药物处理下ac-msh2-k882决定肿瘤细胞的微卫星稳定性以及药物敏感性；图3a为化疗药物处理下，msh2敲低并回复msh2-wt/k882r/k882q的肿瘤细胞中的微卫星稳定性；图3b为化疗药物处理下，msh2敲低并回复msh2-wt/k882r/k882q的肿瘤细胞的存活率。
具体实施方式
30.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本技术使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
31.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
32.本发明的目的在于提供一种高灵敏度、高特异性、可实际应用于肿瘤细胞化疗药物敏感性标志物及其应用，为实现这一目的，本发明的技术方案如下：
33.首先，通过乙酰化质谱鉴定出msh2的乙酰化位点k882，进一步，构建msh2-k882位点突变形式-去乙酰化形式(k882r)和模拟乙酰化形式(k882q)；通过蛋白质稳定性实验发现k882r稳定性减弱，而k882q稳定性增强。
34.然后，针对msh2-k882位点设计特异的乙酰化抗原ylereqgek(ac)iiqefls，根据该抗原制备特异的乙酰化抗体ac-msh2-k882，验证该抗体的特异性，并一进步验证化疗药物处理下，msh2-k882的乙酰化减弱。
35.最后，根据shrna设计原则设计、化学合成针对msh2的shrna，病毒包装，构建msh2敲低的稳转肿瘤细胞株，然后设计msh2-wt/882r/882q回复突变质粒，病毒包装，构建msh2回复突变的稳转肿瘤细胞株，然后对其进行化疗药物处理，检测微卫星不稳定性。将msh2-wt/882r/882q回复突变的稳转细胞株用化疗药物处理，观察细胞生长情况，mtt法检测细胞死亡的变化。结果证明，msh2-k882乙酰化维持微卫星稳定性，决定肿瘤对药物的敏感性。
36.下面结合实施例对本发明作进一步的解释和说明，但是不构成对本发明的限定。
37.实施例1
38.msh2的乙酰化位点的鉴定及验证：
39.将flag-msh2转染到293t细胞中，24小时以后收集细胞，用flag-m2-beads富集flag，用flag-peptide洗脱富集的flag-msh2，然后用考马斯亮蓝染色flag-msh2的条带，割下胶条去质谱鉴定msh2的乙酰化位点。
40.构建msh2-k882r/k882q的点突变，然后转染到293t细胞中，24小时后，处理50μm chx不同时间(1小时、2小时、4小时)，收集细胞，做western blot检测，用flag抗体检测
flag-msh2的蛋白水平，gfp抗体检测外源转染情况。
41.结果如图1所示，质谱鉴定出msh2的乙酰化位点是k882，msh2-k882位点的乙酰化决定msh2的蛋白稳定性。
42.实施例2
43.特异的ac-msh2-k882乙酰化抗体的制备、特异性及功能验证：
44.制备兔多抗ac-msh2-k882并纯化，用纯化的抗体验证特异性。将flag-msh2-wt及flag-msh2-k882r/845r/890r转染到293t细胞中，24小时以后收集细胞，用flag-m2-beads富集flag，用抗ac-msh2-k882抗体验证抗体特异性。
45.将flag-msh2转染到293t细胞中，20小时以后用etoposide(40μm)/mitomycin c(2μm)分别处理2小时、4小时，收集细胞，用flag-m2-beads富集flag，用抗ac-msh2-k882抗体检测msh2的乙酰化水平。
46.结果如图2所示，ac-msh2-k882抗体特异性非常好，在化疗药物处理下，msh2的乙酰化水平降低，表明msh2-k882是msh2在响应化疗药物刺激时关键的乙酰化位点。
47.实施例3
48.ac-msh2-k882标记肿瘤细胞微卫星稳定性及药物敏感性：
49.构建msh2敲低及回复突变稳转细胞株：msh2-c，msh2-si，msh2-si+wt，msh2-si+882r，msh2-si+882q，然后将这些稳转细胞株分别用etoposide(2μm)处理48小时，然后用多重pcr方法检测微卫星不稳定(msi)。
50.msh2敲低及回复突变稳转细胞株：msh2-c，msh2-si，msh2-si+wt，msh2-si+882r，msh2-si+882q，分别用etoposide(2μm)处理24小时、36小时，mtt法检测每组细胞株的存活率。
51.结果如图3所示，ac-msh2-k882标记微卫星稳定性，msh2-k882q增强对药物的敏感性。
52.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.乙酰化修饰的msh2作为肿瘤细胞化疗药物敏感性检测标志物中的应用。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述化疗药物包括：etoposide，mitomycin c及烷化剂，所述烷化剂包括氮芥类、乙撑亚胺类、磺酸酯及多元醇类、亚硝基脲类、三氮烯咪唑类和肼类。3.一种预测肿瘤细胞化疗药物敏感性的标志物，所述标志物为乙酰化修饰的msh2；优选的，msh2乙酰化修饰的位点为k882，即所述标志物为ac-msh2-k882。4.一种预测肿瘤细胞化疗药物敏感性的特异性抗原多肽，所述抗原多肽的氨基酸序列为ylereqgek(ac)iiqefls；优选的，所述抗原多肽还包括：将氨基酸序列为ylereqgek(ac)iiqefls的抗原多肽的氨基酸序列延长和/或缩短和/或修饰和/或突变得到的具有相同功能的多肽。5.一种预测肿瘤细胞化疗药物敏感性的特异性抗体ac-msh2-k882，所述抗体是由第三方面所述抗原多肽免疫动物制备得到的。6.一种核酸，其由编码权利要求3所述抗原多肽的碱基序列组成；优选的，所述的碱基序列还包括：编码权利要求3所述抗原多肽的碱基序列延长和/或缩短和/或碱基修饰和/或碱基突变得到的具有相同功能的碱基序列。7.权利要求4所述的抗原多肽或权利要求5所述的抗体ac-msh2-k882在肿瘤细胞微卫星不稳定性检测中的应用。8.权利要求4所述的抗原多肽或权利要求5所述的抗体ac-msh2-k882在制备肿瘤细胞微卫星不稳定性检测试剂盒中的应用。9.权利要求4所述的抗原多肽或权利要求5所述的抗体ac-msh2-k882在肿瘤细胞化疗药物敏感性检测中的应用。10.权利要求4所述的抗原多肽或权利要求5所述的抗体ac-msh2-k882在制备肿瘤细胞化疗药物敏感性检测试剂盒中的应用。

技术总结
本发明涉及肿瘤细胞药物敏感性检测技术领域，具体涉及一种肿瘤细胞化疗药物敏感性标志物及其应用。本发明制备了特异的MSH2-K882乙酰化抗体Ac-MSH2-K882，可特异性检测到接受化疗药物处理的肿瘤细胞中MSH2是否发生K882位的乙酰化，标志MSH2的稳定性，从而预见肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。本发明提供了乙酰化修饰的MSH2作为肿瘤细胞化疗药物敏感性检测标志物中的应用，对于肿瘤细胞对化疗药物的敏感性检测具有高灵敏度、高特异性，可实际应用于肿瘤细胞化疗药物敏感性检测；将MSH2-K882乙酰化修饰作为肿瘤细胞化疗药物敏感性检测指标，为肿瘤化疗药物的针对性选择提供可能性，为肿瘤精准治疗提供新思路。为肿瘤精准治疗提供新思路。为肿瘤精准治疗提供新思路。


技术研发人员：王传贵 孙莲慧 唐玉敏 孟玲 范广建 胡晨 潘波 张森
受保护的技术使用者：泰山科学技术研究院 山东第一医科大学第二附属医院
技术研发日：2020.11.23
技术公布日：2022/5/25